BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
……..….***…………

Trần Quốc Toàn

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, TỔNG HỢP, CHUYỂN HÓA VÀ
ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA HỢP CHẤT
MURRAYAFOLINE A TỪ LOÀI GLYCOSMIS
STENOCARPA (DRAKE) CỦA VIỆT NAM

Chuyên ngành: Hóa học các hợp chất thiên nhiên
Mã số: 62 44 01 17

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Hà Nội - 2017


Công trình đƣợc hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công
nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Nguyễn Mạnh Cường
2. TS. Trần Thị Thu Thủy
Phản biện 1:
Phản biện 2:
Phản biện 3:

số loài thuộc họ Rutaceae, đây một hợp chất có nhiều hoạt tính sinh
học quý báu đặc biệt là các hoạt tính kháng ung thư. Hiện nay trên
thế giới đã có nhiều nhóm nghiên cứu sâu hơn về hợp chất này. Tại
Việt Nam, nhóm nghiên cứu của PGS. TS. Nguyễn Mạnh Cường đã
phát hiện sự có mặt của hợp chất này ở loài cơm rượu trái hẹp
(Glycosmis stenocarpa thuộc họ Rutaceae) và đã phát hiện hợp chất
này có hoạt tính kháng ung thư và kích thích tim mạch rất tốt.
Chính vì vậy, trong luận án này chúng tôi tập trung nghiên
cứu thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phân lập, tổng hợp, chuyển hóa


và đánh giá tác dụng sinh học của hợp chất murrayafoline A từ
loài Glycosmis stenocarpa (Drake) của Việt Nam”.
2. Mục tiêu luận án:
Nghiên cứu phân lập từ rễ cây cơm rượu trái hẹp và tổng hợp
hợp chất murrayafoline A, tiến hành bào chế và chuyển hóa tạo dẫn
xuất, từ đó xác định các hoạt tính sinh học in vitro và in vivo của
murrayafoline A và các dẫn xuất.
3. Luận án đã thực hiện những nội dung nghiên cứu sau:
-

Nghiên cứu quy trình phân lập Murrayafoline A từ rễ cây
cơm rượu trái hẹp.

-

Nghiên cứu quy trình tổng hợp hợp chất murrayafoline A.

-


PHẦN 1 – TỔNG QUAN
Bao gồm hai chương, chương 1 là tổng quan về cây cơm
rượu trái hẹp: nguồn gốc thiên nhiên, hoạt tính sinh học & các dẫn
xuất của hợp chất murrayafoline A. Chương 2 là các phương pháp
tổng hợp carbazole được ứng dụng để tổng hợp murrayafoline A.
PHẦN 2 – PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC
NGHIỆM
Thực nghiệm & các kết quả được thực hiện và xác định tại
các phòng thí nghiệm thuộc các đơn vị: Viện Hóa học các hợp chất
thiên nhiên, Viện Hóa học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Vật Liệu
– Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; Khoa Dược –
Trường đại học Chungnam, Hàn Quốc; Đại học Aston Birmingham, Vương Quốc Anh.
2.1. Phân lập murrayafoline A từ rễ cây cơm rƣợu trái hẹp (G.
stenocarpa)
Bột rễ (10 kg) G. stenocarpa khô được ngâm chiết với
metanol ở nhiệt độ 400C (3 lần x 30 l) sử dụng khuấy, lọc và cô cất
trong chân không. Phần cặn metanol được hoà trong 3

lít

MeOH/H2O (tỉ lệ 1 : 1). Và chiết phân bố bằng dung môi n – hexan,
thu được cặn chiết tương ứng là các cặn hexan (254 g)
Phân lập theo phương pháp sắc ký: Cặn chiết n-hexan được tiến
hành sắc ký cột silica gel với hệ dung môi hexan/EtOAc. Thu lấy
phân đoạn giàu murrayafoline A rồi kết tinh lại trong hệ nhexan/EtOAc (50/1 : v/v), lọc rửa phần chất rắn thu được
murayafoline A với hiệu suất 0,2% so với nguyên liệu
Phân lập theo phương pháp cất cuốn hơi nước: cặn chiết n-hexan
được bổ sung nước và tiến hành sục hơi nước, được ngưng tụ và dẫn



DSPC/cholesterol/PEG 2000 được hòa tan trong hệ CM rồi loại bỏ
dung môi trong chân không. Lipid được hydrat hóa trong hệ đệm
PBS (pH 7,0) với tỉ lệ 2,25 mg/ml ở 55 độ C và được khuấy trộn nhẹ
nhàng. Các hạt liposome được tạo thành bằng cách siêu âm trong 1
phút, tiến hành 3 lần để thay đổi kích thước hạt.
2.5. Tổng hợp các dẫn xuất dãy 1,2,3 – triazole của
murrayafoline A.
Tổng hợp Tổng hợp 1-methoxy-3-methyl-9-(3-bromo)propyl-9H-carbazole) (7) và 1-methoxy-3-methyl-9-(propen-2-yl)9H-carbazole (104): Hòa tan murrayafoline A trong dung môi THF
khan, bổ sung NaH và 1,3-dibromopropane, khuấy hỗn hợp ở nhiệt
độ phòng trong dòng khí trơ trong 72h. Chiết hỗn hợp bằng CH2Cl2,
làm sạch sau đó đem cặn thu được tách bằng sắc ký trên cột silica gel
với hệ dung môi rửa giải n-hexane / EtOAc : 6/1 (v/v) để thu được
các sản phẩm.
Tổng

hợp

1-methoxy-3-methyl-9-(3-azido)-propyl-9H-

carbazole (105):Hỗn hợp dung dịch của hợp chất 1-methoxy-3methyl-9-(3-bromo)-propyl-9H-carbazole

trong

acetonitrile

và

sodium azide (0,75 g; 11,25 mmol) được đun hồi lưu trong 72 h cho
đến khi chất đầu phản ứng hết. Làm lạnh hỗn hợp bổ sung 50 ml
EtOAc, rửa hỗn hợp lần lượt bằng dung dịch Na2CO3 bão hòa (3 x 50

cầu đáy tròn dung tích 10 ml trong khí quyển trơ. Hỗn hợp được
khuấy qua đêm ở nhiệt độ phòng. Sau khi phản ứng kết thúc, bổ sung
dung dịch NH4OH (5ml) rồi chiết hỗn hợp bằng EtOAc (2 x 4 ml).
Pha hữu cơ được rửa bằng nước (5ml), làm khô bằng Na2SO4 và cô


cạn dưới áp suất giảm. Cặn chất rắn được tinh chế bằng sắc ký cột
silica gel với hệ dung môi rửa giải n-hexane / EtOAc, thu được các
hợp chất 1,2,3-triazole của murrayafoline A.
Tổng

hợp

3-(1-methoxy-3-methyl-9H-carbazol-9-

yl)propane-1,2-diol (107): Hỗn hợp các chất bao gồm 1-methoxy-3methyl-9-(propen-2-yl)-9H-carbazole (45 mg; 0,18 mmol) trong
THF/H2O (10/1; 1 mL); NMP (63 mg; 3 eq) và OsO4 (4 % trong
nước; 23 ml; 0,36 mmol) được cho vào bình cầu dung tích 10 ml.
Hỗn hợp được khuấy ở 30oC trong 2h, Sau khi phản ứng kết thúc, bổ
sung dung dịch NaHSO3 20%, sau đó chiết hỗn hợp bằng EtOAc.
Phần hữu cơ được rửa bằng nước muối bão hòa và làm khô bằng
Na2SO4 sau đó đuổi dung môi. Phần cặn còn lại được tinh chế trên
cột silica gel với hệ dung môi rửa giải là (CH2Cl2/MeOH : 9/1), thu
chất rắn màu trắng (36 mg, hiệu suất 70 %).
2.6. Tổng hợp các dẫn xuất chalcon của murrayafoline A:
Tổng hợp 1-methoxy-3-formylcarbazole (2): Hòa tan 422
mg (2 mmol) murrayafoline A bằng 55 ml CH3OH. Bình cầu được
bọc kín bằng giấy bạc để tránh ánh sang, khuấy đều rồi thêm 1,13 g
(2,5 eq.) DDQ. Hỗn hợp được khuấy 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Dung
dịch này được loại bỏ MeOH, hòa tan bằng CH2Cl2 và rửa với nước

Hoạt tính tim mạch: được đánh giá trên tế bào cơ tâm thất chuột,
xác định khả năng tăng tính co bóp và lưu lượng ion Ca2+ type L
(ICa,L) của murrayafoline A

Hoạt tính in vivo: Được tiến hành theo phương pháp của Abrham
(1978) và và theo Quyết định về việc ban hành “Quy chế đánh giá
tính an toàn và hiệu lực thuốc cổ truyền” của Bộ Y tế Việt Nam, số:
371/BYT-QĐ ngày 12 tháng 3 năm 1996.
-

Động vật thí nghiệm: Chuột nhắt trắng, có trọng lượng 18-22

g, 4-5 tuần tuổi.


PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nghiên cứu tạo nguồn nguyên liệu murrayafoline A
3.1.1. Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng murrayafoline A bằng
HPLC.
Đường chuẩn có R2 = 0,9995, hệ dung môi CH3CN/H2O
(60:40, v/v); cột: Gemini 5u C-18 100A; 250 x 4.6 mm 5 µm;
detector : UV/VIS-151 GILSON; Thời gian chạy: 25 phút/mẫu; Thể
tích bơm: 20 μl. Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng
murrayafoline A chiếm hàm lượng 0,38% ± 0,003 trong rễ cây cơm
rượu tính theo trọng lượng khô
3.1.1. Phân lập từ rễ cây cơm rƣợu trái hẹp
Murrayafoline A được phân lập theo hai phương pháp: sắc
ký và cất cuốn hơi nước. Kết quả cho thấy phương pháp cất cuốn hơi
nước cho hiệu suất cao hơn phương pháp sắc ký (75% & 52,6% so
với tổng lượng murrayafoline A có trong mẫu rễ khô)


Ảnh FE-SEM, phân bố kích thước và thế zeta của hệ liposome
chứa Mu- A.
Liposome: Trong cấu trúc liposome tạo thành, các phân tử
murrayafoline A có tính chất không phân cực (tan tốt trong pha dầu)
nên sẽ nằm giữa lớp lipid kép. Kích thước của liposome - Mu-A là từ
91,6 đến 144,3 nm, như vậy kích thước trung bình của hạt bằng
117,0 nm. Chỉ số polydispersity (PDI) là 0,299 ± 0,054, trong đó chỉ
ra rằng các liposome có phân bố kích thước đồng nhất. Liposome
bọc Mu-A đạt được sự ổn định với thế Zeta trong khoảng -33,2 ±
2,37 mV


3.3. Chuyển hóa tạo dẫn xuất 1,2,3-triazole của murrayafoline A
Các bước tạo dãy chuyển hóa chứa nhóm 1,2,3-triazole của
murrayafoline A:

Các sản phẩm tạo thành được xác định cấu trúc bằng các dữ kiện phổ
cộng hưởng từ hạt nhân và phổ khối lượng
7 HRMS (m/z): 331,0572
H-NMR (CDCl3, 500 MHz) H (ppm): 7,99 (d, J = 7,5 Hz, H-5);

1

7,48 (s, H-4); 7,43 (m, H-6 & H-7); 7,18 (dd, J = 7,5 và 1,5 Hz, H-8);
6,73 (s, H-2); 4,69 ( t, J = 6,5 Hz, 10-CH2); 3,95 (s, OCH3); 3,37 ( t,


J = 6,5 Hz, 12-CH2); 2,50 (s, CH3); 2,39 ( quin., J = 6,5 Hz, 11CH2).
104 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δH 8,01 (d, J = 7,5 Hz, H-5); 7,49


HRMS (m/z): 350,1743
H-NMR (500 MHz, CD3OD) δH (ppm): 8,00 (d, J = 7,5 Hz, H-

1

5); 7,47 (s, H-4); 7,39 (t, J = 7,5 Hz, H-7); 7,31 (s, H-5’); 7,23 (d, J =
7,5 Hz, H-6); 7,17 (t, J = 7,5 Hz, H-8); 6,72 (s, H-2); 4,73 (s, 6’CH2); 4,65 (t, J = 7,0 Hz, 12-CH2); 4,28 (t, J = 7,0 Hz, 10-CH2); 3,90
(s, OCH3); 2,53 (br, 1H); 2,50 (s, CH3); 2,46 (quin., J = 7,0 Hz, 11CH2).
106f CTPT: C25H22F2N4O (hiệu suất 94%).
HRMS (m/z): 432,167
H-NMR (500 MHz, CD3OD) δH (ppm): 8,00 (d, J = 7,5 Hz, H-

1

5); 7,47 (s, H-4); 7,42 (t, J = 7,5 Hz, H-5’); 7,40 (t, J =7,5 Hz, H7)7,27 (m, H-6, H7’&H-11’); 7,19 (t, J = 7.5 Hz, H-8); 6,76 (m, H9’); 6,72 (s, H-2); 4,73 (t, J = 7,0 Hz, 12-CH2); 4,33 (t, J = 7,0 Hz,
10-CH2); 3,89 (s, OCH3); 2,56 (quin., J = 7,0 Hz, 11-CH2); 2,50 (s,
CH3)
106g CTPT: C26H23F3N4O
HRMS (m/z): 464,182
H-NMR (500 MHz, CD3OD) δH (ppm): 8,00 (d, J = 8,0 Hz, H-

1

5); 7,98 (s, H-7’); 7,95 (d, J = 7,5 Hz, H-9’); 7,57 (d, J = 7,5 Hz, H11’); 7,50 (m, H-10’); 7,46 (s, H-4); 7,40 (t, J = 8,0 Hz, H-7); 7,28
(s, H-5’); 7,25 (d, J = 8,0 Hz, H-6); 7,19 (t, J = 8,0 Hz, H-8); 6,72 (s,
H-2); 4,73 (t, J = 7,0 Hz, 12-CH2); 4,34 (t, J = 7,0 Hz, 10-CH2); 3,89
(s, OCH3); 2,56 (quin., J = 7,0 Hz, 11-CH2); 2,49 (s, CH3).
106h CTPT: C30H32F2N6O
HRMS (m/z): 546,292

8,5Hz, 1H), 8,30 (s, 1H), 8,15 (d, J = 8,0 Hz, 1H ), 8,10 (d, J = 15,5
Hz, 1H), 8,06 (d, J = 15,0 Hz, 1H), 7,63 (s, 1H), 7,59 (t, J = 8,5Hz,
1H), 7,53 (d, J = 8,0Hz, 1H), 7,42 (t, J = 7,5Hz, 1H), 7,23 (t, J =
7,5Hz, 1H), 7,05 (t, J = 7,5Hz, 1H), 7,01 (d, J = 8,5Hz, 1H'), (s, 3H)
109b: 1H-NMR (500 MHz, MeOD, ppm)

H

: 8,21 (s, 1H),

8,13 (m, 3H), 7,94 (d, J = 15,5 Hz, H-β), 7,90 (d, J = 15,0 Hz, H-α),
7,57 (s, H-2), 7,52 (d, J = 8,0 Hz, H-8), 7,41 (t, J = 7,5 Hz, H-7),
7,21 (t, J = 7,5 Hz, H-6), 6,94 (d, J = 8,5 Hz, H-3', H-5'). (s, 1-OCH3)
109c: 1H-NMR (500 MHz, MeOD, ppm)

H

: 8.32 (s, H-6'),

8.21 (s, H-4), 8.16 (d, J = 8.0 Hz, H-5 ), 8.09 (d, J = 5.5 Hz, H-β),
8.01 (d, J = 15.0 Hz, H-α), 7.59 (s, H-2), 7.54 (m, H-8, H-4'), 7.01
(d, J = 8.5 Hz, H-3'), 4.44 (s, 2H, 5ꞌ-CH2-), 4.12 (s, 1-OCH3), 3.32 (s,
5ꞌ-CH2-OCH3)
109d: 1H-NMR (500 MHz, MeOD, ppm)

H

: 8.11 (d, 1H, J

= 7.0 Hz, H-5 ), 8.10 (s, H-4), 7.79 (d, J = 16.5 Hz, H- β), 7.51 (d, J

0,68
0,64
3,97
Elipticine
0,89
0,72
0,70
0,66
0,97
Giá trị IC50 của mu-A với các dòng tế bào ung thư
3.4.2. Hoạt tính ức chế sự phát triển khối u trên thạch mềm 3D
Murayafoline A ức chế hình thành khối u trên thạch mềm in
vitro với mật độ hình thành khối u giảm 48,21% so với đối chứng và
làm giảm kích thước của khối u tới 71,33% so với đối chứng.

3.4.3. Hoạt tính trên hệ tinh mạch

Vai trò trung gian của murrayafoline A đối với sự hoạt động và tốc
độ co của tế bào cơ tim khi có mặt chất ức chế.
Murrayafoline A làm tăng sự co cơ và ICa,L qua hoạt tính
PKC ( protein kinase C) ở các tế bào cơ tâm thất chuột và sự đáp ứng
trung gian bởi PKC khi có mặt murrayafoline A có thể một phần là
do yếu tố trung gian của CaMKII. Tác dụng gây co tế bào cơ của


murrayafoline A không bị ảnh hưởng ngay cả khi có mặt chất trung
hòa β-adierenoceptor (propanolol), chất ức chế protein kinase A
(KT5720 hoặc H-89), hoặc chất ức chế phospholipase C (U73122).
3.5. Kết luận về các kết quả thử nghiệm khả năng kháng u ung thư
in vivo

19,94

Mu-A tự do
3,97

Elipticine
0,97

Giá trị IC50 của Mu-A tự do và mixen với dòng tế bào Hep-G2
3.6.2. Hoạt tính của hệ liposome-murrayafoline A
* Hoạt tính gây độc tế bào in vitro
Murrayafoline A dạng tự do và dạng liposome đều thể hiện
hoạt tính gây độc tế bào trên cả hai dòng tế bào ung thư sắc tố SKMEL-2 và ugn thư phổi SK-LU-1
IC50 của Mu-A dạng liposome và dạng tự do đối với các dòng
tế bào SK-MEL-2 và SK-LU-1
Mẫu thử
IC50 values (µM)
SK-MEL-2
SK-LU-1
Liposome – Mu-A
9.69 ± 0.25
12.79±0.12
Mu-A
8.92± 0.16
10.67 ± 0.37
Ellipticine
(chứng
1.93 ± 0.14
2.49 ± 0.17
dương)


10

15

20

25

30

day

Sự tăng trưởng khối u sau khi điều trị với Mu-A tự do và Mu-A
liposome.
3.7. Hoạt tính sinh học các hợp chất dãy chuyển hóa tạo dẫn xuất
triazole của murrayafoline A.
3.7.1. Hoạt tính gây độc tế bào
Chất
7
105
106a
IC50
15,82
18,93
15,16

106b
10,07



108b
82,46
94,22

108c
100
63,02

108d
12,26
24,22

108e
81,89
100

Giá trị %CS đối với các dòng tế bào Hep-G2 và LU-1
Hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn xuất dãy chalcon giảm so với
murrayafoline A. Điều này phù hợp với nhận định của Itoigawa và
cộng sự rằng nhóm metyl ở vị trí cacbon số 3 là rất quan trọng để
tăng hoạt tính chống ung thư đối với các hợp chất carbazole.


KẾT LUẬN
Trong luận án này chúng tôi đã đạt được các kết quả sau:
1. Kết quả nghiên cứu tạo nguồn murrayafoline A làm nguyên liệu
phục vụ các nghiên cứu hóa học và sinh học
* Từ thiên nhiên, chúng tôi đã nghiên cứu xây dựng hai quy trình
phân lập murrayafoline A từ rễ cây cơm rượu trái hẹp (Glycosmis

- Murrayafoline A có khả năng kháng khối u di căn và kéo dài tuổi
thọ cho chuột bị u thực nghiệm.
- Murrayafoline A cho thấy khả năng cảm ứng và tăng cường hoạt
động của enzyme casapse 3/7 rất mạnh khi khảo sát trong các mẫu
huyết thanh của chuột thí nghiệm.
5. Đã tiến hành nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các
dạng tiểu phân mixen & liposome của murrayafoline A. Kết quả cho
thấy:
- Các dạng tiểu phân phức hợp của murrayafoline A đều giữ được
hoạt tính gây độc tế bào ung thư.
- Dạng tiểu phân liposome-murrayafoline A tăng cường đáng kể hoạt
động kháng u và giảm độc tính hơn so với murrayafoline A tự do.
6. Đã tiến hành nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào và kháng viêm in
vitro của các dẫn xuất murrayafoline A. Các kết quả cho thấy:
- Các dẫn xuất chuyển hóa đều giảm hoạt tính gây độc tế bào so với
murrayafoline A
- Các dẫn xuất chuyển hóa 1,2,3-triazole có hoạt tính kháng viêm tốt
hơn so với murrayafoline A, trong đó hợp chất 106c thể hiện hoạt
tính kháng viêm tốt nhất, ức chế lần lượt 100%, 88,7% và 79,3% sự
sản xuất IL-12p40, IL-6 và TNF-α ở nồng độ 12,5 µM