ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-------------------------

KIỀU THỊ HÒA

NGHIÊN CỨU SỰ ỨC CHẾ PHÁT QUANG CỦA
VI KHUẨN Vibrio fischeri NHẰM PHÁT HIỆN ĐỘC TÍNH
CỦA NƯỚC SINH HOẠT NHIỄM MỘT SỐ
KIM LOẠI NẶNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI - 2016




MỤC LỤC
MỤC LỤC .................................................................................................................. ii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT................................................................................. vi
DANH MỤC HÌNH ................................................................................................. vii
DANH MỤC BẢNG BIỂU ...................................................................................... ix
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................4
1.1. Tổng quan về ô nhiễm kim loại nặng nguồn nƣớc sinh hoạt ở Việt Nam .......4
1.1.1. Các khái niệm liên quan ............................................................................4
1.1.2. Kim loại nặng và ảnh hưởng của chúng đến con người ...........................4
1.1.2.1. Cadimi (Cd) ........................................................................................4
1.1.2.2. Đồng (Cu)...........................................................................................5
1.1.2.3. Các kim loại khác ...............................................................................7

hoạt ....................................................................................................................27
2.3.1.1. Phƣơng pháp lấy mẫu nƣớc..............................................................27
2.3.1.2. Phƣơng pháp phân tích và đánh giá chất lƣợng nƣớc ......................27
2.3.2. Phương pháp, kĩ thuật vi sinh .................................................................28
2.3.2.1. Kĩ thuật phân lập và sàng lọc vi khuẩn ............................................28
2.3.2.2. Các kĩ thuật cấy vi sinh ....................................................................29
2.3.2.3. Kĩ thuật chụp huỳnh quang và nhuộm Gram ...................................29
2.3.2.4. Kĩ thuật sinh học phân tử .................................................................29
iii


2.3.2.5. Phƣơng pháp nuôi cấy trên môi trƣờng lỏng ...................................32
2.3.2.6. Phƣơng pháp xác định tốc độ sinh trƣởng .......................................33
2.3.2.7. Phƣơng pháp xác định cƣờng độ phát quang ...................................33
2.3.2.8. Phƣơng pháp xác định mật độ tế bào ...............................................33
2.3.2.9. Phƣơng pháp xác định ảnh hƣởng của mật độ tế bào vi khuẩn tới
cƣờng độ phát quang .....................................................................................34
2.3.3. Phương pháp xác định độc tính kim loại nặng .......................................34
2.3.3.1. Xác định ảnh hƣởng của nồng độ kim loại đến cƣờng độ phát quang
.......................................................................................................................34
2.3.3.2. Xác định ảnh hƣởng hỗn hợp kim loại tới cƣờng độ phát quang ....35
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................................36
3.1. Kết quả chất lƣợng nƣớc sinh hoạt

tại một số đơn vị quân đội ..................36

3.2. Phân lập và xác định đặc điểm sinh học của chủng Vibrio fischeri ...............37
3.2.1. Kết quả phân lập và sàng lọc vi khuẩn từ nước đầm tôm .......................37
3.2.2. Hình thái, cấu trúc vi khuẩn Vf3 .............................................................38
3.2.3. Nhận dạng vi khuẩn bằng đọc trình tự đoạn gen mã hóa cho ARNr 16S

2. Tài liệu Tiếng Anh ............................................................................................58

v


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Viết đầy đủ

QCVN

Quy chuẩn Việt Nam

TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam

TCCP

Tiêu chuẩn cho phép

BTNMT

Bộ Tài nguyên và Môi trƣờng

BYT

Bộ Y tế


khối phổ plasma cảm ứng

vi


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Bệnh itai - itai và cấu trúc xương ...............................................................5
Hình 1. 2: Hàm lượng sắt trong nước giếng khoan, giếng đào ở nông thôn ..........12
Hình 1. 3: Cấu trúc tế bào vi khuẩn Vibrio fischeri ................................................20
Hình 1. 4: Trình tự gen 16S rARN của Vibrio fischeri tại ngân hàng gen ..............20
Hình 1. 5: Vùng gen qui định khả năng phát quang của Vibrio fischeri .................21
Hình 1. 6: Cơ chế điều hòa phát quang sinh học của Vibrio fischei .......................22
Hình 1. 7: Cơ chế tác động đến khả năng phát quang của Vibrio fischeri gây ra bởi
hai độc chất ..............................................................................................................23
Hình 2. 1: Máy Delta Tox II ……………………………………………..………..26
Hình 2. 2: Máy ICP - MS ………………………………………………………....26
Hình 2. 3: Chu trình nhiệt trong kĩ thuật PCR gen 16S rARN……………..…..…31
Hình 3. 1: Phân lập và cấy zic zac vi khuẩn trong môi trường Photobacterium ......38
Hình 3. 2: Ảnh chụp huỳnh quang Vf3 ......................................................................39
Hình 3. 3: Ảnh nhuộm Gram Vf3 ..............................................................................39
Hình 3. 4: Điện di kiểm tra trên gel agarose 1% của ADN tổng số .........................40
Hình 3. 5: Điện di kiểm tra trên gel agarose 1% đối với sản phẩm PCR đoạn gen
16S rARN của chủng vi khuẩn nghiên cứu................................................................41
Hình 3.6: So sánh trình tự đoạn gen 16S rARN của Vf3 với trình tự đoạn gen 16S
rARN của Vibrio fischeri ...........................................................................................42
Hình 3. 7: Đồ thị tương quan giữa tốc độ sinh trưởng (thể hiện qua giá trị OD600,
đơn vị A) và cường độ phát quang (thể hiện qua giá trị photon light, đơn vị RLU)
của Vibrio sp. Vf3 trong Photobacterium và MT K 2% ............................................43

vii

ix


MỞ ĐẦU
Hiện nay ở nƣớc ta, hiện trạng ô nhiễm kim loại nặng trong nƣớc sinh hoạt
ngày một phổ biến và diễn biến theo chiều hƣớng phức tạp. Hiện trạng này đƣợc
phản ánh thông qua hàm lƣợng các kim loại nặng nhƣ đồng, chì, cadimi, asen,…
trong nƣớc của các sông, suối, ao, hồ,… nơi cấp nƣớc dùng cho sinh hoạt cao hơn
tiêu chuẩn cho phép nhiều lần. Bên cạnh đó, ô nhiễm kim loại nặng trong nƣớc sinh
hoạt gây hại cho sinh vật và ảnh hƣởng nghiêm trọng tới sức khỏe con ngƣời.
Tính đến nay, có hai nhóm phƣơng pháp cơ bản phát hiện độc chất kim loại,
đó là phƣơng pháp truyền thống và phƣơng pháp hiện đại. Phƣơng pháp truyền
thống đã sử dụng cá, bo bo (McFetters, 1983; Wang, 1991), tảo, Daphnia magna,…
để xác định độc tính đơn kim loại. Phƣơng pháp này đơn giản, dễ thực hiện và
không tốn kém. Tuy nhiên kết quả thu đƣợc từ phƣơng pháp chƣa định tính, định
lƣợng từng kim loại cụ thể. Bên cạnh đó, các phƣơng pháp hiện đại nhƣ quang phổ
hấp thụ nguyên tử (AAS), khối phổ plasma cảm ứng (ICP - MS),... đã phân tích
chính xác đƣợc từng kim loại cụ thể với độ nhạy cao nhƣng đòi hỏi máy móc, trang
thiết bị hiện đại và chƣa áp dụng ngoài điều kiện phòng thí nghiệm. Để khắc phục
đƣợc hạn chế đó, trên thế giới đã sử dụng vi khuẩn Vibrio fischeri dƣới dạng test,
kit (để đánh giá độc tính của nƣớc) ở ngoài phòng thí nghiệm (nhờ vào khả năng
phát quang của vi khuẩn).
Trên thế giới, các nhà khoa học Mỹ đã chế tạo thành công bộ thuốc thử
Microtox, có thành phần chính là Vibrio fischeri dạng đông khô. Tuy nhiên, bộ
thuốc thử cần đƣợc bảo quản ở nhiệt độ thấp (-15 oC đến -25oC), vì thế ở ngoài hiện
trƣờng, việc bảo quản gặp nhiều khó khăn. Ở Việt Nam, việc sử dụng vi khuẩn
đƣợc tiêu chuẩn hóa trong TCVN 6831:2010 và đƣợc đề cập trong nhiều nghiên
cứu. Trong đó, Đỗ Thị Lan Chi năm 2006, đã xác định đƣợc độc tính đơn kim loại
nặng trong bùn thải công nghiệp bằng bộ thuốc thử Microtox. Tuy nhiên, ở nƣớc ta
hiện nay các nghiên cứu đánh giá độc tính trong nƣớc qua bộ thuốc thử chỉ áp dụng

Vibrio fischeri
Địa điểm nghiên cứu
Phòng Công nghệ Hóa sinh - Viện Công nghệ mới/Viện Khoa học và Công
nghệ quân sự.

2


Đóng góp mới của đề tài
Phân lập và tạo thành công nguồn vi khuẩn Vibrio fischeri từ nƣớc đầm tôm.
Đồng thời, xác định đƣợc ảnh hƣởng của Cd2+ và Cu2+ đến khả năng phát quang của
Vibrio fischeri.
Ứng dụng thực tiễn của đề tài
Các kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở giúp chế tạo kit phát hiện nhanh
độc tính của nƣớc sinh hoạt. Trong đó, kit phát hiện sử dụng một kim loại là chất
chuẩn có ngƣỡng độc tính ổn định ở mức trung bình và đƣợc nghiên cứu phổ biến.
Nồng độ gây suy giảm 50% khả năng phát quang của vi khuẩn (hay giá trị EC50)
của chất chuẩn đƣợc sử dụng làm giá trị tiêu chuẩn để đánh giá độc tính với các
mẫu nƣớc sinh hoạt.

3


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về ô nhiễm kim loại nặng nguồn nƣớc sinh hoạt ở Việt Nam
1.1.1. Các khái niệm liên quan
Kim loại nặng là những kim loại có khối lƣợng riêng lớn hơn 5g/cm3 [2].
Một số kim loại nặng (nhƣ sắt, selen, molypden, đồng, mangan, coban, bo,
stronti,… [34]) ở hàm lƣợng nhất định là nguyên tố vi lƣợng cần thiết cho cơ thể
sống. Tuy nhiên, khi hàm lƣợng vƣợt quá giới hạn cho phép thì chúng sẽ gây độc

nhiễm độc cadimi có thể bị thủng vách ngăn mũi, bị tổn thƣơng thận dẫn đến
protein niệu, bị ảnh hƣởng tới máu, tim mạch, nội tiết,... và có nguy cơ bị ung thƣ
phổi [25]. Đặc biệt, khi phơi nhiễm cadimi trong thời gian dài, con ngƣời có thể bị
bệnh itai - itai (gây những cơn đau đớn vô cùng trong xƣơng sống và thận). Theo
nghiên cứu của Dokmecia và cộng sự năm 2009 [25] chứng minh bệnh lý này là do
hiện tƣợng mất khoáng chất cao, gây ảnh hƣởng nghiêm trọng tới hệ xƣơng. Hình
1.1 minh họa cho bệnh itai - itai bắt nguồn từ thƣợng lƣu sông Jinzu tại Nhật Bản.

Hình 1.1: Bệnh itai - itai và cấu trúc xương [25]
Cadimi (Cd) thâm nhập vào cơ thể bằng nhiều con đƣờng khác nhau (qua tiếp
xúc, tiêu hóa,…). Chúng đƣợc bài tiết một phần nhờ thận và phần còn lại cũng đƣợc
tích lũy tại đây trong thời gian dài (thời gian bán huỷ kéo dài 20 - 30 năm [10]).
Tổ chức y tế Thế giới (WHO) khuyến cáo lƣợng cadimi tối đa đƣa vào cơ thể
hàng tuần có thể chịu đựng đƣợc là 0,007 mg/kg trọng lƣợng.
1.1.2.2. Đồng (Cu)
Đồng là kim loại màu chuyển tiếp có số hiệu nguyên tử 29, nguyên tử khối
63,54. Trong thạch quyển, đồng tồn tại ở hai dạng đơn chất (đồng kim loại) và hợp
chất (quặng pirit đồng (CuFeS2), quặng malachit [CuCO3. Cu(OH)2],… ) [11].

5


Hiện nay, đồng phát thải vào môi trƣờng chủ yếu qua các hoạt động của con
ngƣời. Môi trƣờng không khí tiếp nhận đồng dƣới dạng bụi hạt từ các hoạt động sản
xuất công nghiệp và nông nghiệp nhƣ: khai thác và chế biến quặng, tái chế và sản
xuất mĩ nghệ, sản xuất và sử dụng thuốc bảo vệ thực vật,… Môi trƣờng nƣớc tiếp
nhận đồng từ các hoạt động sản xuất nông nghiệp, công nghiệp và đời sống sinh
hoạt của con ngƣời. Môi trƣờng nƣớc tại các vùng cửa sông đƣợc tích tụ bởi lƣợng
lớn đồng sunfat (có khi lên đến 50 - 100 µg/l) bắt nguồn từ các chế phẩm diệt tảo
mà con ngƣời sử dụng. Thông thƣờng, hàm lƣợng đồng trong nƣớc cấp sinh hoạt

tồn tại trong môi trƣờng giàu ôxi và asenat có hóa trị (III) tồn tại trong môi trƣờng
nghèo ôxi. Ngoài ra, asen cũng tồn tại dƣới dạng hợp chất hữu cơ nhƣ: axit
dimetylasenic (DMAA), axit metylasonic (MMAA),…
Asen đƣợc phát thải vào môi trƣờng thông qua các hoạt động tự nhiên (nhƣ các
hoạt động của núi lửa, sự xói mòn của các loại đá, cháy rừng,…) và các hoạt động
nhân tạo (nhƣ sản xuất công nghiệp và nông nghiệp).
Độc tính của các hợp chất asen với sinh vật dƣới nƣớc đƣợc xác định tăng theo
dãy: asin> asenic > asenat > hợp chất asen hữu cơ. Asen và các hợp chất của nó
đƣợc IARC xếp vào nhóm 1 (các chất có nguy cơ rất cao gây ung thƣ). Nghiên cứu
của Sabine Martin và cộng sự [59] cho rằng con ngƣời phơi nhiễm asen ở mức độ
thấp có thể bị buồn nôn, ói mửa, nhịp tim bất thƣờng, tổn thƣơng mạch máu và có
cảm giác "kim châm" ở tay chân; phơi nhiễm ở mức độ thấp nhƣng kéo dài có thể
xuất hiện các chấm đen, mụn cóc ở da, trong lòng bàn tay, bàn chân thậm chí khắp
cơ thể và phơi nhiễm asenic có thể gây ung thƣ da, phổi, gan và bàng quang. Asen
có ba cơ chế gây độc chính là: làm đông keo protein, tạo phức với asen (III) và phá
hủy quá trình photpho hóa.
Tổ chức y tế thế giới (WHO) đã khuyến cáo lƣợng asenic vô cơ đƣa vào cơ thể
hàng tuần (PTWI) chịu đựng đƣợc dƣới 0,015 mg/kg trọng lƣợng [38].

7


Thủy ngân (Hg)
Trong tự nhiên, thủy ngân tồn tại ở hai dạng hợp chất vô cơ và hữu cơ. Trong
đó, hóa trị I và II là hai dạng hóa trị thƣờng gặp nhất của chúng.
Ở ngƣời bị phơi nhiễm thủy ngân, thần kinh trung ƣơng và thận là những cơ
quan đích chính bị tác động. Tùy theo mức độ nhiễm độc thủy ngân mà ngƣời bệnh
có các triệu chứng nhƣ dễ bị kích thích, cáu gắt đồng thời kèm theo biểu hiện về rối
loạn tiêu hóa, viêm lợi và có thể dẫn tới tử vong. Ủy ban chuyên gia về Phụ gia
Thực phẩm (JECFA) khuyến cáo về lƣợng tiếp nhận hàng tuần mà cơ thể có thể

Trong môi trƣờng crom có hai dạng hóa trị thƣờng gặp là crom (III) và crom
(VI). Crom xâm nhập vào cơ thể ngƣời chủ yếu qua đƣờng tiêu hóa từ nguồn thực
phẩm tiếp nhận hàng ngày. Sự hấp thụ crom trong cơ thể phụ thuộc vào trạng thái
oxy hóa trị của hợp chất đó, ví dụ nhƣ: crom (VI) đƣợc hấp thu ở dạ dày và ruột
nhiều hơn crom (III).
Các hợp chất crom (VI) có thể gây viêm loét da, xuất hiện mụn cơm, viêm gan,
viêm thận, thủng vách ngăn giữa hai lá mía, ung thƣ phổi,… Lƣợng tiếp nhận tối đa
hàng ngày cơ thể trƣởng thành có thể chịu đựng đƣợc là 25 mg/ngày (đối với phụ
nữ) và 35 mg/ngày (đối với đàn ông) [38].
Kẽm (Zn)
Kẽm là nguyên tố vi lƣợng cần thiết giúp nâng cao sức đề kháng ở ngƣời. Tuy
nhiên, khi vƣợt ngƣỡng cho phép thì các muối của chúng đều trở nên độc. Ngƣời
ngộ độc kẽm thƣờng có các triệu chứng sau: cảm thấy miệng có vị kim loại sau đó
bị đau bụng, mạch chậm, co giật và có thể bị tử vong. Sử dụng ống dẫn nƣớc bằng
kẽm sẽ làm gia tăng hàm lƣợng nguyên tố này trong nƣớc uống. Theo JECFA lƣợng
kẽm tiếp nhận tối đa hàng ngày cơ thể chịu đựng đƣợc là 1 mg/kg thể trọng.
1.1.3. Hiện trạng ô nhiễm kim loại nặng nguồn nước sinh hoạt ở Việt Nam
Hiện nay ở nƣớc ta nƣớc mặt và nƣớc ngầm là hai nguồn nƣớc chính cung
cấp cho nhu cầu sinh hoạt của ngƣời dân nông thôn, miền núi hoặc đƣợc sử dụng
bởi con ngƣời trong các hoạt động dã ngoại.
1.1.3.1. Ô nhiễm kim loại nặng trong nước mặt
Ở nƣớc ta, nguồn nƣớc mặt dùng trong sinh hoạt đang có nguy cơ bị ô nhiễm
bao gồm cả ô nhiễm kim loại nặng. Nguồn nƣớc bị ô nhiễm là do tiếp nhận nƣớc
thải từ các hoạt động sản xuất, tái chế và các loại hình kinh doanh dịch vụ cũng nhƣ

9