ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƢỢC
ĐẶNG THỊ NGẦN
NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH LƢỢNG
CRYPTOTANSHINON TỪ CÂY ĐAN SÂM (Salvia miltiorrhiza
Bunge.) PHỤC VỤ CÔNG TÁC ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG
DƢỢC LIỆU ĐAN SÂM
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC
Hà Nội – 2017
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƢỢC
ĐẶNG THỊ NGẦN
NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH LƢỢNG
CRYPTOTANSHINON TỪ CÂY ĐAN SÂM (Salvia miltiorrhiza
Bunge.) PHỤC VỤ CÔNG TÁC ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG
DƢỢC LIỆU ĐAN SÂM
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC
Khóa : QH.2012.Y
Ngƣời hƣớng dẫn : TS. NGUYỄN HỮU TÙNG
Hà Nội – 2017
Carbon (13) Nuclear magnetic resonance
Khối phổ - ion hóa phun mù electron
(Electron Spray Ionisation – Mass Spectrometry)
EtOAc
Ethyl acetat
EtOH
Ethanol
1
Proton nuclear magnetic resonance
H-NMR
HPLC
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
(High Performance Liquid Chromatography)
IR
Phổ hồng ngoại (Infrared spectrum)
MeOH
UV
Tử ngoại (Ultraviolet)
DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình
Tên hình
Trang
Hình 1.1
Cấu trúc một số abietane diterpenoid
3
Hình 1.2
Cấu trúc một số acid phenolic
4
Hình 1.3
Cấu trúc một số triterpenoid có trong chi Salvia L.
5
Hình 3.3
Sắc ký đồ của cryptotanshinon và mẫu trắng
31
Hình 3.4
Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ & diện tích của pic
cryptotanshinon
35
DANH MỤC CÁC BẢNG
Tên bảng
Bảng
Trang
Bảng 3.1 Kết quả đo phổ NMR của cryptotanshinon phân lập được
28
Bảng 3.2 Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy của cryptotanshinon tinh chế được
29
Bảng 3.3 Kết quả phân tích độ tinh khiết của cryptotanshinon tinh chế được
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU
CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN…………………………………………………….........2
1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐAN SÂM ........................................................................................... 2
1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố ................................................................................ 2
1.1.2. Thành phần hóa học của cây đan sâm .................................................................... 2
1.1.3. Tác dụng sinh học của cây đan sâm ....................................................................... 5
1.1.4. Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền ........................................................ 6
1.2. TỔNG QUAN VỀ CRYPTOTANSHINON .................................................................... 8
1.3. TỔNG QUAN MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP TRONG NGHIÊN CỨU .......................... 9
1.3.1. Phương pháp sắc ký ............................................................................................... 9
1.3.2. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)............................................. 12
1.3.3. Phương pháp phân tích khối phổ (MS) ................................................................ 13
1.3.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC ................................................... 14
1.3.5. Phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy .................................................................... 18
CHƢƠNG 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................. 19
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU ................................................. 19
2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu ....................................................................................... 19
2.1.2. Dung môi, hóa chất .............................................................................................. 19
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu ......................................................... 20
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................................................... 20
2.2.1. Nghiên cứu thành phần hóa học ........................................................................... 20
2.2.2. Xây dựng phương pháp HPLC ............................................................................. 21
2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu .................................................................................... 22
CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN........................................................................ 24
Ở Việt Nam, nghiên cứu về đan sâm đang được quan tâm để phát triển ứng dụng
dược liệu quý này. Các kết quả nghiên cứu về hóa thực vật cho thấy đan sâm có các
thành phần tanshinon bao gồm dihydrotanshinon I, tanshinonate methyl ester,
trijuganon B, cryptotanshinon, tanshinon IIA và tanshinon I… Trong đó,
cryptotanshinon (1,2,6,7,8,9-hexahydro-1,6,6-trimethyl- (R) -phenanthro (1,2-b) furan10,11-dion) là một trong các thành phần tanshinon chính của đan sâm [25].
Cryptotanshinon màu nâu, không hòa tan trong nước nhưng tan trong một số dung môi
hữu cơ; có nhiều hoạt tính sinh học và dược lý như kháng khuẩn, chống oxy hóa,
chống viêm, chống ung thư,... [3].
Trên cơ sở kế thừa các nghiên cứu đan sâm đã được công bố trong nước và quốc
tế, với mục tiêu xây dựng cơ sở khoa học về thành phần hoạt chất dược liệu đan sâm,
đề tài “Nghiên cứu phân lập và định lƣợng cryptotanshinon từ cây đan sâm
(Salvia miltiorrhiza Bunge.) phục vụ công tác đánh giá chất lƣợng dƣợc liệu đan
sâm” được tiến hành với mục tiêu chiết xuất, phân lập và phân tích cryptotanshinon
trong dược liệu đan sâm bao gồm các nội dung nghiên cứu như sau:
-
Chiết xuất, phân lập và xác minh cấu trúc cryptotanshinon từ rễ đan sâm thu hái ở
Lào Cai.
Xây dựng và thẩm định được phương pháp phân tích cryptotanshinon sử dụng
HPLC.
1
CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐAN SÂM
1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố
Cây đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge.) thuộc chi Salvia, họ Bạc hà
(Lamiaceae) còn gọi là đơn sâm, huyết sâm, xích sâm; cây cỏ sống lâu năm, cao 30-80
cm, toàn thân mang lông ngắn màu vàng trắng nhạt. Rễ nhỏ dài hình trụ, đường kính
thân dầu tanshinon diterpenoid, bao gồm tanshinon I, tanshinon IIA, cryptotanshinon,
và vv. Hơn 30 tanshinon và quinon diterpenoid đã được phân lập và sinh tổng hợp [36].
a. Diterpenoid
Các hợp chất diterpenoid là các chất tan trong nước và có hơn 30 loại
diterpenquinon. Thành phần chính trong nhóm abietane diterpenoid là các tanshinon
như tanshinon I, II, III, sau đó đến isotanshinon I, II, isocryptotanshinon và
cryptotanshinon. Tỉ lệ các tanshinon quinon là tanshinon I từ 0,12-0,32%, tanshinon
IIA từ 0,02-0,32%, methylen tanshinquinon là 0,05-0,15% [26] (hình 1.1).
19
R = R1 = H, Δ5(10),6(7),15(16)
20
R = R1 = H, Δ5(10),6(7)
21
R = R1 = OH, Δ15(16)
25
R = R1 = H, Δ5(10),6(7)
22
23 Δ15(16)
24
- Các flavonoid khác như: các anthocyanin là thành phần có mặt rất nhiều trong các
hoa đỏ hay đỏ tía ở các loài thuộc chi Salvia L.
d. Một số thành phần khác
Ngoài ra còn có các thành phần khác như: triterpenoid, β- sitosterol, tanin,
vitamin E, polysaccarid [27].
R
R1
R2 R3 R4
1 R=H, R1=R2=Me, R3=H
3 OH OH H Me Me
2 R=R1=H, R2=R3=Me
5 OH H
4
H Me Me
1.Acid ursolic 2. Acid oleanolic 3. Anagadiol 4. Taraxerol 5.Germanicol
Hình 1.3. Cấu trúc một số triterpen oid có trong chi Salvia L.
1.1.3. Tác dụng sinh học của cây đan sâm
Hiện nay có nhiều nghiên cứu về tác dụng dược lý của loài Salvia miltiorrhiza
Bunge. Các tác dụng đã được chứng minh bao gồm:
- Tính vị: vị đắng, tính hàn.
- Quy kinh: quy vào 2 kinh tâm, can.
- Tác dụng và công dụng:
+ Hoạt huyết, trục huyết ứ: dùng để trị vô kinh, hành kinh không đều, đau bụng kinh,
bế kinh, sau khi đẻ huyết ứ đọng gây đau bụng; các trường hợp do chấn thương mà cơ
gân sưng tấy đau đớn [6].
+ Dưỡng tâm an thần: dùng trong các bệnh tâm hồi hộp, mất ngủ, suy nhược thần kinh;
dùng trong bệnh co thắt động mạch vành tim, phối hợp với đương quy, táo nhân [6,14].
Ngoài ra còn dùng để chữa bệnh nhồi máu cơ tim, đau thắt ngực, tâm hư phiền nhiệt
[30].
6
+ Bổ huyết: có thể dùng đối với các bệnh thiếu máu, đặc biệt đối với các bệnh mặt
nhợt nhạt, xanh xao của phụ nữ chưa có chồng. Khi dùng với tính chất bổ huyết thì
dùng đan sâm dạng không qua chế biến.
+ Bổ can tỳ: dùng trong các trường hợp gan và lá lách bị sưng to, trị bệnh huyết hấp
trùng đều có hiệu quả [4,6].
+ Giải độc: dùng trong các trường hợp sang lở, mụn nhọt [6].
+ Đây còn được xem là thuốc dùng tốt cho trường hợp đau dạ dày hay viêm vú [14,30].
+ Đan sâm còn được dùng để điều trị các bệnh viêm gan, xơ gan, suy thận mạn tính,
tiểu đường và các biến chứng của tiểu đường [34].
- Liều dùng: 8- 20 g [6].
Chú ý: không dùng chung với Lê lô [23].
7
1.2. TỔNG QUAN VỀ CRYPTOTANSHINON
8
4
O
7
5
6
6
18
18
Tanshinone I (2)
15
9
10
3
7
5
13
11
16
8
12
O
15
O
17
19
Cryptotanshinone (3)
Hình 1.4. Cấu trúc cryptotanshinon
+ Tên IUPAC: 1,2,6,7,8,9-hexahydro-1,6,6-trimethyl-(R)-phenanthro(1,2-b)furan10,11-dione.
+ Công thức phân tử: C19H20O3.
+ Khối lượng phân tử: 296,36 g/mol.
+ Màu sắc: bột màu cam nâu.
+ Điểm nóng chảy: 183°C.
+ Độ tan: cryptotanshinon không hòa tan trong nước, nhưng tan trong dimethyl
có kích thước tương đối lớn (50-150 µm), được nạp trong cột thủy tinh. Mẫu chất cần
phân tích được đặt trên đầu cột, phía trên pha tĩnh (có một lớp thủy tinh che chở để lớp
mặt không bị xáo trộn), bình chứa dung môi giải ly được đặt phái trên cao. Dung môi
giải ly ra khỏi cột ở phần bên dưới cột được hứng vào những lọ nhỏ đặt ngay ống dẫn
ra của cột. Phương pháp này thường làm cho quá trình tách bị chậm, hiệu quả thấp so
với sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Tuy vậy, sắc ký cột cũng có ưu điểm là pha tĩnh và các
dụng cụ rẻ tiền, dễ kiếm, có thể triển khai với một lượng mẫu tương đối lớn. ¾ Các
bước thực hiện sắc ký cột gồm:
- Lựa chọn chất hấp phụ: pha tĩnh là silicagel loại thường, hợp chất không phân cực
được giải ly khỏi cột trước, hợp chất phân cực được giải ly sau. Với 2 phân tử không
phân cực, phân tử nào có trọng luợng phân tử lớn sẽ có tính phân cực mạnh hơn phân
tử kia, nó bị pha tĩnh giữ lại trong cột nên di chuyển ra khỏi cột chậm hơn so với các
phân tử nhỏ, và cũng có khi nó ở lại lâu hơn trong cột so với phân tử tuy có tính phân
cực.
9
- Lựa chọn dung môi: Mẫu cần sắc ký đuợc hoà tan hoàn toàn trong dung môi phù hợp
với nồng độ 10 mg/ml, gọi là dung dịch mẫu (A). Chuẩn bị 4-6 tấm bản mỏng 2,5x10
cm. Chấm lên những tấm bản này mỗi tấm khoảng 2-5 µl dung dịch (A). Mỗi bản
mỏng được triển khai với một loại dung môi giải ly khác nhau, kế đó phát hiện bằng
đèn UV hay thuốc thử. Với đơn dung môi sẽ dễ dàng thấy được dung môi nào phù hợp.
Từ kết quả đó, tìm một hỗn hợp dung môi, trong đó một dung môi phân cực và một
dung môi kém phân cực thí dụ như ete dầu hỏa (etyl acetat).
- Nạp chất hấp thu dạng khô vào cột: dùng kẹp giữ cho cột thẳng đứng trên giá, cho
dung môi loại kém phân cực nhất vào khoảng 2/3 chiều cao cột. Cho chất hấp thu dạng
khô vào thẳng trong cột, đều đặn, mỗi lần một lượng nhỏ, vừa cho vừa gõ nhẹ vào
thành cột. Khi lớp chất hấp thu đạt được chiều cao khoảng 2 cm trong cột, thì mở nhẹ
khoá ở bên dưới để cho dung môi chảy ra, hứng vào một becker trống để bên dưới cột,
R
f
=
d
d
(1)
R
M
Trong đó: dR là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm)
dM là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động
(đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm)
Rf có giá trị dao động giữa 0 và 1
+ Hệ số lưu giữ tương đối Rr:
R=
r
Trong đó:
d
d
R,x
nhất là camera kỹ thuật số có độ phân giải cao để thu nhận hình ảnh của vết sắc ký. Xử
lý dữ liệu bằng máy tính [3,9,21,22].
1.3.2. Phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR)
a. Nguyên tắc
Nếu hạt nhân nguyên tử có từ tính được đặt trong một từ trường, khi hay đổi từ
trường sẽ dẫn đến hấp thụ năng lượng của sóng vô tuyến và xuất hiện phổ cộng hưởng
từ hạt nhân.
Những hạt nhân nguyên tử có khối lượng là số lẻ và những hạt nhân nguyên tử có
khối lượng là số chẵn nhưng số thứ tự nguyên tử là số lẻ thì có momen từ và cho tín
hiệu NMR. Các hạt nhân nguyên tử có khối lượng và số thứ tự nguyên tử là những số
chẵn thì không có momen từ và không cho tín hiệu NMR. Vị trí của tín hiệu cộng
hưởng từ proton trong phổ NMR phụ thuộc vào mật độ điện tử ở vùng lân cận quanh
proton đó.
12
b. Các đại lƣợng đặc trƣng
- Độ chuyển dịch hoá học
Sự khác nhau về vị trí hấp thụ giữa proton của mẫu phân tích và của chất chuẩn
được gọi là độ chuyển dịch hoá học ()
δ ppm =
ν mau -ν TMS
ν may
×10 6
(3)
Dùng chùm điện tử có năng lượng trung bình (50 – 100 eV) để bắn phá phân tử
hữu cơ ở môi trường chân không cao (10-3 - 10-6 mmHg). Trong quá trình đó, chất hữu
cơ bị ion hoá và bị phá vỡ thành mảnh. Các ion được tạo thành trong buồng ion hoá,
13
được gia tốc và tách riêng nhờ bộ phân tích khối trước khi đến detector. Tín hiệu tương
ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng một số vạch (pic) có cường độ khác nhau tập
hợp lại thành một khối phổ đồ hoặc phổ khối.
b. Ứng dụng của MS
- Xác định các đồng vị: Các nguyên tử đồng vị của cùng một nguyên tố có cùng số điện
tích hạt nhân chỉ khác nhau về số neutron trong nhân đó nên khối lượng nguyên tử
khác nhau. Có thể dùng MS để xác định thành phần các đồng vị của các nguyên tố
trong mẫu.
- Định tính
+ Phân tích khối phổ có thể cho rất chính xác khối lượng các ion phân tử M+, (M+1)+,
(M+2)+, đây là các đặc trưng quan trọng của hợp chất hoá học. Bên cạnh đó xem xét
thêm các pic đồng vị, tỷ số cường độ của chúng cùng với khối lượng của các mảnh ion
có thể xác định công thức nguyên của chất phân tích.
+ Có thể so sánh phổ nghiên cứu với thư viện phổ có trong máy hoặc phổ nghiên cứu
với phổ chất đối chiếu để khẳng định thành phần định tính của mẫu.
- Xác định công thức cấu tạo: Để xác định công thức cấu tạo của chất nghiên cứu cần
dùng kỹ thuật ion hoá thích hợp phân tách chất nghiên cứu thành nhiều mảnh ion để
làm rõ cấu tạo ghép nối của chúng. Việc biện giải phổ nên phối hợp với phổ NMR và
phổ IR.
- Định lượng: Phân tích định lượng khối phổ tương tự như các kỹ thuật khác dùng cách
thiết lập đường chuẩn hoặc thêm đường chuẩn cùng với đo cường độ vạch phổ để xác
định nồng độ [2,3,22].
1.3.4. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC
a. Nguyên tắc
=
= -1
t0
t0
t0
(4)
Hệ số dung lượng cho biết khả năng phân bố của chất đó vào hai pha, tức là tỷ
lệ giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động tại thời điểm cân
bằng. Nếu k’ nhỏ thì tR cũng nhỏ, chất bị rửa giải gần với thời điểm bơm mẫu do đó làm
15
giảm khả năng tách, nếu k’ lớn quá thì sẽ dẫn đến doãng pic, độ nhạy thấp và thời gian
lưu kéo dài. Trong thực tế k’ nằm trong khoảng 2-5 là tốt nhất.
- Hệ số chọn lọc :
' t R,B-t 0
α= k B =
k 'A t R,A -t 0
(k’B k’A)
(5)
khác 1 càng nhiều thì khả năng tách càng rõ ràng. Để tách riêng hai chất thường chọn
nằm trong khoảng 1,05 đến 2.
- Hiệu lực cột:
Hiệu lực cột được đánh giá thông qua 2 thông số: số đĩa lý thuyết (N) và chiều
L
N
(8)
- Hệ số bất đối AF (tailing factor):
AF =
W1/20
2a
(9)
Hệ số bất đối AF cho biết mức độ cân đối của pic trên sắc ký đồ.
Trong đó:
W1/20 : là chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic.
16
a là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước
tại vị trí 1/20 chiều cao của pic.
Trong phép định lượng thì yêu cầu 0,9 ≤ AF ≤ 2.
Giá trị của AF càng gần 1 thì pic càng cân đối.
- Độ phân giải (resolution)
Độ phân giải đặc trưng cho mức độ tách 2 chất ra khỏi nhau trên một điều kiện
sắc ký. Độ phân giải của 2 pic kề nhau được tính theo công thức:
R S=
17
Copyright: Tài liệu đại học ©