BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ MINH HẬU
Mã sinh viên: 1201183

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH
LƯỢNG VITAMIN B5 TRONG VIÊN
NANG MỀM CARMANUS
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2017


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ MINH HẬU
Mã sinh viên: 1201183

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH
LƯỢNG VITAMIN B5 TRONG VIÊN
NANG MỀM CARMANUS
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. NGUYỄN THỊ KIỀU ANH
2. ThS. NGÔ MINH THÚY
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Hóa phân tích-Độc chất
2.Viện Công nghệ Dược phẩm quốc gia


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................... 3
1.1. Tổng quan về vitamin B5 ......................................................................... 3
1.1.1. Công thức hóa học ................................................................................. 3
1.1.2. Nguồn gốc ............................................................................................... 3
1.1.3. Tính chất lý hóa...................................................................................... 3
1.1.4. Tác dụng và cơ chế tác dụng ................................................................. 3
1.1.5. Một số phương pháp định lượng vitamin B5 ........................................ 4
1.1.6. Một số chế phẩm chứa vitamin B5lưu hành trên thị trường ............... 5
1.2. Vài nét về viên nang mềm Carmanus ................................................... 6
1.3. Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao........................ 9
1.3.1. Khái niệm sắc ký lỏng hiệu năng cao ................................................... 9
1.3.2. Cấu tạo hệ thống HPLC ........................................................................ 9
1.3.3. Các thông số đặc trưng trong HPLC .................................................. 11
1.3.4. Pha tĩnh trong HPLC ........................................................................... 13
1.3.5. Pha động trong HPLC ......................................................................... 14
1.3.6. Một số phương pháp định lượng trong HPLC ................................... 15
CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............ 17
2.1. Điều kiện thực nghiệm ........................................................................... 17
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .......................................................................... 17
2.1.2. Hóa chất, dung môi .............................................................................. 17
2.1.3. Dụng cụ thiết bị .................................................................................... 17
2.2. Nội dung nghiên cứu .............................................................................. 18


2.3. Phương pháp nghiên cứu....................................................................... 18
2.3.1. Chuẩn bị dung dịch pha mẫu và dung dịch chuẩn ............................ 18
2.3.2. Xây dựng phương pháp phân tích....................................................... 18
2.3.3. Thẩm định phương pháp phân tích .................................................... 19
2.3.4. Ứng dụng định lượng vitamin B5 trong viên nang mềm Carmanus . 20
2.4. Phương pháp xử lí kết quả .................................................................... 21


C18

Cột Octadecylsilan

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HL

Hàm lượng

MeCN

Acetonitril

MeOH

Methanol

RP

Pha đảo

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối

SD



DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Một số chế phẩm chứa vitamin B5 lưu hành trên thị trường ............ 6
Bảng 3.1. Kết quả độ phù hợp hệ thống.......................................................... 28
Bảng 3.2. Cách pha dãy dung dịch chuẩn ...................................................... 30
Bảng 3.3. Kết quả xác định khoảng tuyến tính ............................................... 31
Bảng 3.4. Kết quả thẩm định độ đúng của phương pháp ............................... 32
Bảng 3.5. Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp ............................... 34
Bảng 3.6. Kết quả đánh giá độ chính xác trung gian ..................................... 35
Bảng 3.7. Kết quả định lượng ......................................................................... 36


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của vitamin B5 (Calci pantothenat) .................... 3
Hình 1.2. Sơ đồhệ thống HPLC ........................................................................ 9
Hình 3.1.SKĐ vitamin B5 chuẩn khảo sát tỉ lệ thành phần pha động............. 25
Hình 3.2. SKĐ phân tích viên nang mềm Carmanus với hệ pha động MeOH dung dịch KH2PO4 0,05M pH 2,5 (10 : 90) .................................................... 25
Hình 3.3. Kết quảđánh giá độchọn lọc của phương pháp .............................. 29
Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn mỗi quan hệ tuyến tính giữa diện tích pic và nồng
độ vitamin B5 ................................................................................................... 31


ĐẶT VẤN ĐỀ
Vitamin là những chất không thể thiếu trong cuộc sống hàng ngày của
mỗi con người. Vitamin đóng vai trò là các chất xúc tác trong các phản ứng
sinh hóa, từ quá trình trao đổi chất đến xây dựng hệ thống miễn dịch của cơ
thể.Vitamin có vai trò đặc biệt quan trọng trong việc sản sinh năng lượng, duy
trì các hoạt động sống của cơ thể.Chính bởi vậy, đã từ lâu vitamin có mặt rất
nhiều trong các chế phẩm đa sinh tố, các sản phẩm dinh dưỡng[3].Hiện nay,

đọng vào thành vỏ nang vì vậy cần có cách xử lí phù hợp để có thể chiết được
hoàn toàn vitamin B5.
Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Xây dựng
phương pháp định lượngvitamin B5 trong viên nang mềm Carmanus” bằng
sắc ký lỏng hiệu năng caovới 2 mục tiêu chính:
1. Xây dựng phương pháp định lượng vitamin B5 trong viên nang
mềm Carmanus.
2. Ứng dụng định lượng vitamin B5 trong viên nang mềm Carmanus
bằng phương pháp đã xây dựng.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1.TỔNG QUAN VỀ VITAMIN B5
1.1.1. Công thức hóa học
Vitamin B5 trong dược phẩm thường tồn tại ở dạng muối Calci pantothenat:

Hình 1.1.Công thức cấu tạo của vitamin B5 (Calci pantothenat) [2], [18].
Công thức phân tử:C18H32CaN2O10 [2], [18].
Khối lượng phân tử: 476,5 [2], [18].
Tên khoa học:
Calci bis[(R)-3-(2,4-hydroxy-3,3-dimethylbutyramido)propionate] [2].
1.1.2. Nguồn gốc
Nguồn gốc của vitamin B5 chủ yếu ở trong tự nhiên.Nó có ở trong 1 loạt
các loại thực phẩm. Các nguồn tốt nhất là bia men, pho mát, bắp, súp lơ, cải
xoăn, cà chua, bơ, các loại đậu, thịt bò, lòng đỏ trứng, thận, gan, tôm hùm,
mầm lúa mì, cá hồi, bánh mỳ làm từ ngũ cốc và các loại ngũ cốc…[3].
1.1.3. Tính chất lý hóa
Bột kết tinh màu trắng, hơi hút ẩm.Dễ tan trong nước, khó tan trong

Áp dụng đối với viên nang, viên nénchứa các vitamin tan trong nước (có
hoặc không chứa các vitamin tan trong dầu, khoáng chất).
Điều kiện sắc ký gồm:
- Chuẩn nội: acid p-hydroxybenzoic.
- Cột: C18 (3,9 mm× 15 cm; 5 µm).
- Pha động: acid phosphoric – nước tỉ lệ1:1000.
- Bước sóng phát hiện:210 nm.
- Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút.

4


- Thể tích tiêm: 10 µl.
b. Phương pháp 2
Áp dụng đối vớiviên nang, viên nén chứa các vitamin tan trong nước (có
hoặc không chứa các vitamin tan trong dầu, khoáng chất).
Điều kiện sắc kí gồm:
- Cột: C18(3,9 mm× 30 cm; 5 µm), nhiệt độ cột: 50oC.
- Pha động:MeOH –dung dịch đệm tỉ lệ1 :9(dung dịch đệm được pha
bằng cách hòa tan 10g KH2PO4 trong 2000 ml nước điều chỉnh đến pH
3,5 bằng acid phosphoric).
- Bước sóng phát hiện:205 nm.
- Tốc độ dòng: 2 ml/phút.
- Thể tích tiêm: 25 µl.
c.Phương pháp 3
Áp dụng đối với dung dịch uống chứa các vitamin tan trong nước (có hoặc
không chứa các vitamin tan trong dầu, khoáng chất).
Điều kiện sắc kí gồm:
- Cột: C18 (4 mm× 10 cm; 3 µm).
- Pha động: MeOH – dung dịch đệm tỉ lệ3 : 97 (dung dịch đệm sử dụng


Nhà sản xuất

lượng B5

Viên nang

Forceval capsules

4 mg

Alliance Pharma

mềm

Carmanus

16 mg

Traphaco

Vitamin 5B

50 mg

Hatechpharma

Anti Gray Hair

300 mg


1 mg

TV.Pharm

Viên nén sủi

Bicimax

23 mg

STADA - VN

bọt

Berocca

23 mg

BAYER

Viên nang
cứng

3

vitamin B5
Cystamin Plus –
US
4

lecithin, oxyd sắt đỏ, oxyd sắt nâu, ethanol 96%.
Các thành phần trong công thức có tác dụng sau:
Cao Carduus marianus(silymarin, silybin): thúc đẩy sự phát triển của tế
bào gan và ngăn chất độc thấm qua tế bào, làm gia tăng khối lượng gan và
protein của microsom, tăng cường giải độc gan do làm tăng sự tạo thành các
cytochrom P-450 trong lưới nội bào, làm giảm những tổn thương do thiếu
máu cục bộ trên các tế bào không phải mô mềm của gan[6].
Vitamin B1: tham gia vào quá trình chuyển hóa glucid, ngăn chặn sự ứ
đọng các thể cetonic trong máu, bảo vệ gan[3].
Vitamin B2: tham gia vào quá trình chuyển hóa glucid, lipid, protid góp
phần bảo vệ và tăng sức đề kháng cho gan [3].

7


Vitamin B3: có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa cholesterol,
acid béo và tạo năng lượng ATP cung cấp cho chuỗi hô hấp tế bào, tăng
cường bảo vệ gan, chống lại những độc tố và hóa chất gây hại [3].
Vitamin B5: tham gia vào quá trình tái tạo glucose, phân hủy acid béo,
tổng hợp sterol, hormon steroid, porphyrin, hỗ trợ hoạt động chức năng gan
[3].
Vitamin B6: tham gia vào chuyển hóa lipid, glucid và chuyển protid thành
glucid và lipid, tăng cường hỗ trợ và bảo vệ gan [3].
Tác dụng của chế phẩm:
Bảo vệ gan duy trì ổn định màng tế bào gan.
Tăng khả năng oxy hóa các acid béo ở gan.
Chống hủy hoại tế bào gan, kích thích tái tạo các nhu mô gan.
Chỉ định:
Gan nhiễm mỡ, mỡ máu cao.
Rối loạn chức năng gan mãn tính, suy gan ở người nghiện rượu bia, bảo


Bơm

Bộ phận
tiêm mẫu

Detectơ

Cột sắc
ký

Hình 1.2.Sơ đồhệ thống HPLC [1]
Do bản chất các chất phân tích khác nhau vì vậy có nhiều kĩ thuật để định
lượng bằng sắc ký lỏng. Tuy vậy cấu tạo của một máy sắc ký lỏng đều giống
nhau và có cùng 1 số bộ phận như sau:
1.3.2.1.Hệ thống cấp pha động
Pha động trong HPLC thường chứa trong bình thủy tinh, đôi khi bằng
thép không gỉ. Trước khi sử dụng cần lọc qua màng 0,45 µm và siêu âm để
đuổi khí hòa tan.Có 2 cách dùng pha động rửa giải:
Đẳng dòng: thành phần pha động không thay đổi trong qua trình sắc kí.

9


Gradient: Pha động là hỗn hợp của nhiều dung môi, thường là 2-4 dung
môi đựng trong các bình khác nhau. Tỉ lệ các thành phần thay đổi trong quá
trình sắc kí theo chương trình đã định (chương trình dung môi)[1].
1.3.2.2.Hệ thống bơm
Để bơm pha động vào cột sắc ký. Yêu cầu chung của hệ thống bơm trong
sắc ký lỏng:


chất tan trong pha động).
K càng lớn chất phân tích di chuyển qua pha tĩnh càng chậm [1].
1.3.3.2.Thời gian lưu tR
Là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột tới khi được phát hiện bởi
detectơ.Thời gian lưu càng lớn chất phân tích càng bị lưu giữu mạnh, thời
gian phân tích sẽ kéo dài.Thời gian lưu quá ngắn thì khả năng tách kém.
Trên cùng một điều kiện HPLC đã chọn, thời gian lưu của mỗi chất là xác
định.Vì vậy có thể dùng thời gian lưu để phát hiện, định tính các chất.
Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố:
- Bản chất sắc ký của pha tĩnh, kích thước, độ xốp, cấu trúc của hạt nhồi.
- Bản chất, thành phần, tốc độ pha động.
- Cấu tạo và bản chất của phân tử chất tan, các nhóm thế.
- Trong một số trường hợp còn phụ thuộc pH của pha động, nồng độ chất
tạo phức, nếu các yếu tố này có ảnh hưởng đến các cân bằng động trong
quá trình sắc ký [1], [8].
1.3.3.3.Hệ số dung lượng k’
Mô tả tốc độ di chuyển của chất phân tích qua cột hay còn được gọi là hệ
số phân bố khối lượng giữa hai pha.
k ’=

.
.

=K

=

Trong đó: CS, CM lần lượt là nồng độ mol chất tan trong pha tĩnh và pha
động.

= 5,54(

)

2

Trong đó W là chiều rộng của pic sắc ký.W1/2 là chiều rộng pictại một nửa
chiều cao pic[1], [4], [8].
1.3.3.6.Hệ số đối xứng F
Để đánh giá tính đối xứng của pic ta dùng hệ số đối xứng:
F=
Trong đó:
W: chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic.
a: khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong
phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic.
Yêu cầu: F khi chuẩn hóa cột từ 0,9 – 2,0.
12


Hệ số đối xứng thấp do hiện tượng mở rộng dải (doãng pic), nguyên nhân
có thể do quá trình khuếch tán xoáy, khuếch tán dọc, hoặc quá trình chuyển
khối không cân bằng [1], [4], [8].
1.3.3.7.Độ phân giải RS
Là đại lượng đo mức độ tách của hai chất trên một cột sắc ký (ví dụ A và
B)
RS =

á
Đ


WA và WB: độ rộng pic đo ở các đáy pic.
W1/2A, W1/2B: độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic.
Yêu cầu: RS> 1, Giá trị tối ưu RS = 1,5[1], [4], [8].
1.3.4. Pha tĩnh trong HPLC
Pha tĩnh HPLC là chất nhồi cột để làm nhiệm vụ phân tách một hỗn hợp
chất phân tích.Đó là những chất rắn xốp, kích thước hạt rất nhỏ, đường kính
hạt thường dao động từ 3 - 10 µm. Kích thước hạt càng nhỏ chiều cao đĩa lý
thuyết càng giảm nên số đĩa lý thuyết càng tăng. Tuy nhiên khi kích thước hạt
càng nhỏ áp lực đối với pha động càng lớn khi đó cột phải chịu được áp suất
đầu vào cao.
Chất nhồi cột cho sắc ký lỏng thường chế tạo từ silica (silic oxyd) bằng
cách làm kết tụ các hạt silica để tạo ra các hạt có kích thước lớn hơn và đường
kính đều nhau [1].
Điều kiện đối với một pha tĩnh:
- Phải trơ và bền vững với các điều kiện của môi trường sắc ký.
- Có khả năng tách chọn lọc.
- Tính chất bề mặt phải ổn định.
- Cỡ hạt tương đối đồng nhất.

13


- Cân bằng động học của quá trình tách phải xảy ra nhanh và lặp lại.
1.3.5.Pha động trong HPLC
Pha động là dung môi dùng để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột. Là một
yếu tố linh động và dễ dàng thay đổi. Nó có thể là một dung môi hoặc hỗn
hợp nhiều dung môi được trộn lẫn với nhau theo tỉ lệ nhất định.
Pha động là một trong những yếu tố quyết định khả năng tách của các chất
phân tích trong một hỗn hợp mẫu. Nó ảnh hưởng trực tiếp đến thời gian lưu
của các chất phân tích và hiệu quả của quá trình sắc ký.Pha động có thể ảnh

pháp chuẩn ngoại.Đây là phương pháp định lượng cơ bản, trong đó cả 2 mẫu
chuẩn và thử đều được tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện, so sánh diện
tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử với diện tích (hoặc chiều cao) pic mẫu
chuẩn sẽ tính được nồng độ chất trong mẫu thử. Có thể sử dụng phương pháp
so sánh (chuẩn hóa 1 điểm) hoặc đường chuẩn (chuẩn hóa nhiều điểm).
- So sánh (chuẩn hóa 1 điểm): Chọn nồng độ của mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng
độ của mẫu thử. Tính nồng độ mẫu thử theo công thức: CX = CS ×
CX, CS: nồng độ chất phân tích trong mẫu thử và mẫu chuẩn.
SX, SS: diện tích pic của chất phân tích trong SKĐ mẫu thử và mẫu chuẩn.
- Đường chuẩn (chuẩn hóa nhiều điểm):
Cách tiến hành: Chuẩn bị một dãy chuẩn với các nồng độ chất chuẩn
tăng dần rồi tiến hành sắc ký. Các đáp ứng thu được là các diện tích hoặc
chiều cao pic ở mỗi điểm chuẩn. Vẽ đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa
diện tích S (hoặc chiều cao H) của pic với nồng độ của chất chuẩn.Sử dụng
khoảng tuyến tính của đường chuẩn để tính toán nồng độ của chất cần xác
định. Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính mô tả quan hệ giữa diện tích
(hoặc chiều cao) pic với nồng độ của chất cần xác định: y = ax + b
Trong đó:

15


y: diện tích pic (hoặc chiều cao).
a: độ dốc của đường chuẩn.
b: giao điểm của đường chuẩn với trục tung.
x: nồng độ của chất phân tích.
Chú ý: Độ lớn của diện tích hoặc chiều cao pic mẫu thử phải nằm trong
khoảng tuyến tính của đường chuẩn [1], [4], [8].

16