BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI


MEAS PUTHEKA
Mã sinh viên: 1101413

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH
LƯỢNG ACID SHIKIMIC TRONG
ĐẠI HỒI BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG
KẾT HỢP ĐO MẬT ĐỘ QUANG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2016


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

MEAS PUTHEKA
Mã sinh viên: 1101413

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH
LƯỢNG ACID SHIKIMIC TRONG
ĐẠI HỒI BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG
KẾT HỢP ĐO MẬT ĐỘ QUANG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. TS. Nguyễn Văn Hân
2. ThS. Ngô Quang Trung
Nơi thực hiện:

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN.......................................................................... 2
1.1 Tổng quan về cây hồi ............................................................................ 2
Vị trí phân loại và phân bố ............................................................ 2
Đặc điểm thực vật ......................................................................... 2
Bộ phận dùng, thu hái và chế biến ................................................ 3
Thành phần hóa học và công dụng ............................................... 3
1.2 Tổng quan về acid shikimic ................................................................... 4
Công thức hóa học và tính chất ..................................................... 4
Nguồn gốc acid shikimic............................................................... 5
Vai trò acid shikimic ..................................................................... 5
Kỹ thuật phân tích acid shikimic .................................................. 6
Một số nghiên cứu định lượng acid shikimic bằng TLC-scanning
....................................................................................................... 8
1.3 Tổng quan về sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang (TLC
Scanning)....................................................................................................... 9
Sắc ký lớp mỏng............................................................................ 9
Sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang (TLC Scanning) ..... 12
CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU ............................................................................................... 14
2.1. Nguyên vật liệu .................................................................................... 14
2.1.1. Nguyên liệu ................................................................................. 14
2.1.2. Hóa chất, thiết bị, dụng cụ .......................................................... 14


2.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................... 16
2.3.1. Xây dựng phương pháp định lượng ............................................ 16
2.3.2. Thẩm định phương pháp định lượng........................................... 18
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .................. 22

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Công thức hóa học của acid shikimic ............................................... 4
Hình 2.1: Nguyên liệu Đại hồi ........................................................................ 14
Hình 3.1: Hình ảnh bản mỏng sau khi hiện màu bằng cách nhúng và phun thuốc
thử . Hình 1 bằng cách phun, hình 2 bằng cách nhúng. .................................. 22
Hình 3.2: Hình ảnh bản mỏng khi hiện màu bằng thuốc thử KMnO4 ở các nồng
độ khác nhau.................................................................................................... 23
Hình 3.3: Hình ảnh bản mỏng sau hiện màu ở những thời điểm khác nhau .. 24
Hình 3.4: Bản mỏng sau khi hiện màu ……………………………………….25
Hình 3.5:Sắc ký đồ (1.Mẫu chuẩn. 2. Mẫu thử).............................................. 26
Hình 3.6: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích và nồng độ acid shikimic
......................................................................................................................... 27
Hình 3.7: Bản mỏng xác định LOD………………………………………….29
Hình 3.8: Hình ảnh sắc ký đồ LOD.…………………………………………30


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN

HPLC ( High-Performance Liquid

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Chromatography).
GLC ( Gas Liquid Chromatography)

Sắc ký khí lỏng

NMR (Nuclear Magnetic Resonance)

Phổ cộng hưởng từ hạt


TLC (Thin Layer Chromatography )

Sắc ký lớp mỏng

TLC-Scanning (Thin Layer Chromatography- Sắc ký lớp mỏng kết hợp
Scanning)

đo mật độ quang

LOD (Limit of Detection)

Giới hạn phát hiện

LOQ (Limit of Quantitation)

Giới hạn định lượng

Rf (Retention Fector)

Hệ số lưu giữ

RSD (Relative Standard Deviation)

Độ lệch chuẩn

µL

Micrlit



2

CHƯƠNG 1

: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về cây hồi
Vị trí phân loại và phân bố
Theo hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan, cây hồi (Illicium verum
Hook. f.) có vị trí phân loại khoa học được thể hiện trong bảng dưới đây [3].
Bảng 1.1: Vị trí phân loại của cây hồi (Illicium verum Hook. f.)
Chi Hồi (Illicium) có khoảng trên 40 loài, phân bố chủ yếu ở Đông Nam
Á, Đông Á và Bắc Mỹ.
Giới

Thực vật - Plantae

Không phân hạng

Nhóm thực vật có hoa - Angiospermae

Bộ

Mộc lan dây - Austrobaileyales

Họ

Hồi - Illiciaceae


Bộ phận dùng, thu hái và chế biến


Bộ phận dùng
Đại hồi (quả) – Fructus Illicium veri là quả chín đã phơi khô của cây hồi

- Illicium verum Hook. f. (họ Hồi – Illiciaceae).


Thu hái và chế biến
Hàng năm cây ra hoa kết quả theo 2 vụ, vụ chính thu hoạch vào tháng 8-

10 (vụ mùa), vụ muộn thu hoạch vào tháng 2-4 năm sau (vụ tứ quý). Vụ muộn
cho năng suất thấp hơn. Cây trồng sau 5-6 năm bắt đầu cho thu hoạch. Sau 15
năm mỗi cây có thể cho 10-20kg quả tươi/năm, sau 20 năm, năng suất tương
đối ổn định ở mức 20-30kg/năm [4].
Thành phần hóa học và công dụng


Thành phần
- Tinh dầu: hàm lượng 3-3,5 % trong quả tươi, 9-10 % trong quả khô.

Chứa 80-90 % trans-anethol, ngoài ra còn có linalol, estragol, terpineol,
anysaldehyd… [9], [13].
- Acid hữu cơ: acid shikimic, protocatechic, anisatinic, isoanisatinic.
Trong đó quan trọng nhất là acid shikimic [4], [9].
- Ngoài ra còn 1 số chất thuộc nhóm flavonoid, tannin, sesquiterpen,
sesquiterpen lacton, sesquilignan, sesqui-neoliganan; dầu béo chủ yếu chứa
trong hạt [9], [6].


Tính chất: Acid shikimic là một chất kết tinh màu trắng, rất dễ tan trong nước
(18%), tan trong ethanol tuyệt đối (2,25%), trong methanol, không tan trong
các dung môi ít phân cực ethyl acetat, aceton, cloroform, benzen, ether dầu hỏa.


5

Nhiệt độ nóng chảy: 183,0 - 184,5 oC.
Năng suất quay cực: []18= -183,8 (c = 4,03% trong nước).
Cực đại hấp thụ: Dung dịch acid shikimic trong ethanol có cực đại hấp thụ ở
213 nm.
Nguồn gốc acid shikimic
Acid shikimic được Eykman F. và cộng sự phân lập lần đầu tiên vào năm
1885 từ một loài hồi Nhật Bản (Illicium anisatum). Đến 50 năm sau cấu trúc
hóa học của acid shikimic mới được xác định [30]. Acid shikimic có trong nhiều
loài thực vật như đại hồi (Illicium verum), bạch quả (Gingko biloba), quyển bá
trường sinh (Selaginella tamariscina, Hoselaginellaceae), kha tử (Terminalia
chebula), chuối tiêu (Musa sapientum), hướng dương (Heliantus annus), tiểu
hồi (Foeniculum vulgare)… [33]. Nhưng hiện nay đại hồi vẫn là nguyên liệu
quan trọng để chiết xuất, bởi hàm lượng acid shikimic trong quả hồi tương đối
cao (5%-10%) [9].
Acid shikimic còn có nguồn gốc từ tổng hợp hoặc bán tổng hợp. Raphael
(1960) và Smissman (1959) đã tổng hợp acid shikimic từ 1,3-butadien-1,4-diyl
diacetate qua phản ứng Diels Alder. Grewe (1964) và cộng sự tổng hợp acid
shikimic từ 1,3-butadien. Ngoài ra, acid shikimic có thể được tổng hợp từ
benzen, bán tổng hợp từ acid quinic và D-manose [19].
Vai trò acid shikimic
 Trong sinh học nói chung, acid shikimic đóng vai trò quan trọng trong quá
trình sinh tổng hợp các acid amin thơm như phenylalanin, tryptophan, tyrosin;
các alcaloid, hợp chất phenolic, các phenyl propanoid [34]. Nó là chất trung


Vết trắng trên nền xanh

Xanh bromocresol

Màu vàng với các acid

Natri metaperiodat + natri
nitroprussid và piperazin

Màu vàng xanh

Bạc nitrat/kiềm

Màu đen

Acid iodic trong aceton

Màu hồng

Kali permanganat trong aceton

Màu vàng nhạt


7

Sắt amoni sulfat

Máu xanh vàng

 Đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân: Acid shikimic dễ dàng xác định bằng
máy quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) sử dụng dung môi như D2O,
deuterium methanol tetra, và acetone-d6.
 Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo: Acid hữu cơ được xác định theo điều
kiện của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC). Trình
tự tách rửa của acid hữu cơ trong điều kiện RP-HPLC như sau: acid tartaric

dụng của lực mao quản, pha động thấm theo lớp mỏng đi qua điểm xuất phát nơi hỗn hợp chất cần phân tích đã được đưa lên bản mỏng. Trong quá trình di
chuyển của pha động qua lớp mỏng chất hấp phụ (pha tĩnh), nhờ các quá trình


10

hấp phụ và giải hấp phụ được lặp lại và do hệ số phân bố khác nhau mà những
chất khác nhau di chuyển theo hướng chuyển động của pha động với các tốc độ
khác nhau. Kết quả là mỗi chất trong hỗn hợp phân tích có thể sẽ được tách
riêng ra ở các vị trí khác nhau trên bản mỏng [20]. Pha động bao gồm dung
dịch cần phân tích được hào tan trong một dung môi thích hợp và được hút lên
bản sắc ký nhờ lực mao dẫn tách dung dịch thí nghiệm dựa trên độ phân cực
của các thành phần trong dung dịch [20], [21].
Đại lượng đặc trưng cho mức di chuyển của các chất phân tích là hệ số
lưu giữ Rf. Trị số của nó được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển của
chất phân tích và khoảng cách di chuyển của pha động:
𝑑𝑅
𝑑𝑀
dR: khoảng cách từ điểm xuất phát đến tấm vết phân tích.
𝑅𝑓 =

dM: khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động( đo trên
cùng đường đi của vết, tính bằng cm).
Rf : có giá trị dao động từ 0-1 [1].
Pha tĩnh của TLC là các hạt có kích thước 10-30µm được rải đều và kết dính
thành lớp mỏng đồng nhất dày khoảng 250µm trên giá đỡ hình vuông. Bản
mỏng có sẵn trên thị trường có kích thước khác nhau thường 5÷20cm, nhiều
khi có đưa thêm chất huỳnh quang không tan vào pha tĩnh để dễ phát hiện chất
phân tích. Chất hấp phụ thường dùng nhất là silicagel [17], [29].
Pha động dùng cho TLC rất thay đổi, tùy thuộc vào cơ chế sắc ký. Để



Soi dưới đèn UV



Dùng densitometer: thiết bị này cường độ tia phản xạ từ bề mặt bản mỏng

khi soi dưới đèn UV-VIS. Chất phân tích hấp phụ bức xạ được ghi lại thành pic
sắc ký [20], [21], [29].


Ứng dụng của sắc ký lớp mỏng trong phân tích kiểm nghiệm

- Phân tích định tính .
- Thử tính khiết.
- Bán định lượng.
- Định lượng [2], [24].


12

Sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang (TLC Scanning)
Sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang (TLC-Scanning) là một hình
thức tân tiến nhất của công cụ TLC. TLC-Scanning với dụng cụ tinh vi được
điều khiển bơi một phần mềm thích hợp đảm bảo tính ứng dụng, độ tin cậy, độ
lặp lại cao nhất của các số liệu đưa ra. Trong phân tich TLC-Scanning, các
thông số của quá trình phân tích được ghi lại và kiểm soát chặt chẽ, do đó lặp
lại được độ lặp lại cao. Các bước của quá trình phân tích bào gồm phun mẫu,
khai triển mẫu, nhận diện vết được tiến hành bán tự động, giảm thiểu tối đa các

năng cao (HPTLC) có sẵn trên thị trường. Tuy vậy trong kỹ thuật này kể cả
HPTLC sai số của phương pháp dao động trong khoảng 5-10 % [22], [23], [31].


Ưu điểm của TLC-Scanning
 Phù hợp với cả phân tích định tính và định lượng.
 Trong một lần triển khai sắc ký có thể phân tích đồng thời rất nhiều mẫu
một lúc, tiết kiệm thời gian và chi phí cho hóa chất, vật tư tiêu hao.
 Các mẫu phân tích và các dung dịch chuẩn được chấm trên cùng 1 bản
mỏng sắc ký, khai triển cùng một điều kiện dung môi, nhiệt độ, độ ẩm
nên cho độ lặp lại cao, hạn chế sử tác động của môi trường giữa các lẫn
phân tích [26].


14

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, NỘI DUNG VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu
2.1.1. Nguyên liệu
Đại hồi thu mua từ tỉnh Lạng Sơn.

Hình 2.1. Nguyên liệu Đại hồi
2.1.2. Hóa chất, thiết bị, dụng cụ
 Hóa chất
Bảng 2.1: Hóa chất
STT

TÊN HÓA CHẤT


Việt Nam

6

KMnO4

Việt Nam


15

 Thiết bị, dụng cụ
 Máy móc
Hệ thống sắc ký lớp mỏng Camag Reprostar 3, camera Hitachi HV-C20
3CCD. Phần mềm quét VideoStore 2 Manual và xử lý hình ảnh VideoScan
1.01 Manual (Camag).
 Bản mỏng silicagel 60 F254 Merk, kích thước 20x20 cm.
 Thiết bị chiết Soxhlet
 Máy cất quay chân không Buchi B-490 và R-220(Thụy sỹ)
 Máy siêu âm Ultrasonic LC60H(Đức): Công suất P=400 w, Tần số f=35
kHz
 Cân kỹ thuật Sartorius BP 2001S, độ nhạy 10-2 g (Đức)
 Dụng cụ
 Bình cầu 100ml
 Cốc thủy tĩnh loại 100 ml, 250 ml, 500 ml..
 Bình định mức 5 ml,10 ml, 25 ml,50 ml..
 Pipet chính xác 1 ml, 2 ml,5 ml,10 ml.
 Ống nghiệm thủy tinh 10 ml.
 Phễu lọc, giấy lọc và màng lọc mẫu cellulose acetat 0,45 µm (Satorius).
 Mao quản Camag để chấm sắc ký thể tích 1 µl.

- Xử lý mẫu thử:
Cân chính xác khoảng 5,0 g bột quả Đại hồi, gói trong giấy lọc, cho vào
bình chiết Soxhlet, thêm 100 ml EtOH 96º, ngâm qua đêm cho trương nở hoàn
toàn. Chiết Soxhlet trong thời gian 8 tiếng. Lọc dịch chiết qua giấy lọc, cô dịch
lọc thu hồi dung môi đến cắn, hòa tan cắn vào khoảng 20 ml EtOH 96o, sau đó
chuyển vào bình định mức 25 ml, siêu âm 15 phút, bổ sung EtOH 96º đến vạch,
lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm được dung dịch thử chấm sắc ký [14].
- Xử lý mẫu chuẩn:
Cân chính xác khoảng 250 mg acid shikimic chuẩn 99,8% vào bình định
mức 10 ml, thêm 9 ml EtOH 96º, siêu âm đến khi tan hoàn toàn, bổ sung EtOH
96º đến vạch. Thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ khoảng 25 mg/ml. Từ
dung dịch chuẩn gốc pha loãng với EtOH 96o thành các dung dịch chuẩn acid
shikimic có nồng độ lần lượt khoảng 20, 15, 10, 5 mg/ml.
- Lựa chọn các điều kiện triển khai TLC-Scanning:


17

+ Bản mỏng: bản mỏng silica gel 60 F254 (Merck), hoạt hóa ở 110 oC trong
30 phút. Kích thước bản mỏng tùy theo thí nghiệm cụ thể.
+ Đưa mẫu lên bản mỏng: Chấm thủ công bằng tay, phương chấm vuông
góc với bản mỏng, thể tích chấm 1 µl. Vị trí chấm cách mép dưới bản mỏng 1,5
cm, cách mép dung môi từ 0,8 – 1 cm. Khoảng cách giữa vết ngoài cùng và
mép ngoài cùng bản mỏng là 1,5 cm. Khoảng cách giữa 2 vết kề nhau là 1 cm.
+ Hệ dung môi khai triển: Tham khảo tài liệu [11], lựa chọn hệ dung môi
khai triển n-BuOH : acid acetic : nước ( 6:1:2). Bản mỏng được triển khai trong
bình thủy tinh 2 ngăn, kích thước 8x12x14 cm. Thời gian bão hòa pha động: 15
phút.
+ Hiện màu: Sau khi triển khai sắc ký, bản mỏng được để khô tự nhiên ở
nhiệt độ phòng. Sau đó được hiện màu bằng dung dịch KMnO4 trong nước