đặt vấn đề
Hiện nay ở nớc ta, việc nghiên cứu sinh dợc học và dợc động học của thuốc
là một lĩnh vực tơng đối mới, đang ngày càng đợc quan tâm. Trong khi đó, ở
các nớc khác, đây là một tiêu chí bắt buộc các hãng Dợc phẩm phải làm nếu
muốn đa thuốc ra thị trờng. Một trong những vấn đề đánh giá sinh dợc học của
thuốc là mức độ hấp thu thuốc và nồng độ thuốc đạt đợc trong huyết tơng.
Các phơng pháp phân tích hay dùng để xác định nồng độ thuốc trong huyết
tơng (dịch sinh vật) là sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ), sắc ký khí (GC), sắc
ký khí gắn với máy khối phổ (GC - MS ), phóng xạ miễn dịch, điện di mao
quản.... Trong đó, HPLC đặc biệt là HPLC pha đảo với detector UV là phơng
pháp hayđợc dùng hơn cả, do tinh u việt nổi trội về độ nhạy, tính chính xác, độ
chọn lọc, tính kinh tế.
Để có một qui trình dùng HPLC đảm bảo độ tin cậy để phân tích thuốc trong
dịch sinh vật, chúng ta khảo sát các điều kiện sắc ký thích hợp nh cột; dung môi
pha động; lu lợng dòng; bớc sóng.... quy trình xử lý mẫu, khoản nồng độ khảo
sát.
Ketoprofen- acid -2 (- benzoyl phenyl ) propionic - là thuốc chống viêm phi
steroid; có tác dụng giảm đau, chống viêm, ức chế quá trình tổng hợp
prostaglandin và leukotrien; ức chế sự kết dính tiểu cầu đợc dùng nhiều trong
điều trị thấp khớp mãn tính, đặc biệt viêm đa khớp dạng thấp, thoái hoá khớp
nặng. Ketoprofen là thuốc mới đợc đa vào sản xuất ở nớc ta và cha có tài liệu
trong nớc nào đánh giá định lợng ketoprofen trong huyết tơng. Do đó
chúng tôi thực hiện đề tài Nghiên cứu xây dựng phơng pháp định lợng
ketoprofen trong huyết tơng với mục tiêu:
-Khảo sát và lựa chọn dung môi chiết ketoprofen trong huyết tơng cho
hiệu xuất chiết cao.
-Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký thích hợp để định lợng ketoprofen
trong huyết tơng .
-Xây dựng phơng pháp định lợng ketoprofen trong huyết tơng bằng
HPLC.
1

nhau thai. Một phần nhỏ chuyển hoá bằng cách hydroxyl hoá, còn phần lớn liên
hợp với acid glucuronic. Thải trừ chủ yếu qua nớc tiểu (75- 90%), một ít qua
3
CH COOH
C
O
CH
3
phân( 1-8% ). ở nớc tiểu ( 65-75%) là dạng glucuronyl, 1% là dạng cha biến
đổi. Sau khi uống 6 giờ ketoprofen sẽ bị thải trừ 50% qua thận.
1.1.3 Chỉ định [5] [6]:
Ketoprofen đợc chỉ định điều trị dài hạn các triệu chứng trong:
- Viêm thấp khớp mãn tính, đặc biệt là viêm đa khớp dạng thấp, viêm
cứng khớp cột sống.
- Bệnh cứng khớp gây đau và tàn phế.
Điều trị ngắn hạn các triệu chứng trong các cơn cấp tính của các bệnh:
- Bệnh thấp khớp ngoài khớp (đau vai cấp tính, viêm gân ... ).
- Viêm khớp vi tinh thể.
- Thoái hoá khớp.
- Dạng viên nang còn dùng để giảm đau: đau lng, đau rễ thần kinh...
1.1.4 Chống chỉ định [6]:
- Dị ứng với ketoprofen, aspirin, và các thuốc chống viêm phi steroid
cùng loại.
- Loét dạ dày-tá tràng tiến triển.
- Suy thận nặng, suy gan tế bào nặng.
- Phụ nữ có thai( 3 tháng cuối) và cho con bú.
1.1.5 Tác dụng không mong muốn [6]
- Tác dụng phụ ở đờng tiêu hoá: khó chịu vùng dạ dày-ruột, đau dạ dày,
buồn nôn, nôn mửa, táo bón, tiêu chảy, nặng thì loét dạ dày, xuất huyết tiêu
hoá, thủng ruột.

Song song làm một mẫu trắng trong cùng điều kiện.
1ml NaOH 0,1N tơng đơng với 25,43mg C
16
H
14
O
3
.
5
- Hoặc: Hoà tan khoảng 200mg Ketoprofen (cân chính xác) vào 25ml
alcol. Thêm 25ml nớc Chuẩn độ với NaOH 0,1N, xác định điểm tơng đơng
bằng bớc nhảy điện thế.
1ml NaOH 0,1N tơng đơng với 25,43mg C
16
H
14
O
3
.
B. Phơng pháp quang phổ [7] [8][10]:
Dùng để định lợng ketoprofen trong chế phẩm.
Hoà một lợng chế phẩm có chứa khoảng 50 mg ketoprofen (cân chính
xác) trong 300 ml methanol 75 %, lắc trong 10 phút, thêm methanol 75 % vừa
đủ 500 ml. Lọc. Lấy 5 ml dịch lọc pha loãng thành 100 ml với methanol 75 %
và đem đo độ hấp thụ của dung dich này ở bớc sóng 258nm; cuvet thạch anh có
chiều dày 1 cm với mẫu trắng là methanol 75%.
Tính kết quả dựa vào A (1%, 1cm) ở bớc sóng 258 nm là 662.
C. Phơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ).
Dùng để định lợng ketoprofen trong huyết tơng và xác định tạp chất
trong nguyên liệu.

CH
3
COO 20 mM -
MeOH; điều chỉnh pH 7,0.
C
18
4 àm
Huyết tơng
5 [11] ACN : AcOH 1%
( 38 : 62 ).
C
18
10àm
3,9*300 mm
Huyết tơng
6 [16] Đệm Phosphat 0,05M pH 7 :
ACN (90 : 10 ).
C
18
5 àm
4,6*250mm
Huyết tơng
D. Phơng pháp điện di mao quản: Định lợng ketoprofen trong huyết tơng [14]
và tách đồng phân của ketoprofen [17].
1.2 Phơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ).
6
Sắc ký lỏng hiệu năng cao ( High Performance Liquid Chromatography )
còn gọi là sắc ký lỏng cao áp hay sắc ký lỏng hiện đại ra đời vào những năm
cuối 1960. Nó đợc xây dựng và phát triển không ngừng và ngày càng thể hiện
rõ tính u việt, đặc biệt là trong lĩnh vực nghiên cứu sinh dợc học của thuốc.

CH
3
Cl
CH
3
OH
Si R
SiSi O
CH
3
CH
3
R +
H
3
C
H
3
C
- Nếu R là nhóm khá phân cực nh: alkylamin - ( - CH
2
- )
n
-NH
2
hay alkyl
nitril -( - CH
2
- )
n

,
đợc tính theo công thức:
8
t
R
= t
R
,
+ t
M
( hay t
R
,
= t
R
- t
M
).
- Thừa số dung lợng k

dùng để mô tả tốc độ di chuyển của một chất
Qs t
R
t
R
- t
M
V
R
-V

2
b
w
r
t
x 16








hoặc N =
2
2/1
w
r
t
x 54,5








Trong đó: W

2
/g.Căn cứ
theo bản chất chính của quá trình sắc ký trên cột tách, ngời ta chia nó thành
nhiều loại nh hấp phụ, phân bố, trao đổi ion và rây phân tử. Tơng ứng với loại
chất nhồi nh thế ngời ta có một loại sắc ký riêng trong kỹ thuật HPLC.
9
Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng phơng pháp sắc ký phân bố pha liên
kết. Bản chất chính của sự tách trong loại sắc ký này là dựa trên khả năng tách
của các chất trong hai pha không hoà lẫn vào nhau.
Các yêu cầu chung của pha tĩnh trong kỹ thuật HPLC:
+ Phải trơ và bền vững với các điều kiện của môi trờng sắc ký, không
có các phản ứng hoá học phụ với dung môi rửa giải hay với chất phân tích.
+ Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan nhất định trong
điều kiện sắc ký.
+ Tính chất bề mặt phải ổn định.
+ Cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt.
+ Cỡ hạt phải tơng đối dồng nhất.
Pha tĩnh thờng đợc chế tạo trên các chất nền sau:
+ Pha tĩnh trên nền Silicagel ( SiO
2
)
+ Pha tĩnh trên nền Oxid nhôm ( Al
2
O
3
)
+ Pha tĩnh trên nền cao phân tử hữu cơ ( polystyren, cellulo...)
+ Pha tĩnh trên nền mạch carbon.
Trong 4 loại này thì nền Silicagel đợc sử dụng nhiều nhất và pha tĩnh đợc
chế tạo trên nền này cũng có nhiều u việt hơn, nh khả năng chịu áp cao, độ tr-

- Phơng pháp so sánh
Đối với việc xác định nồng độ hoạt chất trong dịch sinh học, tính toán kết
quả dựa vào đờng chuẩn đợc xây dựng bằng cách chủ động cho chất chuẩn với
nồng độ khác nhau vào dịch sinh vật. Xử lý mẫu và đem chạy sắc ký.
Phần 2: thực nghiệm và kết quả
2.1 Nguyên vật liệu và phơng pháp nghiên cứu.
2.1.1 Nguyên vật liệu và hoá chất
*Nguyên vật liệu:
- Ketoprofen 99,3% (Đạt theo BP 2001).
- Ibuprofen 99,0 % (Đạt theo USP 24).
- Naproxen 99,6% (Đạt theo USP 24).
*Hoá chất:
- Acetonitril ( HPLC grade-Merck ).
11
- Methanol ( HPLC grade- Merck ).
- Acid acetic băng ( HPLC grade - Merck ).
- Triethylamin ( PA grade - Merck ).
*Dụng cụ:
- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao.
+ Bơm cao áp Merck- Hitachi L-6000.
+ Detector Merck-Hitachi L-4000 UV.
+ Máy tích phân Merck - Hitachi D-2500 chromato-integrator.
+ Van tiêm mẫu Rheohyne 1725 - USA.
- Máy quang phổ Beckman DU-640 spectrophotometer (Mỹ).
- Máy lọc nớc siêu sạch Elga (Anh).
- Cân phân tích Satorius (Đức).
- Ly tâm điện Jouan (Pháp).
- Máy siêu âm Branson (Mỹ).
- Máy lắc Labinco.
- Autopipet 10-100mcl, 100 - 1000mcl.

Trong sắc ký phân bố pha liên kết, pha động là một hệ dung môi phân
cực, hay dùng là các dung môi methanol, acetonitril, hay hỗn hợp của methanol,
acetonitril với nớc, với đệm.
13
Lọc
Dịch chiết
Ly tâm 15 phút(3000 vòng /phút)
Dịch lọc
Khí
Pha động
Hình 1: Sơ đồ xử lý mẫu huyết tơng ( chiết đơn )