BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGÔ THỊ QUỲNH NGA
XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
FELODIPIN TRONG HUYẾT TƯƠNG NHẰM
BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG
IN VIVO CỦA VIÊN NÉN FELODIPIN
TÁC DỤNG KÉO DÀI LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI - 2014
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGÔ THỊ QUỲNH NGA
XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
FELODIPIN TRONG HUYẾT TƯƠNG NHẰM
BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG
IN VIVO CỦA VIÊN NÉN FELODIPIN
TÁC DỤNG KÉO DÀI

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM THUỐC & ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ 60720410

Học viên Ngô Thị Quỳnh Nga
MỤC LỤC
Danh mục các kí hiệu và chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1. TỔNG QUAN 3
1.1. Đại cương về Felodipin 3
1.1.1. Công thức và tính chất lý hóa 3
1.1.2. Dược động học 4
1.1.3. Tác dụng dược lý 4
1.1.4. Chỉ định 5
1.1.5. Chống chỉ định 5
1.1.6. Liều lượng và cách dùng 5
1.1.7. Một số chế phẩm trên thị trường 6
1.2. Một số nghiên cứu định lượng Felodipin trong dịch sinh học 7
1.3. Tổng quan về phương pháp sắc ký khí khối phổ GC-MS 13
1.3.1. Khái niệm sắc kí khí 13
1.3.2. Nguyên tắc sắc ký khí-lỏng 13
1.3.4. Sơ đồ hệ thống sắc ký khí khối phổ 14
1.4. Phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học 17
1.4.1. Kỹ thuật xử lý mẫu 18
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
2.1. Nguyên vật liệu thiết bị 21
2.1.1. Nguyên liệu, hóa chất, dung môi 21
2.1.2. Dụng cụ, thiết bị 21
2.2. Đối tượng nghiên cứu 22

Amlodipin
DC
Dược chất
FEL
Felodipin
GC
Sắc kí khí
HQC
Mẫu kiểm chứng nồng độ cao (High Quality Control Sample)
HT
Huyết tương
HTT
Huyết tương trắng
IS
Nội chuẩn (Internal Standard)
LLOQ
Giới hạn định lượng dưới (Lower Limit of Quantitation)
LOD
Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)
LQC
Mẫu kiểm chứng nồng độ thấp (Low Quality Control Sample)
MeOH
Methanol
MQC
Mẫu kiểm chứng nồng độ trung bình (Medium Quality Control
Sample)
MS
Phương pháp phổ khối lượng
NIF
Nifedipin

Cách pha dung dịch chuẩn làm việc WS1 và WS2
25
Bảng 2.2
Cách chuẩn bị các mẫu đường chuẩn trong huyết tương
25
Bảng 2.3
Cách chuẩn bị mẫu QC
26
Bảng 3.1
Thể tích dung môi chiết toluen khảo sát
37
Bảng 3.2
Kết quả khảo sát dung môi chiết
38
Bảng 3.3
Kết quả độ chọn lọc – đặc hiệu của phương pháp.
44
Bảng 3.4
Kết quả xác định khoảng nồng độ tuyến tính.
45
Bảng 3.5
Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới
47
Bảng 3.6
Tỷ lệ thu hồi của IS
48
Bảng 3.7
Tỷ lệ thu hồi của FEL
49
Bảng 3.8

Hình 1.1
Công thức cấu tạo của Felodipin
3
Hình 1.2
Sơ đồ thiết bị sắc ký khí khối phổ
14
Hình 3.1
Sắc kí đồ hỗn hợp ba chất Fel, NIF, AMLO trong
methanol
31
Hình 3.2
Phổ khối của Felodipin
33
Hình 3.3
Phổ khối của Nifedipin
33
Hình 3.4
Sơ đồ tóm tắt quy trình xử lý mẫu FEL và IS trong
huyết tương bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng
36
Hình 3.5
Biểu đồ hiệu suất chiết của FEL theo thể tích chiết
39
Hình 3.6
Sắc kí đồ mẫu huyết tương trắng
41
Hình 3.7
Sắc kí đồ mẫu huyết tương trắng thêm IS
42
Hình 3.8

hợp với đặc thù điều trị các bệnh tim mạch là phải sử dụng thường xuyên, lâu dài mà
giảm được số lần dùng thuốc, giảm tác dụng bất lợi nhiều nhất như: viên nén, viên
nang, thuốc tiêm giải phóng kéo dài, giải phóng tại đích. Nhiều dược chất được dùng
trong các dạng bào chế này như: diltiazem, lercanidipin, nicardipin, nifedipin,
verapamil, metoprolol, felodipin…Ở nước ta, felodipin là một trong những thuốc đang
được sử dụng rộng rãi, là chất ức chế kênh calci chọn lọc trên mạch máu và đang được
nghiên cứu bào chế dạng thuốc giải phóng kéo dài. Để có thể đưa thuốc vào điều trị,
theo quy định của Cục Quản lý Dược Việt Nam: thuốc dạng rắn của 12 dược chất và
thuốc phóng thích có kiểm soát cần phải đánh giá sinh khả dụng hoặc tương đương
sinh học.
Để thực hiện được các nghiên cứu đánh giá SKD các thuốc, một trong những
nội dung quan trọng là xây dựng quy trình kỹ thuật chiết tách, xử lý mẫu và phân tích,
định lượng thuốc trong dịch sinh học (máu, huyết tương, nước tiểu ). Quá trình phân
tích thuốc trong dịch sinh học thường gặp nhiều khó khăn do nồng độ thuốc trong mẫu
2

thường rất thấp, mẫu có nhiều thành phần tạp chất gây ảnh hưởng tới quá trình phân
tích thuốc. Hơn nữa, sau khi vào cơ thể dược chất có thể bị chuyển hoá tạo thành nhiều
dẫn chất khác nhau, có cấu trúc và tính chất hoá lý tương tự với dược chất nên việc
phân tách để định lượng gặp rất nhiều khó khăn. Chính vì vậy, phương pháp phân tích
phải được xây dựng và thẩm định chặt chẽ theo những quy định riêng, để đảm bảo kết
quả thử nghiệm chính xác và tin cậy.
Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu phân tích thuốc trong dịch sinh học sử
dụng sắc ký khí (GC). Nhưng ở Việt Nam, vẫn chưa có nghiên cứu nào được công bố.
Để góp phần nghiên cứu SKD cuả một chế phẩm thuốc mới, chúng tôi tiến hành
thực hiện đề tài: “xây dựng phương pháp định lượng Felodipin trong huyết tương
nhằm bước đầu đánh giá sinh khả dụng in vivo của viên nén Felodipin tác dụng kéo
dài” với các mục tiêu sau:
1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng felodipin trong huyết tương
chó bằng GC-MS.

+ Thực tế không tan trong nước, tan tự do trong aceton, ethanol tuyệt đối,
methanol và methylen clorid.
+ Nhiệt độ nóng chảy dạng khan: 145
o
C [8], [22]
4

1.1.2. Dược động học
Hấp thu: Felodipin hấp thu gần như hoàn toàn qua đường tiêu hoá sau khi uống
nhưng chuyển hoá lần đầu ở gan và có sinh khả dụng tuyệt đối (SKD) khoảng 15%.
Nồng độ đỉnh trong huyết tương đạt được sau 3-5 giờ. Thức ăn ảnh hưởng đến tốc độ
hấp thu, không ảnh hưởng đến mức độ hấp thu.
Phân bố: Liên kết với protein huyết tương xấp xỉ 99%, chủ yếu là albumin. Thể
tích phân bố ở trạng thái ổn định là 10 L/kg.
Chuyển hóa: Felodipin chuyển hoá mạnh qua gan. Các chất chuyển hóa được
xác định không có hoạt tính gây giãn mạch.
Thải trừ: Bài xuất chủ yếu (khoảng 70% liều dùng) qua nước tiểu dưới dạng
các chất chuyển hoá không hoạt tính, phần còn lại chưa chuyển hoá được đào thải qua
phân, ít hơn 0,5% liều dùng được bài tiết dưới dạng không đổi trong nước tiểu. Thời
gian bán thải t
1/2
của felodipin là 11-16 giờ. Felodipin có độ thanh thải cao, trung bình
1200 mL/phút. Độ thanh thải giảm ở người cao tuổi và bệnh nhân suy giảm chức năng
gan. Không có nguy cơ tích lũy thuốc khi điều trị kéo dài [1] ,[13],[20],[25].
1.1.3. Tác dụng dược lý
Tác dụng hạ áp động mạch: Felodipin là thuốc chẹn kênh calci chậm có tính chất
chọn lọc thuộc nhóm dihydropyridin. Felodipin làm giảm trương lực động mạch (nhất
là trên tiểu động mạch), dẫn đến tác dụng giãn mạch gây hạ huyết áp [1], [25], [29].
Tác dụng chống đau thắt ngực: Felodipin cải thiện sự cân bằng trong cung và cầu
oxy của cơ tim. Lưu lượng động mạch vành cũng như lượng cung cấp oxy cho cơ tim

có nhiều chất béo hay carbohydrat). Với các dạng bào chế giải phóng kéo dài, chỉ được
nuốt nguyên viên cùng với nước, không nhai vỡ, không chia nhỏ viên thuốc [1]. 6

1.1.7. Một số chế phẩm trên thị trường
Bảng 1.1: Một số chế phẩm Felodipin trên thị trường Việt Nam [3], [6]
STT
Tên biệt
dược
Thành
phần
Dạng thuốc
Nhà sản xuất
1
Enfelo-5
Felodipin
Viên nén
phóng thích
chậm-5mg

Aegis., Ltd - Kibris
2
Felodil ER
Felodipin
Viên nén bao
phim giải
phóng chậm -
5 mg

Vellpharm Việt Nam – Việt
Nam

6
Plendil
Felodipin
Viên nén
phóng thích
chậm-5 mg
Astra Zeneca-Thụy Sĩ
7

1.2. Một số nghiên cứu định lượng Felodipin trong dịch sinh học
Trên thế giới, nhiều phương pháp đã được xây dựng để định lượng FEL trong dịch sinh học được tổng hợp ở bảng
1.2 và bảng 1.3 sau:
Bảng 1.2 Một số nghiên cứu định lượng Felodipin trong huyết tương bằng GC Mẫu
thử
Detect
or
Cột sắc ký
Chuẩn
nội
Điều kiện sắc ký
Phương pháp
chiết/Dung
môi chiết


-Khí mang: He
-Khoảng tuyến tính:0,8 – 4 ng/ml.
-LLOQ: 0,8 ng/ml.
-Thời gian phân tích: 15,5 phút

- Chiết lỏng-
lỏng
-Toluen:H
2
O
(1:1)
8

J.D- Y.
Dru và
Cs
[10] HT
người
MS
Cột mao
quản (30m
x0,2 mm, 5
µm) với pha
tĩnh
Methylsilicon
( HP-1,
Hewlett-


Takashi
Sakamoto
và Cs
[27]
HT
người
và HT
chó
MS
Cột mao
quản (12,5m
x 0,2 mm,
Ultra 1,
Hewlett-
Packard)

D6-
Felodipin
- Tiêm không chia dòng. Nhiệt độ buồng tiêm:
260
0
C
- Chương trình nhiệt độ: 220
0
C/ 0,6ph. Tăng
24

ECD
và MS
GC-ECD Cột
mao quản(
25m x
0,32mm)
GC-MS Cột
mao
quản(12m x
0,2mm, HP-
1, Hewlett-
Packard)
H165/04
- Tiêm chia dòng. . Nhiệt độ buồng tiêm:
330
0
C
- Chương trình nhiệt độ: 110
0
C/ 1ph. Tăng
10
0
C/ph đến 300
0
C.
- Khí mang: He. Khí bổ trợ:N
2
.
-Tốc độ: 40ml/ph
- Mảnh ion mẹ có m/z=238


Mẫu
thử
Detector
Cột sắc ký
Chuẩn nội
Điều kiện sắc ký
Phương pháp
chiết/Dung
môi chiết
Luis H.
Migliorança
và cộng sự
[16]
HT
người
MS/MS
Cột C18
(100 x
4,6mm,
3µm)
Nimodipin
- Pha động acetonitril : nước
(80:20) chứa 10 mM acid formic
- Tốc độ dòng 0,8mL/phút
- Thể tích tiêm mẫu 40 µl
-Chế độ ion hóa phun sương điện
tử ion dương
- Thời gian phân tích 5 phút
-Chiết lỏng-

C và 10
0
C.
-Thời gian phân tích là 5 phút và
thể tích tiêm là 2 µL.
-Chiết lỏng-
lỏng
-Methyl t-
butyl ether
(MTBE)
11

CA, USA)

-Khoảng tuyến tính: 0,1-20 ng/ml
(R
2
> 0,99)
-LOQ: 0,1 ng/ml
-LOD: 0,01 ng/ml
Hohyun kim
và Cs
[9]

HT
người
và HT
chó
Brownlee
guard (15

-Pha động : Methanol –đệm
Phosphat 0,05M, pH 3,5 (45:80)
-Tốc độ dòng 1,15ml/phút
- phát hiện ở bước sóng 220nm.
-Giới hạn phát hiện: 8ng/ml
-Chiết lỏng-
lỏng
Và chiết pha
rắn
12

mm x 3,2
mm,7 µm)
L.I. Yan-Yan
và Cs
[15]
HT
người
MS-MS
Cột
Nucleosil
C
18
(50 mm
x4,6 mm, 5
µm)
Diphenhidra

Quá trình rửa giải theo thứ tự điểm sôi tăng dần, ngoại trừ có tương tác đặc biệt
giữa chất phân tích và pha tĩnh. Pha động đưa chất phân tích ra khỏi cột đến detector.
Nhiệt độ cột dao động trong khoảng 50÷350 ℃ đảm bảo chất tan bay hơi và đẩy nhanh
quá trình rửa giải.
1.3.3. Nguyên tắc khối phổ
Khối phổ là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z) được
tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử mẫu. Tỷ số này biểu thị bằng đơn vị
khối lượng nguyên tử (1 đơn vị khối lượng nguyên tử bằng 1/12 khối lượng của carbon
12
C) hoặc bằng dalton (1 dalton Da bằng khối lượng của nguyên tử hydro).

14 1.3.4. Sơ đồ hệ thống sắc ký khí khối phổ

Hình 1.2: Sơ đồ thiết bị sắc ký khí khối phổ
1.3.4.1. Thiết bị sắc ký khí
 Khí mang
Pha động trong sắc ký khí hay còn gọi là khí mang giữ vai trò vận chuyển chất phân
tích dọc theo cột sắc ký và tiếp nhận các phân tử chất phân tích đã bị giữ lại trước đó và
tiếp tục tương tác với các phần khác của bề mặt pha tĩnh [3], [21].
Điều kiện của khí mang:
-Trơ về mặt hóa học
-Thuận lợi cho detector sử dụng
-Có khả năng giảm thiểu sự khuếch tán khí
-Tinh khiết
15

 Buồng tiêm mẫu

(on – column)
Mẫu được ngưng tụ ở
đầu cột, sau đó làm bay
hơi theo chương trình
nhiệt độ.
Tăng độ nhạy, giảm phân hủy
mẫu do nhiệt.

 Cột tách sắc ký:
Trong thực tế có nhiều cột tách dùng cho các mục đích phân tích khác nhau. Phổ biến
là cột nhồi và cột mao quản. Nhìn chung cột sắc ký cần đạt các yêu cầu sau:
-Đảm bảo trao đổi chất tốt giữa pha tĩnh và pha động nhờ việc tối ưu hóa
các thông số của phương trình Van Deemter.
-Độ giảm áp suất nhỏ với một tốc độ khí mang nhất định.
-Vật liệu dùng chế tạo cột phải có tính bền ở nhiệt độ cao.
16

Cột tách sắc ký được sử dụng trong GC- MS là cột mao quản. Có 2 loại cột mao
quản:
-Cột mao quản film mỏng: Pha tĩnh được tráng thành lớp mỏng ở thành mao quản
phía bên trong.
-Cột mao quản lớp mỏng: các hạt nhỏ chất hấp phụ (vai trò chất mang) gắn trên
mặt trong cột, sau đó phủ lớp mỏng pha tĩnh lên trên.
Một số pha tĩnh thường dùng:
 Các alcol: không phân cực, rất chọn lọc squalan, dầu parafin, polyethylen.
 Các loại silicon: độ phân cực tăng lên theo số lượng các nhón thế trong
siloxan.
 Các loại ete, este: phân cực .
 Các hợp chất chứa nitơ: rất phân cực.


ă
ng
tốc h
ướ
ng t
ớ
i anod và va ch
ạ
m v
ớ
i các phân t
ử
khí của m
ẫ
u phân tích đ
ượ
c tiêm
vào nguồn ion. N
ế
u các electron có đủ n
ă
ng l
ượ
ng, khi va ch
ạ
m nó s
ẽ
làm một
electron của phân t
ử

i khối l
ượ
ng của chúng.17 -K
ĩ
thuật ion hóa hóa học (Chemical ionization): Trong nguồn ion hóa hóa
học, các ion đ
ượ
c t
ạ
o ra thông qua s
ự
va ch
ạ
m của các phân t
ử
ch
ấ
t phân tích v
ớ
i
các ion s
ơ
c
ấ

i nhau và va ch
ạ
m v
ớ
i phân t
ử
trung hoà của
ch
ấ
t c
ầ
n phân tích t
ạ
o ra một môi tr
ườ
ng ion hóa qua một lo
ạ
t các ph
ả
n
ứ
ng. C
ả

hai d
ạ
ng ion âm và d
ươ
ng của ch
ấ

tr
ườ
ng m
ạ
nh (8-12 kV) gi
ữ
a hai đi
ệ
n c
ự
c đ
ể
t
ạ
o ra các ion t
ừ
các phân t
ử
pha khí.
Các phân t
ử
m
ẫ
u
ở
pha khí ti
ế
n g
ầ
n t

của phân t
ử
m
ẫ
u s
ẽ
chuy
ể
n vào
đi
ệ
n c
ự
c, k
ế
t qu
ả
là t
ạ
o thành cation gốc M
+
. Ion này b
ị
đi
ệ
n c
ự
c đ
ẩ
y v