Website: Email : Tel (: 0918.775.368
bộ GIáO DụC Và ĐàO TạO Bộ Y Tế
TRƯờNG ĐạI HọC DƯợC Hà NộI
Dơng Hải Thuận
xây dựng phơng pháp định lợng
azithromycin trong huyết tơng
luận văn thạc sĩ dợc học
Hà nội - 2008
bộ GIáO DụC Và ĐàO TạO Bộ Y Tế
TRƯờNG ĐạI HọC DƯợC Hà NộI
Dơng Hải Thuận
xây dựng phơng pháp định lợng
azithromycin trong huyết tơng
Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc - độc chất
Mã số: 607315
luận văn thạc sĩ dợc học
Ngời hớng dẫn: TS. Nguyễn Thị Kiều Anh
TS. Phạm Thị Thanh Hà
Hà nội - 2008

Lời cảm ơn
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thị Kiều Anh, TS.
Phạm Thị Thanh Hà đã tận tình hớng dẫn chỉ bảo, và tạo điều kiện thuận lợi
cho tôi trong suốt quá trìmh học tập và nghiên cứu thực hiện đề tài.
Tôi xin trân trọng cám ơn Ban giám hiệu nhà trờng, trân trọng cám ơn
các thầy giáo, cô giáo Phòng Đào tạo sau đại học, Bộ môn Phân tích cùng
các Bộ môn khác của trờng Đại học Dợc Hà Nội đã giảng dạy tận tình và
tạo điều kiện tốt cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trờng.

1.3.2. Phân tích định lợng: 8
1.4. Vài nét về HPLC với detector huỳnh quang. 9
1.5. V i nét về LC-MS. 10
Chơng 2: Đối tợng, nội dung và phơng pháp nghiên cứu.
13
2.1. Đối tợng nghiên cứu. 13
2.2. Hoá chất và thiết bị 13
2.3. Phơng pháp nghiên cứu: 14
2.3.1. Khảo sát xây dựng quy trình định lợng AZI trong dung môi
bằng HPLC detector huỳnh quang
15
2.3.2. Khảo sát xây dựng quy trình định lợng AZI trong HT bằng
LC-MS.
15
2.3.2.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn. 15
2.3.2.2. Xử lý mẫu 16
2.3.2.3. Khảo sát điều kiện để định lợng AZI. 16
2.3.2.4 Thẩm định phơng pháp phân tích 16
2.3.2.5. Xác định hiệu suất chiết 18
2.3.3. Định lợng thăm dò AZI trong HT ngời uống AZI 18
2.3.4. Phân tích số liệu thực nghiệm 18
Chơng 3: Kết quả
19
3.1. Xây dựng quy trình xử lý mẫu 19
3.2. Khảo sát xây dựng quy trình định lợng AZI trong dung môi bằng
HPLC detector huỳnh quang.
21
3.2.1.Điều kiện chạy sắc ký để định lợng AZI 21
3.2.2. Khảo sát điều kiện tạo dẫn xuất huỳnh quang 22


Kiến nghị 51
Tài liệu tham khảo
Phụ lụcBẢNG CH TH CH C CÚ Í Á CHỮ VIẾT TẮT
APCI :
Ion hóa học ở áp xuất thường (Atmospheric pressure
chemical ionization)
AZI : Azithromycin
CLA : Clarithromycin
C
max
:
Nồng độ thuốc tối đa
ESI
Ion hóa bằng phun điện tử (Electronsray Ionization)
FMOC-Cl 9-fluorenylmethyloxycarbonyl chlorid
HPLC :
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid
Chromatography)
HT :
Huyết tương
IS :
Nội chuẩn (Internal standard)
LC-MS :
Sắc ký lỏng ghép khối phổ (Liquid Chromatography-Mass
Spectrometry)
LOD :
Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

Trang
1.1
Một số nghiên cứu định lợng AZI trong dịch sinh học bằng HPLC
6
2.1
Danh mục hóa chất- thuốc thử-chất chuẩn
13
3.1
Quy trình tạo dãy mẫu chuẩn và dẫn xuất hóa
22
3.2
Kt qu kho sỏt tớnh phự hp ca h thng HPLC.
27
3.3
S ph thuc gia t s din tớch pic v n ng AZI
28
3.4
Kt qu kho sỏt tớnh phự hp ca h thng LC-MS
38
3.5
S ph thuc gia t s din tớch pic v n ng AZI trong HT
39
3.6
Kt qu xỏc nh ỳng ca phng phõn tớch
41
3.7
Kt qu xỏc nh lp trong ng y c a phộp phõn tớch
42
3.8
Kt qu xỏc nh hiu sut chit

Sắc ký đồ mẫu có AZI và CLA
26
3.8
Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa tỷ số diên tích pic và nồng độ
AZI
28
3.9
Sắc ký đồ AZI 0,5
à
g/ml và CLA 5
à
g/ml
29
3.10
Phổ khối AZI
30
3.11
Phổ khối CLA
31
3.12
Phổ khối ROXI
31
3.13
Sắc ký đồ AZI và ROXI chạy cột Thermo C18(50x2,1mm; 5
à
m)
34
3.14
Sắc ký đồ AZI và ROXI chạy cột Zorbax C18 SB (150x4,6; 5
à

trở thành một động lực thúc đẩy các nhà bào chế tìm ra công thức thuốc tốt
nhất, an toàn nhất cho một loại hoạt chất
Từ cuối năm 2003, Viện Kiểm nghiệm đã triển khai một mô hình thử
nghiệm để đánh giá tơng đơng sinh học của thuốc nhằm xây dựng nên một qui
chế cho đánh giá tơng đơng sinh học [7]. Những quy chế này sẽ làm tiền đề
cho các nghiên cứu sinh khả dụng, tơng đơng sinh học và dợc động học của
thuốc, góp phần quản lý chặt chẽ, nâng cao chất lợng thuốc sản xuất trong nớc.
Chúng ta đã có một số nghiên cứu về lĩnh vực này [1], [3], [7]. Tuy nhiên, con
ngời đợc đào tạo về lĩnh vực phân tích sinh học này rất ít do đó để triển khai và
phát triển nghiên cứu sinh khả dụng và tơng đơng sinh học của thuốc không
những phải đầu t vào trang thiết bị mà còn phải chú trọng vào đào tạo con ngời.
Phơng pháp phân tích để định lợng thuốc và chất chuyển hóa của nó
trong dịch sinh học đóng vai trò quyết định trong đánh giá và diễn giải các số
liệu nghiên cứu sinh khả dụng, tơng đơng sinh học và dợc động học của thuốc.
Để làm đợc điều này, các phơng pháp phân tích sinh học dựa trên kỹ thuật hóa
lý và sinh học hiện đại đợc phát triển và ứng dụng rộng rãi trong đó có phơng
pháp HPLC đợc sử dụng rất phổ biến. Các phơng pháp phân tích sinh học phải
đợc thẩm định trớc để đảm bảo kết quả thu đợc là chính xác, đáng tin cậy. Qui
định một qui trình và các tiêu chí thẩm định phơng pháp phân tích sinh học đã
đợc thảo luận ở rất nhiều hội nghị quốc tế lớn về công nghiệp dợc phẩm.
Trong thực tế chúng tôi nhận thấy thuốc của Việt Nam sản xuất không
thua kém về sinh khả dụng so với chế phẩm nổi tiếng cùng loại của nớc ngoài
(các chế phẩm nghiên cứu đều có tơng đơng sinh học với chế phẩm đối chiếu)
1

nhng giá thành chênh lệch nhau gấp 10 lần thậm chí 30 40 lần. Về giá
bán cũng đúng với trờng hợp chế phẩm azithromycin, trong khi viên Azithrin
250 của Pfizer giá khoảng 80.000 90.000 đ/ viên, viên Usmax 250 của
Dong In Dang Pharmaco (Hàn Quốc) giá khoảng 34.000 đ/ viên, ... thì viên
Azithromycin 250 của Traphaco hoặc Azimax 250 của Imexpharm giá chỉ

CH
3
O
OH
CH
3
OH
O
H
3
C
O
O
CH
3
OCH
3
CH
3
CH
3
N
H
3
C
CH
3
HO
OH
H

(dung dịch 1%
trong ethanol) .
* Dợc động học [4].
Hp thu: AZI hp thu nhanh v sinh kh dng ng ung khong
40%. c bit thuc t nng trong t bo cao hn so vi trong HT vỡ vy
dựng iu tr vi khun ni bo tt. Thc n lm gim hp thu thuc.
Phõn b: Phõn b rng khp trong c th, ch yu vo cỏc mụ nh
phi, amidan, tin lit tuyn, bch cu ht v i thc bo..., cao hn trong
mỏu nhiu ln, tuy nhiờn nng thuc trong h thng thn kinh trung ng
rt thp.
Chuyn hoỏ: Mt lng nh AZI b kh methyl trong gan, v c
o thi qua mt dng khụng bin i v mt phn dng chuyn hoỏ.
Thi tr: Khong 6% liu ung thi tr qua nc tiu trong vũng 72
gi di dng khụng bin i.
*Cơ chế và tác dụng dợc lý [4].
AZI tỏc ng bng cỏch gn kt vo tiu n v 50S ca ribosom v
qua ú c ch s tng hp protein ca vi khun. AZI cú ph khỏng khun
rng v sau khi ung, nng nh trong HT t c sau 2-3 gi.
AZI là một kháng sinh mới có hoạt phổ rộng, có tác dụng tốt trên các vi
khuẩn gram(+) (nh Streptococcus, Pneumococcus, Staphilococcus aureus)
và gram(-) (nh Haemophilus influenzae, Neissria gonorrhoeae). Có tác
dụng vừa phải trên các vi khuẩn Escherichia coly, Samonella enteritis,
Samonella typhi, Klebsiella.
* Tác dụng không mong muốn [4].
- AZI đợc dung nạp tốt, tỷ lệ tác dụng không mong muốn thấp. Hay gặp
nhất là chứng rối loạn tiêu hoá (khoảng 10%) với các triệu chứng nh buồn nôn,
4

đau bụng, co cứng cơ bụng, nôn, đầy hơi, ỉa chảy, nhng thờng nhẹ và ít xẩy
ra hơn so với erythromycin.

HT ngời
Acquity UPLC
TM
BHE C
18
( 50
x 2,1 mm;
1,7àm Waters)
- Dung môi chiết: Diethyl ether
- Pha động: MeCN- NH
4
CH
3
COO 0,05M
- Chuẩn nội: ROXI
- Tốc độ dòng: 0,35ml/phút
- Detector: MS
- Đờng chuẩn: 1-1000ng/ml
- LOQ: 1ng/ml
[18]
Huyết
thanh ngời
Al
2
O
3
- Pha động: Na
3
PO
4

0,05M (71:29);
pH=5,9
- Chuẩn nội: CLA
- Tốc độ dòng: 2,5ml/phút
- Detector huỳnh quang.
- Chất dẫn xuất huỳnh quang: FMOC-Cl.
- Đờng chuẩn: 1-500ng/ml
[14]
Huyết
thanh ngời
Chromegabond
alkylphenyl 5àm
-Pha động: MeCN-MeOH-NH
4
COOCH
3
-
NaHClO
3
(53:10:22:23)
- Detector: điện hóa.
-LOQ: 90ng/ml
[16]
HT ngời
Waters C8
(100 x 4,6mm ;
3,5 àm)
- Dung môi chiết: Tert-butyl metyl ether
- Pha động: MeCN- đệm phosphat
(36,5:63,5) pH=7,40

-MeCN-MeOH pH 6,5-7,5
- Tốc độ dòng: 1ml/phút
- Detector : điện hóa
- Đờng chuẩn: 25-1000ng/ml
*Các phơng pháp khác
- Phơng pháp Cực phổ, mẫu thử là dịch sinh học [20].
- Phơng pháp vi sinh:
Xử lý mẫu: pha loãng HT bằng ethanol (1:1), ủ ở 4
o
C , ly tâm 12.000
vòng/phút trong 15 phút, lấy dịch nổi ở trên cô ở 55
o
C đến thể tích ban đầu của
mẫu. Định lợng trong môi trờng thạch với chủng vi khuẩn chỉ thị là
Micrococcus luteus NCTC 8440, khoảng nồng độ tuyến tính từ 0,005 đến
1mg/L[11].
1.3. Nguyên tắc chung về phơng pháp phân tích bằng HPLC [2].
Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn
và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng- rắn). Mẫu phân tích đợc chuyển lên cột
tách dới dạng dung dịch. Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích đợc
phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh. Trong hỗn hợp các chất phân tích,
do cấu trúc phân tử và tính chất lý hóa của các chất khác nhau nên khả năng t-
ơng tác của chúng với pha động và pha tĩnh khác nhau. Do vậy, chúng di
chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau.
1.3.1. Phân tích định tính.
Một trong các đại lợng đặc trng cho sự tách sắc ký của các chất trong
một hệ pha đã chọn là thời gian lu của các chất. Nghĩa là trong một hệ pha và
trong các điều kiện tách HPLC đã chọn thì mỗi chất phân tích sẽ có thời gian l-
u khác nhau và cố định. Chính đại lợng này là một tính chất hay thông số để
định tính các chất trong một hỗn hợp mẫu.

*Phơng pháp chuẩn hóa diện tích:
Hàm lợng phần trăm của một thành phần trong mẫu phân tích đợc xác
định bằng tỷ số (tính bằng phần trăm) của diện tích pic của thành phần đó và
tổng diện tích của tất cả các thành phần có mặt trong mẫu( trừ pic dung môi,
thuốc thử và pic các chất có hàm lợng nhỏ hơn giới hạn phát hiện).
Hai yêu cầu cần đáp ứng khi sử dụng phơng pháp này:
- Tất cả các thành phần trong mẫu phân tích cần đợc rửa giải, xuất hiện
trân sắc ký đồ.
- Detector của thiết bị có đáp ứng nh nhau đối với tất cả các thành phần
có mặt trong mẫu.
Do hai yêu cầu trên rất khó đợc đáp ứng đầy đủ nên kết quả thờng
không tin cậy. Để tăng độ tin cậy ngời ta dùng hệ số đáp ứng của detector đối
với từng thành phần của mẫu.
1.4. Vài nét về HPLC với detector huỳnh quang.
Quang phổ huỳnh quang ngoài việc áp dụng để định tính, định lợng các
chất trên máy đo quang phổ huỳnh quang thì nó còn đợc dùng để chế tạo bộ
phận phát hiện của máy HPLC. Detector huỳnh quang đóng vai trò nh một máy
huỳnh quang kết nối với sắc ký lỏng để phát hiện về phân tích định tính và
định lợng các chất sau khi ra khỏi cột sắc ký. Detector huỳnh quang có độ
chọn lọc và nhạy hơn (có thể đến 1000 lần) detector hấp thụ UV. HPLC-
detector huỳnh quang có thể phát hiện tới 10
-12
g. Do có độ nhạy cao nên
detector huỳnh quang đợc sử dụng trong phân tích vết trong kiểm soát môi tr-
ờng, giám định pháp y, định lợng hoạt chất trong dịch sinh học...
Tùy theo các chất cần định lợng có khả năng phát quang hay không mà
tiến hành định lợng trực tiếp hay gián tiếp thông qua dẫn chất có khả năng phát
quang của nó. Ngời ta có thể cho chất cần phân tích phản ứng với thuốc thử để
tạo dẫn chất phát huỳnh quang mạnh trớc khi đến detector huỳnh quang. Việc
tạo dẫn xuất này có thể tiến hành trớc hoặc sau khi chất cần phân tích đi qua

- Bộ nạp mẫu: Có đờng kết nối với đầu ra của máy sắc ký lỏng.
- Bộ nguồn ion hóa: Nhiệm vụ ion hóa các phân tử, nguyên tử của mẫu.
Có rất nhiều kỹ thuật ion hóa khác nhau nhng hiện nay thờng sử dụng kỹ thuật
ion hóa bằng phun điện tử (ESI) và ion hóa hóa học ở áp suất thờng (APCI)
Trong đề tài này chúng tôi sử dụng kỹ thuật ESI. ESI có vai trò chuyển
ion từ pha lỏng sang pha khí. Kỹ thuật này đợc mô tả nh sau: Các phân tử dung
10

môi và hóa chất sau khi ra khỏi cột sắc ký sẽ đợc đa vào một ống mao
quản cao thế 2 đến 5 KV (điện thế dơng ở đầu kim tạo ion dơng, điện thế âm ở
đầu kim tạo ion âm và đợc quyết định tùy chất khảo sát). Dới tác động của điện
thế cao có sự tạo thành những hạt nhỏ mang điện. Sau khi qua ống mao quản
dới tác động của luồng khí nitơ nóng các phân tử dung môi từ từ bay hơi, các
hạt mang điện tích nhỏ dần. Sau đó các ion dơng hay âm tạo thành đợc đa vào
bộ phận tách ion qua một cửa rất nhỏ, dung môi và khí nitơ bị bơm hút ra
ngoài [21].
- Bộ phân tích khối: có nhiệm vụ tách các ion có trị số m/z khác nhau
thành từng phần riêng biệt.
- Bộ phận phát hiện ion: Có nhiệm vụ chuyển các ion đã đến thành tín
hiệu điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ.
-Bộ xử lý dữ liệu: Tín hiệu điện đợc khuyếch đại trớc khi chuyển thành
tín hiệu phục vụ sử lý dữ liệu theo yêu cầu khác nhau: Ghi phổ, định lợng...
* Một số kỹ thuật LC-MS
- Kỹ thuật phân tích toàn thang (full scan)
Là kỹ thuật phân tích mà phổ khối sẽ đa ra toàn bộ ion sinh ra từ ion
gốc, ta có một sắc đồ toàn ion (Total Ion Chromatogram). Kỹ thuật này có độ
nhiễu đờng nền rất lớn nên độ nhạy kém [9].
- Kỹ thuật phân tích chọn lọc ion (SIM)
Đây là kỹ thuật ngay từ đầu chỉ cho phổ kế nhận diện một ion và ghi sắc
đồ theo thời gian. Lúc này sắc đồ chỉ ghi tất cả các mũi có chứa ion đó. Kỹ

Acetonitril Baker - Mỹ HPLC nhà sản xuất 99,9%
Methanol
Baker - Mỹ HPLC nhà sản xuất
99,8%
Natri carbonat Vel - Bỉ P.A
Acid boric
Vel - Bỉ P.A
Kali clorid Vel - Bỉ P.A
Amoni acetat Vel - Bỉ P.A
FMOC-Cl Aldrich-Mỹ P.A
Chất chuẩn
Azithromycin
Viện kiểm nghiệm
TƯ - VN
97,27%
Roxithromycin
Viện kiểm nghiệm
TƯ - VN
97,73%
Clarithromycin
Viện kiểm nghiệm
TƯ - VN
97,82%
Chế phẩm
HT ngời
Viện huyết học và
truyền máu TƯ -VN
Viên nén
Zithromax
Pfizer-USA

*Chuẩn bị dung dịch:
14

- Dung dịch chuẩn AZI nồng độ lần lợt là 5, 10, 25, 50, 100 àg/ml
trong methanol
- Dung dịch nội chuẩn CLA (IS) 50 àg/ml
- Dung dịch dẫn xuất huỳnh quang FMOC-Cl: 0,5mg/ml
- Dung dịch đệm Borat 0,1M pH 7,4
* Khảo sát điều kiện chạy sắc ký.
Khảo sát về cột, nhiệt độ cột, pha động, tốc độ dòng, detector huỳnh
quang (bớc sóng kích thích, bớc sóng phát xạ)
* Khảo sát điều kiện tạo dẫn xuất huỳnh quang.
- Khảo sát nhiệt độ phản ứng tạo dẫn xuất: Giữ nguyên các điều kiện
phản ứng khác, chỉ thay đổi nhiệt độ từ 30 đến 70
o
C, cách 10
o
C
- Khảo sát thời gian phản ứng: Giữ nguyên nhiệt độ phản ứng tối u là
50
o
C, thay đổi thời gian phản ứng trong khoảng từ 30 đến 60 phút, cách 10
phút.
* Đánh giá một số thông số kỹ thuật của phơng pháp.
- Tính chọn lọc.
- Tính phù hợp của hệ thống sắc ký.
- Khoảng tuyến tính.
- Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lợng (LOQ).
2.3.2. Khảo sát xây dựng quy trình định lợng AZI trong HT bằng
LC-MS.

Chuẩn bị mẫu:
- HT trắng.
- HT có AZI.
- HT có IS.
16

- HT có AZI và IS.
Xử lý mẫu và tiến hành phân tích
* Tính phù hợp của hệ thống sắc ký
Chuẩn bị mẫu chuẩn có AZI và IS trong pha động. Tiến hành sắc ký 6
lần liên tiếp, xác định độ lệch chuẩn tơng đối của các thông số: thời gian lu, tỷ
số diện tích pic.
* Khoảng nồng độ tuyến tính, hàm đáp ứng
Chuẩn bị các mẫu HT trắng, thêm AZI và IS tạo thành các mẫu có nồng
độ AZI từ 0,02 - 2 àg/ml, xử lý mẫu theo sơ đồ hình 3.1 và tiến hành phân tích.
*LOD và LOQ
LOD là nồng độ thấp nhất của chất phân tích có thể xác định đợc nhng
không nhất thiết phải định lợng đợc trong điều kiện thí nghiệm cụ thể. LOD đ-
ợc coi là nồng độ chất phân tích gây nên sự tăng tín hiệu đáp ứng 3 lần so với
đáp ứng tín hiệu của mẫu trắng (S/N=3). LOQ là nồng độ thấp nhất của chất
cần phân tích có thể định lợng đợc với độ đúng và độ chính xác phù hợp. LOQ
đợc chấp nhận nếu đáp ứng của chất phân tích phải ít nhất gấp 10 lần đáp ứng
của mẫu trắng. Trong phơng pháp sắc ký độ nhiễu của đờng nền có thể thay
cho tín hiệu của mẫu trắng.
Tiến hành xử lý các mẫu HT trắng và mẫu chuẩn có nồng độ AZI thấp
dần và tiến hành phân tích.
* Độ đúng
Chuẩn bị các mẫu AZI trong HT trắng ở 3 nồng độ khảo sát, mỗi nồng
độ làm 5 mẫu, xử lý mẫu và tiến hành phân tích, so sánh giá trị trung bình giữa
các lần định lợng của mỗi nồng độ với giá trị thực có trong mẫu, tính theo lợng