43

TẠP CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, Số 63, 2010 XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT VÀ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
STIGMASTEROL TRONG CÂY RÁY (Alocasia odora (Roxb.) C. Koch)
BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Trần Hữu Dũng
Trường Đại học Y Dược, Đại học Huế

Đặng Thị Ngọc Hoa
Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế
TÓM TẮT
Quy trình chiết xuất stigmasterol toàn phần từ bột dược liệu ráy (Alocasia odora
(Roxb.) C. Koch) trên soxhlet trong 5 giờ trong dung môi chloroform được thực hiện và kiểm
soát bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng khi triển khai trên hệ dung môi n-hexan/ethyl axetat
(8:2), xác định vết bằng thuốc thử Liebermann-Burchard. Hàm lượng stigmasterol được xác
định bởi phương pháp HPLC nhanh chóng và có độ nhạy cao, trên cột C8 với nhiệt độ cột 30
0
C
± 1, hệ dung môi pha động là acetonitril/đệm phosphate (93:7) pH 4,8 với tốc độ dòng 1ml/phút,
thể tích tiên 20µl, bước sóng phát hiện tại 195nm. Phương pháp HPLC cho tương thích cao với
các thông số sắc ký có RSD < 2%. Khoảng tuyến tính của nồng độ stigmasterol được khảo sát
từ 10–300ppm (r = 0,9995). Phương pháp được thẩm định cho độ chính xác và độ đúng thích
hợp với tỷ lệ phục hồi của stigmasterol từ bột ráy đạt 95,2%, giới hạn định lượng là 10ppm.

I. Đặt vấn đề
Cây ráy (Alocasia odora (Roxb.) C. Koch) hay còn gọi là môn bạc hà, ráy bạc
hà, bạc hà; đôi khi còn gọi là ráy dại, dã vu. Thân rễ ráy được dùng làm thuốc trong
phạm vi kinh nghiệm nhân dân, chủ yếu chữa bệnh ngoài da như mề đay đơn ngứa, lỡ

C, sau
đó trung hòa bằng KOH 20%/MeOH đến pH > 7, chiết trong ete dầu hoả và loại nước
bằng Na
2
SO
4
khan, cô dịch ete thu được cắn. Hòa tan cắn trong 1ml CHCl
3
để chấm sắc
ký.
Dung dịch chuẩn: cân 11.4mg stigmasterol hòa tan trong 1ml CHCl
3
Triển khai trên bản Silica gel F
254
với các hệ dung môi khác nhau: n-hexan/ethyl
acetate (9:1), n-hexan/ethyl acetate (8:2), n-hexan/ethyl acetate (7:3), CHCl
3
/MeOH
(98:2) và CHCl
3
/CH
3
COCH
3
(8:2) để chọn hệ pha động thích hợp nhất [2]. Phát hiện
peak phytosterol bằng thuốc thử Liebermann-Burchard.
2.3.Xây dựng quy trình chiết stigmasterol toàn phần bằng phương pháp chiết
Soxhlet
Cân 5g bột ráy, ngâm lạnh 12 giờ với các hệ dung môi chiết CHCl
3

f
=0,64 nằm trong khoảng thích hợp
(0,3 – 0,7). Peak stigmasterol cho màu xanh lục đặc trưng của nhóm phytosterol với
thuốc thử Liebermann-Burchard.

Hình 1. Các hệ dung môi triển khai trên TLC với thuốc thử Liebermann-Burchard
(a) CHCl
3
/CH
3
COCH
3
(8:2), (b) CHCl
3
/MeOH (98:2), (c) n-hexan/ethyl acetate (9:1), (d) n-
hexan/ethyl acetate (8:2) và (e) n-hexan/ethyl acetate (7:3)
Kết quả khảo sát các dung môi chiết xuất stigmasterol toàn phần trong bột ráy
bằng chiết Soxhlet cho thấy sau 3h chiết xuất, dịch chiết CHCl
3
thu được hàm lượng
hoạt chất nhiều nhất, thể hiện bằng cường độ peak stigmasterol đậm hơn so với tín hiệu
peak của dịch CHCl
3
/MeOH (1:1) và (2:1) trong cùng điều kiện chiết xuất. Thời gian
chiết kiệt tối ưu nhất khi dùng CHCl
3
là 6h, thể hiện bằng việc không thể phát hiện vết
của stigmasterol trên bả dược liệu thu được.
Quá trình khảo sát các thông số, điều kiện sắc ký thích hợp cho quá trình định
lượng stigmasterol bằng HPLC được thể hiện trong Hình 2.

3.1. Thẩm định phương pháp HPLC
- Tính tương thích hệ thống
Bảng 1. Khảo sát tính tương thích của hệ thống sắc ký
Lần đo
Thời gian
lưu (phút)

Hệ số phân
giải
(1)
Số đĩa lý
thuyết
Hệ số bất
đối xứng

Diện tích
peak

1 14,71 1,57 10712 1,10 10573308
2 14,64 1,55 10701 1,13 10568175
3 14,62 1,56 10671 1,11 10584571
47

4 14,63 1,56 10718 1,09 10581461
5 14,64 1,55 10679 1,10 10582939
6 14,59 1,57 10726 1,09 10578733
Mean 14,64 1,56 10701 1,10 10578198
RSD (%) 0,26 0,57 0,2 1,36 0,06
(1)
: hệ số phân giải giữa peak stigmasterol với peak trước nó.

Độ chính xác được khảo sát bằng sự lặp lại hàm lượng stigmasterol xác định trên
6 mẫu thử với lượng cân và điều kiện sắc ký đã chọn, kết quả được trình bày trong Bảng 2.
Bảng 2. Khảo sát độ chính xác của phương pháp
Mẫu đo Lượng bột (g) Hàm lượng (%)
1 5,0039 0,0089
2 5,0053 0,0089
3 5,0017 0,0087
4 5,0008 0,0085
5 5,0042 0,0089
6 5,0056 0,0089
Trung bình 5,00358 0,0089
RSD(%) 1,85
Hàm lượng stigmasterol tự do toàn phần có trong thân rễ ráy là 0,009%, phù hợp
với các giá trị tham khảo [5], [6] với độ lệch chuẩn tương đối RSD là 1,85%. Phương
pháp có độ chính xác tốt.
49

- Độ đúng
Độ đúng được xác định bằng tỷ lệ phục hồi khi thêm một lượng chuẩn chính xác
vào 6 mẫu bột ráy, tiến hành phân tích hàm lượng stigmasterol tổng của 6 mẫu dược liệu
thêm chuẩn đó với điều kiện chạy sắc ký đã chọn, kết quả được trình bày trong Bảng 3.
Bảng 3. Khảo sát độ đúng của phương pháp
Mẫu đo
Lượng bột
(g)
Lượng S
(*)
chuẩn
thêm vào (ppm)
Tổng lượng S

Quy trình định lượng stigmasterol trong dịch chiết thuỷ phân được thực hiện bằng
HPLC trên cột C8, nhiệt độ cột 30
0
C ± 1, pha động ACN/đệm phosphate 0,025M (93:7),
pH 4,8, tốc độ dòng 1ml/phút, thể tích tiêm 20μl, λ
max
=195nm. Phương pháp phân tích
cho tính tương thích hệ thống cao (RSD < 2%) và được đánh giá thẩm định tốt, tính đặc
hiệu, độ tuyến tính (10 - 300ppm), độ chính xác và độ đúng đạt yêu cầu với giới hạn
phát hiện là 10ppm. Hàm lượng stigmasterol trong bột dược liệu ráy khô là 0,0089%.
Do đó, phương pháp này có thể áp dụng để đánh giá chất lượng của cây ráy nói riêng và
các dược liệu chứa phytosterol nói chung.
50

TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1]. Đỗ Tất Lợi, Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. NXB Y học và TW, 2007.
[2]. Bộ Y tế, Quy chế đánh giá tính an toàn và hiệu lực thuốc cổ truyền, Tạp chí Dược học,
số 5, (1996), 3.
[3]. Lê Ngọc Kính, Nghiên cứu thành phần hoá học của củ ráy ở thành phố Huế, NXB Y
học Thực hành, Bộ Y tế, số 521, 2005.
[4]. Lê Ngọc Kính, Tác dụng hạ cholesterol trong huyết thanh thỏ của dịch chiết từ thân rễ
cây ráy,Tạp chí Dược học, số 374, (2007), 11.
[5]. Lê Thị Bích Hiền, Xây dựng quy trình chiết xuất phytosterol từ thân rễ cây ráy
(Alocasia Odora Roxb.), Luận văn tốt nghiệp, Trường Đại học Y Dược Huế, 2010.
[6]. Ellen Odeen Thesis, Investigation of phytosterols in Alocasia Odora Roxb. by reversed
phase HPLC, A study made in Hue City, Vietnam, (2009), 23.
[7]. World Health Organisation, General guidelines for Methodologies on Research and
Evaluation of Traditional Medicine, 1998.
[8]. Ludwing huber, Validation of Analytical Methods, Review and Strategy, (2001), 13.