BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ NGỌC THẮNG
XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
ĐỊNH LƯỢNG LANSOPRAZOL
TRONG HUYẾT TƯƠNG
ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC- ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 60720410

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Ngọc Chiến
TS. Trần Nguyên Hà
HÀ NỘI 2013
LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, trước tiên tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc
đến thầy, cô hướng dẫn là TS. Nguyễn Ngọc Chiến và TS. Trần Nguyên Hà-
Trường Đại học Dược Hà Nội, thầy cô đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình ngay từ
khi tôi mới nhận đề tài.
Tôi xin cảm ơn Đảng uỷ, chỉ huy trung tâm Kiểm nghiệm nghiên cứu
Dược Quân đội- Cục Quân y đã quan tâm, tạo thời gian và mọi
điều kiện
thuận lợi nhất để tôi hoàn thành khoá học và luận văn. Xin chân thành cảm ơn

1.1.4. Một số nghiên cứu về sinh khả dụng của LPZ 12
1.2. YÊU CẦU CƠ BẢN CỦA PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MẪU
SINH HỌ
C 15
1.2.1. Tính đặc hiệu 15
1.2.2. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính 15
1.2.3. Độ đúng và độ chính xác 16
1.2.4. Giới hạn định lượng (LLOQ) 16
1.2.5. Độ ổn định của mẫu thử 17
1.2.6. Tỷ lệ thu hồi 17
1.2.7. Mẫu chuẩn kiểm tra 17 1.2.8. Phân tích mẫu thử 17
1.3. SINH KHẢ DỤNG VÀ ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG 17
1.3.1. Phân tích dược động học 18
1.3.2. Tính toán sinh khả dụng 19
1.3.2.1. Dùng đơn liều 19
1.3.2.2. Dùng đa liều 19
Chương 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU21
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 21
2.1.1. Dược phẩm 21
2.1.2. Chất chuẩn, hóa chất, dung môi 21
2.1.3. Dụng cụ, máy móc 21
2.1.4. Đối tượng nghiên cứu 22
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22
2.2.1. Khảo sát điều kiện sắc ký 22
2.2.2. Dung dị
ch chuẩn và chuẩn nội 23
2.2.3. Phương pháp chiết 24

c hiệu 42
3.3.2. Thẩm định độ tuyến tính 44
3.3.3. Thẩm định độ đúng, độ lặp lại 44
3.3.4. Giới hạn định lượng (LLOQ) 45
3.3.5. Độ ổn định của LPZ 47 3.3.5.1. Độ ổn định của dung dịch chuẩn gốc LPZ 47
3.3.5.2. Độ ổn định của LPZ trong huyết tương 47
3.3.6. Hiệu suất chiết 48
3.3.6.1. Hiệu suất chiết của LPZ 48
3.3.6.2. Hiệu suất chiết của chuẩn nội PPZ 49
3.3.7. Định lượng LPZ trong huyết tương chó được cho uống LPZ 49
3.4. NGHIÊN CỨU SKD VÀ CỦA VIÊN NANG LPZ 30 mg TRÊN
CHÓ 50
3.4.1. Phân tích mẫu huyết tương chó được uống LPZ 50
3.4.2. Phân tích và so sánh các thông số dược động học 53
3.4.2.1. Phân tích và so sánh C
max
55
3.4.2.2. Phân tích và so sánh AUC
0- t
56
3.4.2.3. Phân tích và so sánh AUC
0- ∞
57
3.4.2.4. Phân tích và so sánh T
max
58
Chương 4. BÀN LUẬN 60

MeOH : Methanol
MP : Mobile phase
(Pha động)
OPZ : Omeprazol
PA : Purity analysis
(Tinh khiết phân tích)
PPI : Proton Pump Inhibitor
(Ức chế bơm proton)
PPZ : Pantoprazol
RP- HPLC : Reverse phase high performance liquid chromatography
(Sắc ký lỏng pha
đảo hiệu năng cao) RPZ : Rabeprazol
RSD : Relative standard deviation
(Độ lệch chuẩn tương đối)
SKD : Sinh khả dụng
SKĐ : Sắc ký đồ
TBME : Tert- butyl methyl ether
TĐSH : Tương đương sinh học
T
max
: Thời gian đạt nồng độ đỉnh
USP : The United states pharmacopeia
(Dược điển Mỹ)
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2. 1. Dãy nồng độ thẩm định độ tuyến tính 25
Bảng 2. 2. Bố trí thí nghiệm đánh giá SKD của viên nang LPZ 30 mg 27
Bảng 3. 1: Kết quả tính tương thích của hệ thống 37


Bảng 3. 18: Kết quả phân tích T
max
58
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1. 1: Cấu trúc phân tử của lansoprazol 3
Hình 1. 2: Đường cong nồng độ thuốc trung bình theo thời gian giữa
Lansor và Lanfast 14
Hình 3. 1: SKĐ dung dịch chuẩn hỗn hợp với điều kiện sắc ký 1 31
Hình 3. 2: SKĐ dung dịch chuẩn hỗn hợp với điều kiện sắc ký 2 32
Hình 3. 3: SKĐ dung dịch chuẩn hỗn hợp với điều kiện sắc ký 3 33
Hình 3. 4: SKĐ dung dịch chuẩn hỗ
n hợp với ĐK đệm phosphat 0,01M, pH
7,0: ACN (60: 40, tt/tt) 33
Hình 3. 5: SKĐ dung dịch chuẩn hỗn hợp với ĐK đệm phosphat pH 7,3: ACN
(60: 40) 34
Hình 3. 6: SKĐ dung dịch chuẩn hỗn hợp với ĐK đệm phosphat pH 7,6 :
ACN (60: 40, tt/tt) 34
Hình 3. 7: SKĐ dung dịch chuẩn hỗn hợp với ĐK đệm phosphat pH 8,0 :
ACN (60: 40, tt/tt) 35
Hình 3. 8: SKĐ dung dịch chuẩn hỗn hợp với ĐK đệm phosphat pH 8,0: ACN
(70: 30, tt/tt) 35
Hình 3. 9: SKĐ dung dịch chuẩn hỗn hợp với Đ
K đệm phosphat pH 8,0 :
ACN (65: 35, tt/tt) 36
Hình 3. 10: SKĐ mẫu HT trắng xử lý bằng phương pháp tủa protein 38
Hình 3. 11: SKĐ mẫu HT xử lý bằng phương pháp tủa protein 38
Hình 3. 12: SKĐ mẫu HT trắng được chiết bằng hỗn hợp diethylether-
dicloromethan (70: 30) 40
Hình 3. 13: SKĐ mẫu HT được chiết bằng hỗn hợp diethylether-

lớn của thuốc generic đối với bệnh nhân tuy nhiên vấn đề đặt ra là hiệu quả
điều trị của thuốc generic có giống như thuốc phát minh hay không và đánh
giá bằng tiêu chí nào.
Các nhà lâm sàng thường dựa vào theo dõi tác dụng lâm sàng để so
sánh hiệu quả của thuốc, tuy nhiên phương pháp này nhiều khi rất khó để đo
lường và kiểm soát. Ngày nay, nhiều quốc gia đã áp dụng tiêu chí đánh giá
tương
đương sinh học để đảm bảo tác dụng điều trị của thuốc generic so với
thuốc phát minh tương ứng. Đây là nghiên cứu bắt buộc đối với tất cả các
thuốc generic trước khi lưu hành ở các nước phát triển như Mỹ, Úc, Cộng
đồng Châu Âu…
Tại Việt Nam, theo thống kê của Cục Quản lý dược, tính đến 31 tháng
12 năm 2008 thuốc sản xuất trong nước có 491 hoạt chất thì có 9727 số
đăng
ký, thuốc nước ngoài có 909 hoạt chất với 10339 số đăng ký [6]. Việc kiểm
tra đánh giá chất lượng thuốc chủ yếu vẫn dựa trên sự kiểm tra các tính chất
lý hóa theo tiêu chuẩn định sẵn. Tuy nhiên việc đánh giá in vitro này không
phản ánh thực sự hiệu quả trị liệu của một thuốc trong cơ thể vì mức độ hấp 2
thu dược chất từ các chế phẩm dùng đường uống hoặc dùng tại chỗ có thể bị
ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố. Để đảm bảo tính an toàn và hiệu quả trong việc
sử dụng thuốc cho người bệnh, Bộ Y tế đã đưa ra các qui định liên quan đến
đánh giá tương đương sinh học của các chế phẩm thuốc. Trong đó phương
pháp định lượng thuốc trong dịch sinh h
ọc là công cụ quan trọng trong đánh
giá sinh khả dụng và tương đương sinh học các chế phẩm bào chế.
Để góp phần nghiên cứu sinh khả dụng và đánh giá tương đương sinh
học của các chế phẩm chứa Lansoprazol, đề tài: "Xây dựng phương pháp

Hình 1. 1: Cấu trúc phân tử của lansoprazol
LPZ là một thuốc trong nhóm ức chế bơm proton (Proton Pump
Inhibitors- PPIs) (H
+
/K
+
- ATPase), là dẫn chất benzimidazol có tác dụng
chống tiết acid dạ dày [2], [4], [39].
1.1.1. Tính chất
LPZ là bột kết tinh màu trắng hay hơi nâu, nhiệt độ nóng chảy khoảng
166
0
C. Rất dễ tan trong dimethylformamid, tan trong methanol, hơi tan trong
ethanol, khó tan trong ethyl acetat, dicloromethan, rất khó tan trong ether,
thực tế không tan trong hexan và nước.
LPZ bị phân huỷ trong dung dịch nước. Tốc độ phân hủy trong môi
trường nước tăng lên khi pH giảm. Nửa đời phân hủy trong môi trường nước
ở 25
0
C là khoảng 0,5 giờ tại pH 5,0 và là khoảng 18 giờ tại pH 7,0 [2], [35],
[39].
1.1.2. Dược lý và cơ chế tác dụng 4
Do không bền trong môi trường acid nên LPZ được bào chế dưới dạng
viên nang kiểm soát giải phóng chứa các pellet LPZ được bao tan trong ruột.
Sự hấp thu LPZ chỉ bắt đầu sau khi pellet qua dạ dày. LPZ được hấp thu
nhanh, trung bình nồng độ LPZ đạt đỉnh trong máu sau khoảng 1,7 giờ. Sau
khi uống một liều đơn LPZ từ 15 mg đến 60 mg, nồng độ đỉnh trong máu

max
đạt được sau khi
uống khoảng 1,7 giờ và sinh khả dụng đạt trên 80%. Ở người khỏe mạnh,
trung bình (± SD) nửa đời trong máu là 1,5 (± 1) giờ. Cả C
max
và AUC đều
giảm khoảng 50% đến 70% nếu LPZ được dùng 30 phút sau ăn, LPZ không
bị tác động bởi thức ăn khi dùng trước bữa ăn [2], [4], [39].
Phân bố: 5
Có 97% LPZ liên kết với protein huyết tương. Sự liên kết này là cố
định trên khoảng nồng độ LPZ từ 0,05 đến 5 µg/ml [2], [4], [39].
Chuyển hóa:
LPZ được chuyển hóa mạnh ở gan. Hai chất chuyển hóa chính được
tìm thấy trong huyết tương là dẫn chất hydroxy sulfinyl và sulfon của LPZ.
Các dạng chất chuyển hóa có rất ít hoặc không có tác dụng chống tiết acid.
Nửa đời thải trừ trong huyết tương của LPZ ít hơn 2 giờ, tuy nhiên tác dụng
chống tiết acid kéo dài trên 24 gi
ờ. Vì vậy, nửa đời thải trừ trong huyết tương
của LPZ không phản ánh thời gian của sự chống tiết acid dịch vị [2], [4], [39].
Thải trừ:
Trong một nghiên cứu, sau khi uống một liều đơn LPZ có gắn C14,
khoảng 1/3 liều uống được thải trừ qua nước tiểu và 2/3 được thải trừ qua
phân. Thải trừ LPZ bị kéo dài ở người bị bệnh gan nặng, nhưng không thay
đổi ở ng
ười suy thận nặng, do vậy cần giảm liều đối với người bị bệnh gan
nặng [2], [4], [39].
Tương tác thuốc:

2), giá trị R
f
của LPZ và domperidon lần lượt là 0,22 và 0,76 [7].
• Phương pháp HPLC
- Dược điển Mỹ 32 (USP 32) định lượng LPZ bằng phương pháp HPLC
với điều kiện như sau: Pha động là hỗn hợp gồm nước : ACN : triethylamin
(60 : 40 : 1) đã điều chỉnh pH về 7,0 bằng acid phosphoric; Detector UV đặt ở
285 nm; Cột sắc ký C18 25 cm x 4,6 mm, 5 µm. Dung dịch chuẩn, dung dịch
thử và dung dịch chuẩn nội (4’- ethoxyacetophenon) được chuẩn bị trong hỗn
hợp gồ
m: nước - ACN - triethylamin (60 : 40 : 1), được điều chỉnh pH về 10,0
bằng acid phosphoric [35].
- Zeinab Abdelaziz El-Sherif và cộng sự đã định lượng LPZ trong các
chế phẩm bằng RP - HPLC, phát hiện bằng detector UV ở 280 nm với pha
động là hỗn hợp dung dịch kali dihydrophosphat 0,05 M : MeOH : ACN (5 :
3 : 2), điều chỉnh pH về 7,0 bằng dung dịch KOH 1 M; tốc độ dòng 1,5
ml/phút; khoảng tuyến tính là 2 - 20 µg/ml, độ đúng của phương pháp là
100,61%, giới hạn định lượng là 0,55 µg/ml [15].
- Prasanna Reddy và cộng sự đã đưa ra phương pháp định lượng LPZ và
PPZ trong viên nén chứa LPZ và PPZ bằng phương pháp HPLC với cột C18,
150 x 4,6 mm, 5 µm; pha động là hỗn hợp gồm ACN - đệm phosphat (60 : 40) 7
điều chỉnh pH về 7,0; tốc độ dòng 1,0 ml/phút; detector UV ở bước sóng 260
nm. Phương pháp có giới hạn phát hiện là 2,5 ng/ml với PPZ và 2,7 ng/ml với
LPZ. Giới hạn định lượng là 8,2 ng/ml với PPZ và 9,8 ng/ml với LPZ [31] .
- S.Muthu Kumar

và cộng sự đã sử dụng pha động là: Đệm dinatri


8
từ 1,5 đến 3 ng/ml, LLOQ từ 5 đến 10 ng/ml) là do nền mẫu đơn giản, ít yếu
tố ảnh hưởng đến sự tách LPZ qua cột sắc ký.
Ngoài ra, LPZ cũng được định lượng bằng một số phương pháp khác:
Phương pháp UV - VIS [21], [22], phương pháp cực phổ [12], phương pháp
đo động học phản ứng [29].
1.1.3.2. Định lượng trong huyết tương
- Maryam Noubarani và cộng sự đã nghiên cứu phương pháp định lượng
các PPIs: Omeprazol (OPZ), PPZ, LPZ và RPZ trong huy
ết tương bằng
HPLC với cột C18, 150 mm x 4,6 mm; 5 µm; pha động là hỗn hợp gồm đệm
phosphat (Kali dihydrophosphat) 10mM và ACN (53: 47) đã điều chỉnh pH
đến 7,3 bằng triethylamin; với tốc độ dòng là 1 ml/phút. Phát hiện bằng
detector UV ở 290 nm với PPZ và 285 nm với LPZ; thể tích tiêm mẫu là 50
µl; thời gian phân tích cho một quy trình là 10 phút.
+ Định lượng OPZ và LPZ thì PPZ được sử dụng làm chuẩn nội, trong
định lượng PPZ và RPZ thì LPZ được dùng làm chuẩn nội.
+ Phương pháp có khoảng tuyến tính với PPZ là 20- 4000 ng/ml và 20-
3000 ng/ml với LPZ. Ph
ần trăm tìm lại là ≥ 80%, giới hạn định lượng dưới là
20 ng/ml với cả PPZ và LPZ. Sai số trong các ngày và trong một ngày nhỏ
hơn 9,2%.
+ Phương pháp chiết:
Lấy 1ml mẫu huyết tương vào ống thủy tinh 15 ml, thêm 50 µl dung
dịch chuẩn nội và 4 ml tert-butyl methyl ether, lắc trong 3 phút sau đó ly tâm
3000 vòng/phút trong 3 phút. Lớp dung môi hữu cơ được chuyển vào ống
thủy tinh 6 ml và bốc hơi ở 37
0
C dưới dòng khí nitơ

Phương pháp chiết: Thêm 1ml dung dịch chuẩn nội pha trong MeOH
vào 0,5 ml huyết tương, trộn đều trong 30 giây, ly tâm 2100 vòng trong 10
phút, tiêm 100 µl lớp dịch phía trên vào hệ thống sắc ký [9].
Phương pháp trên sử dụng pH của pha động là 3,3, trong khi LPZ dễ bị
phân hủ
y khi ở pH thấp, do vậy sử dụng pH của pha động bằng 3,3 là chưa
hợp lý.
- K. Borner cùng cộng sự cũng đã nghiên cứu định lượng LPZ trong
huyết tương bằng phương pháp HPLC. Phương pháp sử dụng dung dịch p-
hydroxybenzoic acid n-butyl ester có nồng độ 10 mg/l trong nước làm chuẩn
nội. Dung dịch gốc LPZ được pha trong dung dịch dinatri carbonat 0,1 M.
Các dung dịch huyết tương chuẩn và thử được pha loãng từ dung dịch gốc
LPZ và huyết tương trắ
ng. Các dung dịch trên được bảo quản ở -27
0
C và rã
đông ngay trước khi sử dụng. 10
+ Điều kiện sắc ký được sử dụng là: Cột pha đảo C 18 5µm, 25 cm x 4,0
mm; nhiệt độ cột ở nhiệt độ phòng. Pha động là hỗn hợp gồm 400 ml ACN,
600 ml nước và 1 ml n-octylamine, điều chỉnh đến pH 7,0 bằng khoảng 0,3
ml acid phosphoric đặc; detector UV ở 283nm; tốc độ dòng 0,9 ml/phút; thể
tích tiêm 40 µl, nhiệt độ buồng bơm mẫu đặt ở 10
0
C.
Với điều kiện trên, thời gian lưu của LPZ là 9,8 phút và 18,0 phút với
chuẩn nội, thời gian phân tích cho một quy trình là 25 phút.
+ Phương pháp chiết: 500 µl huyết tương được trộn đều với 100 µl dung

tt/tt), lắc trong 5 phút, sau đó ly tâm 2000 vòng ở 6
0
C trong 10 phút. Lấy 4ml
lớp dung môi hữu cơ, bốc hơi dung môi đến khô dưới áp suất giảm tại nhiệt
độ môi trường. Cắn được hòa tan trong 500 µl pha động và tiêm 100 µl vào
hệ thống sắc ký [20].
Phương pháp này có nhược điểm là sử dụng hệ pha động và cách tiến
hành phức tạp (chạy gradient tốc độ dòng), hóa chất khó kiếm. Chạy với tốc
độ dòng cao (2,5 ml/phút), thời gian lưu của LPZ dài (13,2 phút), thời gian
phân tích cho một mẫu dài (30 phút).
- Đ
iều kiện sắc ký khác định lượng LPZ trong huyết tương:
Cột pha đảo, 250mm x 4,6 mm.
Pha động: Dung dịch NaClO
4
0,5 M- ACN- MeOH (6: 3: 1, tt/tt/tt). Sử
dụng OPZ làm chuẩn nội [25].
- LPZ cũng có thể định lượng trong huyết tương bằng phương pháp
LC/MS, LC/MS/MS [10], [32], [38].
1.1.3.3. Một số phương pháp chiết LPZ trong huyết tương khác
- Tủa protein bằng ACN [11], sau đó ly tâm 15000 vòng trong 10 phút ở
5
0
C, lấy lớp dịch trong để tiêm sắc ký [32].
- Thêm 100 µl dung dịch ethyl p- hydroxylbenzoat trong methylen clorid
(chuẩn nội) và 5 ml hỗn hợp diethyl ether- methylen clorid (6: 4, tt/tt) vào 1ml
mẫu huyết tương. Chiết bằng cách lắc trong 5 phút, sau đó ly tâm 3000 vòng
trong 10 phút. Lấy 4 ml lớp dung môi hữu cơ, chuyển vào ống thủy tinh và
bốc hơi đến khô ở 40
0

được công bố. Trên thế giới, có một số nghiên cứu về SKD và tương đương
sinh học (TĐSH) của LPZ được công bố như sau:
- Noubarani và cộng sự đã nghiên cứu SKD của viên nang chứa LPZ, lựa
chọn nam giới tình nguyện tuổi t
ừ 20- 45, cân nặng từ 54- 83 kg cho nghiên
cứu. Người tình nguyện đều khoẻ mạnh và không dùng bất kỳ thuốc nào khác
trong quá trình thử nghiệm, nghiên cứu được thông qua hội đồng y đức. Các
mẫu máu được lấy đến 12h sau khi uống một liều đơn LPZ 30 mg (với tên
thương mại Zoton FasTab
®
). Mẫu máu được tách lấy phần huyết tương, bảo
quản ở - 80
0
C tới khi phân tích. Kết quả các thông số dược động học thu được
như sau: với n = 8, T
max
là 1,76 ± 0,71 giờ; C
max
là 1132 ± 340 ng/ml và
AUC
0- ∞
là 2326 ± 1153 (ng.h/ml) [27].
- Một nghiên cứu đánh giá TĐSH giữa Lanfast
®
(thuốc đối chiếu) và
Lansor
®
(thuốc thử), thiết kế nghiên cứu như sau: 26 nam giới tình nguyện,
khoẻ mạnh, độ tuổi từ 18- 45, độ tuổi trung bình 25,1 ± 7,2, cân nặng trung
bình là 76,7 ± 10,9 kg với khoảng cân nặng từ 56,6- 97,4 kg. Tất cả người