BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN VĂN MẠNH
XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH
LƢỢNG FELODIPIN TRONG HUYẾT
TƢƠNG BẰNG GC-MS
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2014
1

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN VĂN MẠNH
XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH
LƢỢNG FELODIPIN TRONG HUYẾT
TƢƠNG BẰNG GC-MS
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Ngƣời hƣớng dẫn :
1. PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh
2. DS Ngô Thị Quỳnh Nga
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn hóa phân tích và độc chất - Đại
học Dƣợc Hà Nội


Nguyễn Văn Mạnh
1 MỤC LỤC

Danh mục các kí hiệu và chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN 3
1.1. Đại cƣơng về Felodipin 3
1.1.1. Công thức và tính chất lý hóa [5] 3
1.1.2. Dƣợc động học [2] [10] 4
1.1.3. Tác dụng dƣợc lý 4
1.1.4. Chỉ định [2] 4
1.1.5. Chống chỉ định [2] 5
1.1.6. Một số chế phẩm trên thị trƣờng 5
1.2. Một số nghiên cứu định lƣợng Felodipin trong dịch sinh học 6
1.3. Tổng quan về phƣơng pháp sắc ký khí khối phổ GC-MS 10
1.3.1. Khái niệm [3] 10
1.3.2. Nguyên tắc sắc ký khí-lỏng [3] 10
1.3.3. Sơ đồ hệ thống sắc ký khí [3] 11
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16
2.1. Nguyên vật liệu thiết bị 16
2.1.1. Nguyên liệu, hóa chất, dung môi 16
2.1.2. Dụng cụ, thiết bị 16
2.2. Nội dung nghiên cứu 16
2

DC
Dƣợc chất
FEL
Felodipin
GC
Sắc kí khí
HQC
Mẫu kiểm chứng nồng độ cao (High Quality Control Sample)
HT
Huyết tƣơng
HTT
Huyết tƣơng trắng
IS
Nội chuẩn (Internal Standard)
LLOQ
Giới hạn định lƣợng dƣới (Lower Limit of Quantitation)
LOD
Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)
LQC
Mẫu kiểm chứng nồng độ thấp (Low Quality Control Sample)
MeOH
Methanol
MQC
Mẫu kiểm chứng nồng độ trung bình (Medium Quality Control
Sample)
MS
Phƣơng pháp phổ khối lƣợng
NIF
Nifedipin
RSD

19
Bảng 2.2
Cách chuẩn bị các mẫu đường chuẩn trong huyết tương
20
Bảng 2.3
Cách chuẩn bị mẫu QC
20
Bảng 3.1
Thể tích dung môi chiết toluen khảo sát
30
Bảng 3.2
Kết quả khảo sát dung môi chiết
31
Bảng 3.3
Kết quả độ chọn lọc – đặc hiệu của phương pháp.
37
Bảng 3.4
Kết quả xác định khoảng nồng độ tuyến tính.
38
Bảng 3.5
Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới
40
Bảng 3.6
Kết quả thẩm định độ đúng, độ chính xác trong ngày
41
Bảng 3.7
Độ đúng, độ chính xác khác ngày
42
Bảng 3.8
Tỷ lệ thu hồi của IS

Sơ đồ thiết bị sắc ký khí

11
Hình 1.3
Sơ đồ hệ thống máy khối phổ

14
Hình 3.1
Sắc kí đồ hỗn hợp ba chất Fel, NIF, AMLO trong
methanol
25
Hình 3.2
Phổ khối của FEL
27
Hình 3.3
Phổ khối của NIF
28
Hình 3.4
Sơ đồ tóm tắt quy trình xử lý mẫu FEL và IS trong
huyết tương băng phương pháp chiết lỏng-lỏng
29
Hình 3.5
Biểu đồ hiệu suất chiết của FEL theo thể tích chiết
32
Hình 3.6
Sắc kí đồ mẫu huyết tương trắng

34
Hình 3.7
Sắc kí đồ mẫu huyết tương trắng có pha IS

Hơn nữa, sau khi vào cơ thể dƣợc chất bị chuyển hoá tạo thành nhiều dẫn chất khác
nhau, có cấu trúc và tính chất hoá lý tƣơng tự với dƣợc chất nên việc phân tách để định
lƣợng gặp rất nhiều khó khăn. Chính vì vậy, phƣơng pháp phân tích phải đƣợc xây
dựng và thẩm định chặt chẽ theo những quy định riêng, để đảm bảo kết quả thử nghiệm
chính xác và tin cậy.
2

Nhằm đóng góp một quy trình phân tích thuốc trong dịch sinh học đơn giản, hiệu
quả và kinh tế, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Xây dựng phương pháp định
lượng Felodipin trong huyết tương bằng sắc kí khí” với các mục tiêu sau:
Xây dựng và thẩm định phƣơng pháp định lƣợng Felodipin trong huyết tƣơng bằng
GC-MS

3

Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1. Đại cƣơng về Felodipin
1.1.1. Công thức và tính chất lý hóa [5]
- Công thức hóa học: Hình 1.1: Công thức cấu tạo của Felodipin
- Công thức phân tử: C
18
H
19
Cl

sức và giảm số cơn đau thắt ngực ở ngƣời bệnh đau thắt ngực ổn định [2].
Giãn mạch não nên tăng máu vào não, đƣợc dùng cho những ngƣời tai biến mạch
máu não [1].
1.1.4. Chỉ định [2]
- Bệnh tăng huyết áp.
- Điều trị dự phòng cơn đau thắt ngực ổn định.
5

1.1.5. Chống chỉ định [2]
- Quá mẫn với dihydropyridin.
- Nhồi máu cơ tim cấp.
- Suy tim mất bù hoặc chƣa kiểm soát đƣợc.
- Đau thắt ngực không ổn định.
- Phụ nữ có thai.
- Không dùng felodipin cho trẻ em vì hiệu quả và khả năng dung nạp thuốc ở trẻ
em chƣa đƣợc xác định.
1.1.6. Một số chế phẩm trên thị trƣờng
Bảng 1.1: Một số chế phẩm chứa Felodipin trên thị trƣờng Việt Nam
STT
Tên biệt dƣợc
Thành phần
Dạng thuốc
Nhà sản xuất
1
Enfelo-5
Felodipin
Viên nén phóng
thích chậm-5mg

Aegis., Ltd - Kibris

phóng có kiểm
soát
Công ty TNHH Dƣợc phẩm
Vellpharm Việt Nam - VIỆT
NAM
6

1.2. Một số nghiên cứu định lƣợng Felodipin trong dịch sinh học
Trên thế giới, nhiều phƣơng pháp đã đƣợc xây dựng để định lƣợng FEL trong dịch sinh học đƣợc tổng hợp
ở bảng 1.2 và bảng 1.3 sau:
Bảng 1.2 Một số nghiên cứu định lƣợng Felodipin bằng GC
Tài liệu
Mẫu
thử
Detector
Cột sắc ký
Chuẩn
nội
Điều kiện sắc ký
Dung môi
chiết

Martin
Ahnoff
và Cs(
1984)
[9]

HT
ngƣời

( HP-1,
Hewlett- - Nhiệt độ buồng tiêm: 300
0
C
- Chƣơng trình nhiệt độ:
220
0
C/ 0,6 ph. Tăng 15
0
C/ph đến 300
0
C.
Duy trì 10 ph
- Khí mang: He. Tốc độ: 0,365 ml/ph.
- Chế độ ion hóa (Áp suất nguồn ion hóa:
Toluen

7

Packard) 2,0.10
-3

220
0
C/ 0,6 ph. Tăng 24
0
C/ph đến 290
0
C.
- Khí mang: He. Áp suất 0,25 kg/cm
2

- Kỹ thuật ion hóa phun sƣơng điện tử ion
dƣơng ( PIEI) với mức năng lƣợng electron
:70 eV
-Nhiệt độ nguồn ion hóa : 300
0
C
- Chế độ chọn lọc ion (SIM) với mảnh ion mẹ
có m/z=238
n-hexan:
toluene
(4:1) Ryota
Nishioka
và
Cs(1991)
[11]

HT

.
- Tốc độ: 40 ml/ph.
- Mảnh ion mẹ có m/z=238

Bảng 1.3: Một số nghiên cứu định lƣợng Felodipin bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao.
Tài liệu
Mẫu thử
Detector
Cột sắc ký
Chuẩn
nội
Điều kiện sắc ký
Dung môi
chiết
Luis H.
Migliorança
và cộng sự
(2005)
[8]

HT
ngƣời

MS/MS

Cột C18
(100 x 4,6
mm, 3 µm)

Nimodipin

acid formic 0,1% (75/25, v/v).
- Tốc độ dòng 0,25 mL/phút.
- Cột và khay lấy mẫu tự động đƣợc
duy trì ở nhiệt độ 25
0
C và 10
0
C.
- Thời gian phân tích là 2 phút và MTBE
9

Littelfall,
CA, USA)
thể tích tiêm là 2 µL.
Hohyun kim
và Cs
(2003)
[6]

HT
ngƣời và
HT chó MS-MS
C8
Capcell Pak

thuộc vào tính bay hơi của chất tan- tức là điểm sôi.
Hệ số phân bố x/p phụ thuộc vào áp suất hơi của chất tan và hệ số hoạt độ của chất tan.
Vì vậy, có thể tách đƣợc hai chất tan có áp suất hơi nhƣ nhau nhƣng có hệ số hoạt độ
trong pha tĩnh lỏng khác nhau.
Quá trình rửa giải theo thứ tự điểm sôi tăng dần, ngoại trừ có tƣơng tác đặc biệt giữa
chất tan và pha tĩnh. Pha động đƣa chất tan ra khỏi cột đến detector. Nhiệt độ cột dao
động trong khoảng 50÷350  đảm bảo chất tan bay hơi và đẩy nhanh quá trình rửa
giải.

11

1.3.3. Sơ đồ hệ thống sắc ký khí [3] Hình 1.2: Sơ đồ thiết bị sắc ký khí
 Khí mang
Pha động trong sắc ký khí hay còn gọi là khí mang giữ vai trò vận chuyển chất phân
tích dọc theo cột sắc ký và tiếp nhận các phân tử chất phân tích đã bị giữ lại trƣớc đó
và tiếp tục tƣơng tác với các phần khác của bề mặt pha tĩnh.
Điều kiện của khí mang:
-Trơ về mặt hóa học.
-Thuận lợi cho detector sử dụng.
-Có khả năng giảm thiểu sự khuếch tán khí.
-Tinh khiết .

12

 Buồng tiêm mẫu
Buồng tiêm mẫu là nơi khi mẫu đƣợc bơm vào sẽ hóa hơi và bị lôi cuốn theo dòng
khí mang.

Tăng độ nhạy, giảm phân hủy
mẫu do nhiệt.
Cột nhồi
Bay hơi nhanh
(flash
vaporixation)
Mẫu tiêm vào vùng có
nhiệt độ cao hơn 20 – 50
0
C so với nhiệt độ cột.
Mẫu bay hơi nhanh, có thể xảy
ra phân hủy mẫu do nhiệt độ cao.
Thẳng vào cột
(on – column)
Mẫu đƣợc tiêm thẳng vào
đầu cột nhồi.
Tăng độ nhạy, giảm phân hủy
mẫu do nhiệt. 13  Cột tách sắc ký:
Trong thực tế có nhiều cột tách dùng cho các mục đích phân tích khác nhau. Phổ
biến là cột nhồi và cột mao quản. Nhìn chung cột sắc ký cần đạt các yêu cầu sau:
o Đảm bảo trao đổi chất tốt giữa pha tĩnh và pha động nhờ việc tối ƣu hóa
các thông số của phƣơng trình Van Deemter.
o Độ giảm áp suất nhỏ với một tốc độ khí mang nhất định.
o Vật liệu dùng chế tạo cột phải có tính bền ở nhiệt độ cao.

có mặt trong khí mang tạo ra ion âm, cho nên tạo ra sự thay đổi cƣờng độ dòng ở mạch
điện ngoài. Sự thay đổi này tạo ra tín hiệu, nó đƣợc đƣợc khuếch đại và ghi lại. Ngƣời
ta thƣờng dùng argon chứa 10% methan làm khí mang thay cho nitơ để tăng độ nhạy
của ECD.

- Detector khối phổ (MS): Phát hiện và định lƣợng các chất phân tích dựa vào ion phân
tử và các ion mảnh của chúng. Detector MS đáp ứng với hầu hết các hợp chất hữu cơ.
+ Nguyên tắc:
Khối phổ là kỷ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lƣợng và điện tích của ion (m/z)
đƣợc tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử mẫu. Tỷ số này biểu thị
bằng đơn vị khối lƣợng nguyên tử (1 đơn vị khối lƣợng nguyên tử bằng 1/12
khối lƣợng của carbon
12
C) hoặc bằng dalton (1 dalton Da bằng khối lƣợng của
nguyên tử hydro).
+ Sơ đồ khối của máy khối phổ:

Hình 1.3:Sơ đồ hệ thống máy khối phổ
Hệ chân không (áp suất 10
-3
÷10
-6
Pa)
Nạp mẫu


16

Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu thiết bị
2.1.1. Nguyên liệu, hóa chất, dung môi
- Chất chuẩn :
Felodipin (FEL): Chuẩn làm việc, hàm lƣợng 99,76%, độ ẩm 0,01%.
- Chất chuẩn nội:
+ Nifedipin (NIF): Chuẩn làm việc, hàm lƣợng 99,51%, độ ẩm 0,02%.
+ Amlodipin (AMLO): Chuẩn làm việc, hàm lƣợng 99,71%, độ ẩm 0,00%.
- Dung môi hóa chất:
MeOH, toluen, n-hexan, đạt tiêu chuẩn tinh khiết dùng cho GC-MS.
- Huyết tƣơng trắng không có Felodipin: của viện Huyết học- Truyền máu Trung
ƣơng.
2.1.2. Dụng cụ, thiết bị
- Máy sắc ký khí khối phổ Brucker, Mỹ.
- Cân phân tích Sartorius (d= 0,1 mg), Đức.
- Máy ly tâm EBA 20 – Hettich, Đức.
- Thiết bị bay hơi dung môi bằng khí nitơ có gia nhiệt Reacti-Therm III (Thermo
scientific), Mỹ.
- Máy lắc xoáy Vortex ZX
3
VELP Scientifica (3000 vòng/phút), Đức.
- Tủ lạnh sâu ( -40
o
C), Sanyo MDF -236.
- Micropipet 1-10 µl, 10-100 µl, 100-1000 µl, Nhật.
- Bình định mức, dụng cụ thủy tinh (class A) dùng trong phân tích.
2.2. Nội dung nghiên cứu