BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ LAN ANH

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
CEFIXIM TRONG NƯỚC THẢI BẰNG
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2013
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ LAN ANH


Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các
thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi
cho tôi trong thời gian tôi học tập tại trường và thực hiện khóa luận.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè, những người luôn động viên,
khích lệ, tạo động lực cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận
này.
Hà Nội, ngày 8 tháng 5 năm 2013
Sinh viên
Nguyễn Thị Lan Anh
MỤC LỤC
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3
1.1
TỔNG QUAN VỀ CEPHALOSPORIN 3
1.1.1 Lịch sử ra đời, nguồn gốc 3
1.1.2 Công thức cấu tạo, phân loại và phổ tác dụng 3
1.1.3 Đặc tính của các cephalosporin nghiên cứu 5
CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 19
3.1
XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH 19
3.1.1 Khảo sát phương pháp xử lí mẫu 19
3.1.1.1 Lựa chọn loại dung môi xử lí mẫu 19
3.1.1.2. Lựa chọn tỉ lệ dung môi xử lí mẫu 21
3.1.2 Khảo sát quy trình phân tích 23
3.1.2.1 Khảo sát lựa chọn cột sắc kí 24
3.1.2.2 Khảo sát thành phần pha động và tốc độ dòng 25
3.1.2.3. Khảo sát thể tích tiêm mẫu 26
3.1.3 Quy trình phân tích 27
3.2.ĐÁNH
GIÁ PHƯƠNG PHÁP 29
3.2.1.Độ thích hợp của hệ thống 29
3.2.2 Độ đặc hiệu 30
3.2.3 Độ tuyến tính 32
3.2.4. Độ đúng 34
3.2.5 Khảo sát độ chính xác 36
3.2.5.1 Độ lặp lại 36
3.2.5.2 Độ chính xác trung gian 36
3.2.6.Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
38
3.2.6.1.Giới hạn phát hiện 38
3.2.5.2 Giới hạn định lượng 39
3.3.BÀN
LUẬN 39
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 42
4.1.

MeOH
Methanol
mg
miligram
ml
mililit
PA
Pro analysis (tinh khiết phân tích)
SĐK
Số đăng kí
USP 32
The United States Pharmacopoeia (Dược điển Mỹ 34)
UV - VIS
Ultraviolet and visiable absorption Spectrophotometry (phổ hấp
thụ tử ngoại khả kiến) DANH MỤC CÁC BẢNG
STT
Tên bảng
Trang
Bảng 1.1. Phổ tác dụng của các cephalosporin 4
Bảng 1.2. Đặc tính của các cephalosporin nghiên cứu trong đề tài 5

Bảng 3.1. Khảo sát lựa chọn dung môi xử lí mẫu 20
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát thể tích tiêm mẫu 27
Bảng 3.3. Kết quả độ thích hợp của hệ thống 29

Hình 3.10. Sắc kí đồ sát LOD 39
1
1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Năm 1929, Alexander Fleming phát hiện ra khả năng kháng khuẩn của nấm
Penicillium notatum, mở đầu cho nghiên cứu và sử dụng kháng sinh. Từ đó tới nay
đã có rất nhiều dòng kháng sinh mạnh, phổ rộng như cephalosporin, macrolid,
quinolon, cloramphenicol… được ra đời. Sự ra đời của các loại thuốc kháng khuẩn
và kháng sinh là thành tựu vĩ đại của y học. Các bác sĩ đã có được những loại thuốc
kì diệu giá rẻ và hiệu quả trong điều trị nhiễm khuẩn. Kháng sinh cùng với các biện
pháp vệ sinh, tiêm phòng góp phần gia tăng tuổi thọ của con người trong nhiều năm,
thậm chí nhiều thập kỉ. Mỗi lần phát hiện một loài vi khuẩn kháng thuốc, các phòng
thí nghiệm lại đưa ra một loại thuốc kháng sinh mới[7], [25].
Tuy nhiên theo cảnh báo của WHO, những loại kháng sinh công hiệu nhất
trong điều trị bệnh đang dần bị vô hiệu hóa. Trong cuộc chiến giữa vi khuẩn và con
người, phần thắng đang nghiêng về phía các loại vi khuẩn kháng thuốc. Đây gần
như là dấu chấm hết cho thời kì hoàng kim của thuốc kháng sinh [26]. Từ năm 1987
đã không hề có một loại kháng sinh nào được phát hiện còn vi khuẩn lại vẫn đang
không ngừng biến đổi [25], [26]. Do đó, giảm tỉ lệ kháng thuốc của vi khuẩn là
công việc cấp bách hơn bao giờ hết. Một trong những nguyên nhân quan trọng dẫn
đến vi khuẩn kháng thuốc là do kháng sinh tồn dư trong nước thải đặc biệt là trong
nước thải nhà máy sản xuất kháng sinh. Việc loại bỏ không hoàn toàn kháng sinh
trong nước thải tại nhà máy dẫn đến việc xả nước vào môi trường tiềm năng ảnh
hưởng đến sức khỏe con người và tác động đến hệ sinh thái, tạo điều kiện cho vi
khuẩn kháng thuốc ngay cả ở nồng độ dấu vết [24]. Do vậy hướng nghiên cứu về dư
lượng kháng sinh, chất chuyển hóa của chúng và ảnh hưởng của chúng lên con
người và môi trường đang rất được quan tâm chú ý đặc biệt là ở các nước phát triển
[24], [17]…Đã có nhiều nghiên cứu định lượng kháng sinh trong nước thải và ảnh

3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1 TỔNG QUAN VỀ CEPHALOSPORIN
1.1.1 Lịch sử ra đời, nguồn gốc
Năm 1945, Giuseppe Brotzu từ nguồn nước biển tại Cagliari (Italia) đã phân
lập được chủng nấm Cephalosporium acremonium. Dịch lọc môi trường nuôi cấy
nấm này có tác dụng ức chế sự phát triển của tụ cầu vàng Staphylococcus aureus và
có tác dụng điều trị bệnh nhiễm khuẩn do tụ cầu vàng và bệnh thương hàn ở người.
Từ năm 1948 đến năm 1956, Abraham và Neuton (Anh) từ môi trường nuôi cấy này
(nay được gọi là Acremonium chrysogenum) đã chiết được một hỗn hợp kháng sinh
cephalosporin P
1
, cephalosporin C và penicillin N. Năm 1971, từ chủng Norcardia,
Nagarazan chiết xuất được cephamycin cũng có cấu trúc gần với cephalosporin C.
Có nhiều cephalosporin tự nhiên được sinh tổng hợp từ các chủng nấm mốc
khác nhau nhưng chúng hầu như không có ý nghĩa trong trị liệu. Vì vậy người ta đã
tìm cách tạo ra các cephalosporin bán tổng hợp trên cơ sở cấu trúc vòng β-lactam.
Ưu thế của các cephalosporin là có tác dụng kháng khuẩn đối với cả các vi khuẩn có
hoạt tính β-lactamase, nhiều vi khuẩn Gram (-) và độc tính thấp. Vì vậy chúng
nhanh chóng chiếm vị trí quan trọng trong trị liệu [8].
1.1.2 Công thức cấu tạo, phân loại và phổ tác dụng

là nguyên nhân làm cho các cephalosporin có tính hữu truyền khá mạnh [7].
4
* Phân loại và phổ tác dụng
Hiện nay, cephalosporin được phân loại thành 4 thế hệ dựa trên phổ tác
dụng. Các cephalosporin thế hệ trước tác dụng trên vi khuẩn Gram (+) mạnh hơn,
nhưng trên Gram (-) yếu hơn thế hệ sau và ngược lại. Phổ chung của các thế hệ
cephalosporin được giới thiệu tại bảng 1.1 [9].
Bảng 1.1 Phổ tác dụng của các cephalosporin
Tên
nhóm
Tên đại
diện
Phổ tác dụng
Thế hệ I
Cephalexin
Cephalothin
Cephazolin
…
- Phổ tác dụng trung bình, tác dụng trên các vi khuẩn
Gram (+) như tụ cầu, liên cầu, phế cầu (trừ liên cầu
kháng methicillin).
- Thuốc cũng có tác dụng trên một số vi khuẩn Gram
(-) như
E.coli, Kebsiella pneumoniae, Proteus
mirabilis và Shigella.
Thế hệ II
Cephaclor

Thế
hệ
Công thức phân tử Tính chất vật lí
1. Cephadroxil
monohydrat
I
C
16
H
17
N
3
O
5
S.H
2
O
- Bột màu trắng hoặc gần như trắng.
- Khó tan trong nước, rấ
t khó tan
trong ethanol 96%.
2.Cefuroxim
II
C
20
H
22
N
4
O

O
7
S
2
.5H
2
O
- Bột trắng hoặc hơi vàng.
- Tan trong dung dịch kiềm, và trong
dimethyl sulfoxid
, ít tan trong
dimethylformamid, methanol, nước,
không tan trong ace
ton, ethanol,
cloroform, dioxan
, ether, ethyl
acetat, toluen.
5.Cefotaxim
natri
III
C
16
H
16
N
5
NaO
7
S
2

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của cefixim
+ Công thức phân tử:C
16
H
15
N
5
O
7
S
2
.3H
2
O
+ Khối lượng phân tử: 507,5
+Tên khoa học: (6R, 7R)- 7- [[(Z)- 2- (2- aminothiazol- 4- yl)- 2- [(carboxy
methoxy) imino] acetyl] amino]- 3- ethenyl- 8- oxo- 5- thia- 1-azabicyclo[4.2.0] oct-
2- en- 2- carboxylic trihydrat [6], [13], [22].
1.2.2 Tính chất lí hóa
Bột trắng hoặc gần như trắng, hơi hút ẩm. Ít tan trong nước, aceton, glycerin,
tan trong methanol, propylen glycol, hơi tan trong ethanol, thực tế không tan trong
ether, ethyl acetat và hexan, hầu như không tan trong dung dịch sorbitol 70% và
octanol. Dung dịch chứa 0,7 mg cefixim trong 1 ml nước có pH từ 2,6 đến 4,1 [6],
[13], [22].
1.2.4 Dược lí
Cefixim là một kháng sinh cephalosporin thế hệ 3, được dùng theo đường
uống.
Cefixim có độ bền vững cao với sự thủy phân của beta-lactamase mã hóa bởi
gen nằm trên plasmid và chromosom. Cefixim có tác dụng cả invitro và trên lâm
sàng với hầu hết các chủng của các vi khuẩn sau đây:

PO
4
, điều chỉnh
pH bằng dung dịch NaOH 1M) [6], [22].
1.2.6.2 Nghiên cứu định lượng cefixim bằng phương pháp HPLC
 Mẫu: nguyên liệu, viên nén, hỗn dịch
- Cột: C
18
(0,125 m x 4 mm, 5µm)
- Pha động: ACN : dung dịch tetrabutylamoni hydroxyd 0,4 M pH = 6,5 (chỉnh
pH bằng dung dịch H
3
PO
4
1,5 M) (1:3)
- Detector: UV λ = 254 nm
- Tốc độ dòng: điều chỉnh cho thời gian lưu của cefixim khoảng 10 phút [6],
[13], [22].
8
 Mẫu dịch sinh học
 Phạm Thu Trang: mẫu huyết tương
- Tủa protein bằng dung dịch acid HClO
4
20%
- Điều kiện phân tích:
o Cột Rp 18e (250 x 4,6 mm, 5µm) có bảo vệ cột, nhiệt độ cột 40
o Pha động: MeOH : đệm phosphat pH = 2,1 (NaH

- Điều kiện sắc kí:
o Cột Xterra C
18
(250 x 4,6 mm, 5 µl), nhiệt độ cột 32
o Pha động: dung dịch đệm phosphat 40mM pH = 3,2 và MeOH, gradient, tốc
độ dòng 0,85 ml/phút
o Detector: DAD λ = 285 nm [20].
9
 Mẫu: nước bề mặt, nước ngầm, nước uống
Nghiên cứu xác định cefixim trong mẫu nước bề mặt, nước ngầm, nước uống
đã được công bố
- Chiết pha rắn cột SPE: Isolute EVN 100 mg
- Điều kiện sắc kí:
o Cột Luna C
18
(250 x 2 mm, 5 µm)
o Pha động: Acid formic 0,1% : ACN : MeOH, gradient thành phần pha động,
tốc độ dòng 0.2 ml/phút
o Detector: MS-MS [23].
Nhận xét
Cefixim là một kháng sinh cephalosporin thế hệ 3 được sử dụng trong nhiều
trường hợp.Vậy nên cefixim là một trong những kháng sinh được quan tâm nghiên
cứu nhiều. Các nghiên cứu về cefixim rất phong phú đa dạng từ định lượng cefixim
trong chế phẩm, huyết tương tới định lượng trong nước thải.
Các dược điển các nước đều có chuyên luận riêng về cefixim [6], [13], [22].
Nghiên cứu định lượng cefixim trong huyết tương cũng rất được quan tâm
chú ý. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu định lượng riêng cefixim hay định

Các kĩ thuật sắc kí lỏng: sắc kí phân bố, sắc kí hấp phụ, sắc kí trao đổi ion,
sắc kí loại cỡ, sắc kí ái lực, sắc kí các đồng phân quang học.
Trong khuôn khổ của đề tài tôi xin trình bày chi tiết về sắc kí phân bố.
Sắc kí phân bố là kĩ thuật được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay. Có thể phân
thành 2 dạng tùy thuộc vào pha tĩnh:
- Sắc kí lỏng – lỏng: Pha tĩnh là lớp chất lỏng bao quanh các hạt chất mang
rắn, đó là chất nhồi cột. Quá trình lưu giữ chất phân tích liên quan đến sự phân bố
giữa 2 pha lỏng.
- Sắc kí pha liên kết: pha tĩnh có liên kết hóa học với bề mặt chất mang rắn ví
dụ như silica, alumina [1], [2].
1.4.4 Các thông số đặc trưng
* Hệ số phân bố K

Trong đó C
S
11
C
S
: nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh.
C
M
: nồng độ mol của chất tan trong pha động.
K càng lớn, sự di chuyển của các chất của chất tan qua pha tĩnh càng chậm.
Nếu các chất trong hỗn hợp có hằng số K khác nhau càng nhiều thì khả năng tách
diễn ra càng dễ dàng hơn [1].
* Thời gian lưu t
R

12
Trong phép định lượng yêu cầu 0,8 AF 2 [1].
* Số đĩa lí thuyết và hiệu lực cột N:
Hiệu lực cột được đo bằng thông số: Số đĩa lý thuyết N của cột.
2
2/1
2
54,516






=






=
W
t
W
t
N


- Trong đó : t
RA
, t
RB
: Thời gian lưu của 2 pic liền kề
W
A
, W
B
: Độ rộng của pic đo ở các đáy pic.
W
1/2A
, W
1/2B
: Độ rộng của pic đo ở nửa chiều cao các pic.
Các giá trị t
RA
, t
RB
,W
A
, W
B
, W
1/2A
, W
1/2B
phải tính theo cùng đơn vị [1].
- Yêu cầu R

- Phương pháp thêm chất chuẩn.
- Phương pháp chuẩn hóa diện tích.
Trong đó phương pháp dùng chuẩn ngoại được sử dụng nhiều. Đây cũng là
phương pháp sử dụng trong nghiên cứu này. Vì vậy sau đây chúng tôi xin trình bày
chi tiết về phương pháp chuẩn ngoại dùng trong định lượng bằng HPLC.
* Phương pháp dùng chuẩn ngoại
Phương pháp dùng chuẩn ngoại là phương pháp định lượng cơ bản. Trong đó
cả mẫu chuẩn và mẫu thử đều được tiến hành sắc kí trong cùng một điều kiện.
Nguyên tắc : so sánh diện tích pic (hoặc chiều cao pic) của mẫu thử với diện
tích pic (hoặc chiều cao pic) của mẫu chuẩn để tính nồng độ các chất trong mẫu thử.
Có thể sử dụng chuẩn hóa 1 điểm hoặc chuẩn hóa nhiều điểm.
 Chuẩn hóa 1 điểm : Chọn nồng độ của mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ của
mẫu thử.
Tính nồng độ mẫu thử theo công thức :
C
X
= C
S
. S
X
/S
S
Trong đó :
C
X
: nồng độ chất phân tích trong mẫu thử
C
S
: nồng độ chất phân tích trong mẫu chuẩn
S

X
: Nồng độ chất thử
Dựa vào phương trình hồi quy tính nồng độ chất thử :
C
X
= (Y-b)/a
Lưu ý : Độ lớn của diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử phải nằm trong
đoạn tuyến tính của đường chuẩn [1], [2]. 15
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Sử dụng nước thải nhà máy dược phẩm của công ty Mediplantex – một trong
những công ty có dây chuyền sản xuất các cephalosporin trong đó có cefixim làm
nền mẫu trong nghiên cứu này.
Tiến hành lấy mẫu nước thải của công ty Mediplantex vào ngày không sản

- Cân phân tích Metler Toledo (d=0,01 mg, e = 0,1 mg) (Thụy Sĩ)
- Máy li tâm Hettich zentrifugen (Đức)
- Thiết bị sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) Merck – Hitachi với detector
DAD, phần mềm Multi-system manager, Interface D700, Nhật Bản
- Dụng cụ thủy tinh các loại
17
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1 Khảo sát phương pháp xử lí mẫu
- Mục đích: tìm được loại dung môi, tỉ lệ dung môi xử lí mẫu có hiệu suất cao,
loại được nhiều tạp chất.
- Tiến hành xử lí mẫu thử chứa cefixim bằng các cách khác nhau. Định lượng
hoạt chất theo quy trình đã lựa chọn. Đánh giá và tìm ra cách xử lí phù hợp.
2.3.2. Xây dựng điều kiện sắc kí
Nghiên cứu tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát các điều kiện sắc kí về cột
sắc kí, thành phần và tốc độ pha động, thể tích tiêm mẫu trên thiết bị sắc kí lỏng
hiệu năng cao với detector DAD nhằm lựa chọn được điều kiện sắc kí phù hợp nhất
để định lượng cefixim.
2.3.3. Đánh giá phương pháp
Xử lí các mẫu nghiên cứu theo phương pháp xử lí đã xây dựng, tiến hành sắc
kí các dung dịch thu được theo điều kiện đã khảo sát, thẩm định phương pháp dựa
trên các chỉ tiêu: độ phù hợp của hệ thống, độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ đúng và
độ chính xác, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng.
 Độ thích hợp của hệ thống: Đánh giá độ ổn định của hệ thống về thời gian
lưu và diện tích pic khi tiêm lặp lại 1 mẫu chuẩn 6 lần liên tiếp.
Yêu cầu: RSD% về thời gian lưu và diện tích pic < 2% [15].
 Độ đặc hiệu :Trên sắc kí đồ, mẫu trắng phải không có pic có thời gian lưu
tương ứng với thời gian lưu của mẫu chuẩn [15].