LỜI CẢM ƠN
Khóa luận “Xây dựng phương pháp định lượng cefixim trong chế
phẩm và trong huyết tương bằng điện di mao quản” là kết quả của quá trình
học tập và nghiên cứu của bản thân tôi tại trường Đại học Dược Hà Nội trong
suốt hơn hai năm qua. Để có được kết quả cuối cùng này, tôi xin chân thành
cảm ơn các thầy cô tại trường đại học Dược Hà Nội, những người đã truyền đạt
những kiến thức làm nền tảng cho tôi thực hiện khóa luận này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Trần Tử An, người đã
dành rất nhiều tâm huyết, trí tuệ và thời gian giỳp tôi hoàn thành khóa luận này.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến TS. Phạm Thị Thanh
Hà, người đã tận tình hướng dẫn, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất
cho tôi trong quá trình nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Nguyễn Thanh Phương, người đã nhiệt
tình hướng dẫn, tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình thực nghiệm.
Tôi xin chân thành cảm ơn bộ môn Phân tích - Độc chất trường Đại học
Dược Hà Nội, trung tâm kiểm nghiệm Dược phẩm & Mỹ phẩm Hà Nội, phòng
Kiểm nghiệm Viện Dinh dưỡng đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình
thực hiện đề tài.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đó luụn động viên, khích lệ,
giúp đỡ tôi tận tình.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 20 tháng 12 năm 2009
Đỗ Lan Phương
MỤC LỤC
TÀI LIỆU THAM KHẢO 62
PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AUC : Diện tích dưới đường cong (Area Under Curve)
BP : Dược điển Anh (British Pharmacopoeia)
C
max

nổi bật so với các cephalosporin thế hệ trước đó như tác dụng mạnh hơn với
các chủng vi khuẩn Gram (-), nồng độ tối thiểu có tác dụng thấp hơn, có khả
năng khuyờ́ch tán tới các cơ quan mà các cepholosporin khác khó thâm nhập
vào được và có thời gian bán hủy lâu hơn. Đặc biệt cefixim rất dễ hấp thụ và
đạt được nồng độ điều trị trong máu bằng đường uống thay vì phải sử dụng
đường tiêm như nhiều kháng sinh khác nờn rất dễ sử dụng. Chính vì thế trong
vài năm trở lại đây Cefixim đã được sản xuất, sử dụng nhiều ở Việt Nam dưới
nhiều dạng bào chế như viên nén, viên nang, bột pha hỗn dịch. Tuy nhiên,
cefixim lại là một trong những kháng sinh có tỷ lệ thuốc kém chất lượng cao
nhất. Trong năm 2008 và 2009, rất nhiều biệt dược chứa cefixim bị đình chỉ
lưu hành vì không đạt tiêu chuẩn về hàm lượng như viên bao phim Massime
(cefixim 200 mg, Ấn Độ), viờn nang Panazme (cefixim 200mg, Ấn Độ), viờn
nén Kwangmyungcefex (cefixim 100mg, Hàn Quốc).
Hiện nay dược điển Việt Nam chưa có chuyờn luận về Cefixim, việc
kiểm nghiệm chỉ dựa trên tiêu chuẩn cơ sở. Trong các dược điển BP 2008 và
USP 32, cefixim được định lượng bằng kỹ thuật HPLC. Việc định lượng
Cefixim trong huyết tương người bằng kỹ thuật này cũng đã được nghiên cứu
trên thế giới cũng như ở Việt Nam. Ưu điểm của kỹ thuật HPLC là có khả
năng tách tốt, độ lặp lại và độ chính xác cao, tuy nhiên có nhược điểm là chi
phí cao, sử dụng nhiều dung môi, hóa chất độc hại.
Điện di mao quản là một kỹ thuật phân tích hiện đại, đang được nghiên
cứu và được đưa vào sử dụng tại nhiều nước trên thế giới với nhiều ưu điểm
như hiệu lực tách cao, thể tích mẫu nhỏ, tốn ít dung môi, ít độc hại. Cho đến
nay, tại Việt Nam, điện di mao quản vẫn là một kỹ thuật khá mới trong lĩnh
vực phân tích và đang được nghiên cứu để ứng dụng vào thực tế.
Từ những phân tích trên, chúng tôi tiến hành đề tài:
“Xây dựng phương pháp định lượng cefixim trong chế phẩm và
trong huyết tương bằng điện di mao quản” với mục tiêu:
1. Xây dựng một chương trình điện di phù hợp để định lượng cefixim
trong chế phẩm và trong huyết tương.

6
nên có
khả năng tách rất tốt các mẫu chứa hỗn hợp phức tạp.
- Thể tích mẫu tiêm rất nhỏ, cỡ 5 - 50 nl nên tiết kiệm mẫu.
- Có rất nhiều kiểu CE nên khả năng ứng dụng vào thực tế rất đa dạng.
- Sự tách được thực hiện chủ yếu trong môi trường nước với sự có mặt
của chất điện ly nền nên rất kinh tế và không độc hại.
- Có khả năng tự động hóa nên dễ dàng khi phân tích số lượng mẫu lớn.
1.1.3. Phân loại điện di mao quản [4]
Điện di mao quản có nhiều kiểu khác nhau. Mỗi kiểu có cơ chế tách
riêng. Bảng 1.1 tóm tắt 4 kiểu điện di hay được sử dụng trong phân tích.
Bảng 1.1: Các kiểu điện di mao quản
Kiểu điện di Cơ chế tách
1. Điện di mao quản vùng
(capillary zone elctrophoresis)
Linh độ khác nhau của các chất (phụ thuộc
điện tích và kích cỡ ion).
2. Sắc ký điện động mixen MEKC
(micellar electrokinetic
chromatography)
Tương tác phân cực / không phân cực với
hạt mixen trong dung dịch và linh độ của
chất.
3. Điện di mao quản gel CGE
(capillary gel electrophoresis)
Linh độ của chất và tương tác loại cỡ với
hạt gel.
4. Điện sắc ký mao quản CEC
(capillary electrochromatography)
Sự phân bố chất phân tích vào pha tĩnh

3
4
5
6
7
8

1
2
1
2
3
4
.
- Công thức phân tử: C
16
H
15
N
5
O
7
S
2
.3H
2
O
- Khối lượng phân tử: 507,5
- Tên khoa học:
- Acid (6R,7R)-7-[(Z)-(2-amino-4-thiazolyl)-2-

chủng vi khuẩn kháng penicillin và một số kháng sinh cephalosporin do tiết ra
beta-lactamase vẫn có thể nhạy cảm với cefixim.
Cefixim có phổ tác dụng đối vi khuẩn Gram âm rộng hơn so với kháng
sinh cephalosporin thế hệ 1 và 2. Do bền vững cao với beta-lactamase nên
nhiều chủng vi khuẩn kháng penicillin và một số kháng sinh cephalosporin do
tiết ra beta-lactamase vẫn có thể nhạy cảm với cefixim.
Hiệu lực lâm sàng đã được chứng minh trên nhiều bệnh nhiễm khuẩn gây
ra bởi những chủng gây bệnh phổ biến như: S. pyogennes; S. agalactiae, S.
pneumoniae; E. coli; P. mirabilis; K. species; H. influenzae; M.catarrhalis
(kể cả những chủng tiết ra beta-lactamase); N. meningitidis; N. gonorrhoeae
(kể cả những chủng tiết ra penicillinase)
1.2.4. Dược động học [14]
Chỉ có khoảng 40-50% liều dùng cefixim được hấp thu qua đường tiêu
hóa. Thức ăn không ảnh hưởng tới tỷ lệ hấp thu mà chỉ làm chậm hấp thu. Sự
hấp thu cefixim qua đường tiêu hóa không bị ảnh hưởng bởi việc dùng đồng
thời antacid. Nồng độ đỉnh của cefixim trong huyết tương thay đổi tùy theo
dạng viên hay dạng hỗn dịch. Nồng độ đỉnh trong huyết tương của dạng hỗn
dịch uống cao hơn 20-50% của dạng viờn nộn. Diện tích dưới đường cong
(AUC) của hỗn dịch uống cao hơn 10-25% của dạng viờn nộn. Do đó thuốc
viên và hỗn dịch uống không thể thay thế nhau theo tương quan mg/mg. Ở
người trưởng thành khi uống cefixim dạng viờn nộn, nồng độ đỉnh trong huyết
tương đạt được là 2,0 - 3,0 àg/mL sau 2 giờ khi uống liều 200 mg và 4,0 - 6,5
àg/mL khi dùng liều 400 mg.
Có khoảng 65 - 70% cefixim trong hệ tuần hoàn liên kết với protein
huyết tương. Sự phân bố của cefixim vào cỏc mụ và dịch cơ thể là có giới hạn.
Cefixim được phân bố vào đờm, amidan, xoang hàm trên, tuyến tiền liệt
nhưng đặc biệt có nồng độ cao trong mật. Thể tích phân bố biểu kiến ở người
lớn khỏe mạnh nằm trong khoảng từ 0,095 - 0,11 L/kg. Thuốc qua được nhau
thai nhưng không thấy bài tiết qua sữa mẹ.
Thời gian bán thải của thuốc trong huyết tương (T

Bảng 1.2: Một số thuốc cefixim bị đình chỉ lưu hành do không đạt tiêu
chuẩn về hàm lượng cefixim trong năm 2008, 2009
STT Tên biệt dược Xuất xứ Số đăng ký Số lô
1
Kwangmyungcefex
(cefixime 100 mg)
Huons Co.Ltd Hàn Quốc VN-8823-04 6003
2
Odazipin
(cefixime 200 mg)
Flamingo
Pharmaceuticals
VN-1232-06 130
3
Ceftrimini
(cefixime 100mg)
Minimed Laboratories VN-1236-06 119
4
Massime
(cefixim 200mg)
Swiss Pharma, Ấn độ VN-3245-07 120
5
Panazme
(cefixim 200mg),
SRS Pharmaceutical Pvt,
Ltd Ấn độ
VN-2008-06 PE01
6
Swetacefix
(cefixim 100mg)

*Phổ cộng hưởng từ hạt nhân [20]
Phương pháp này dựa trên nguyên tắc hạt nhân của một số nguyên tố
trong từ trường có thể bị phân thành các mức năng lượng khác nhau. Sự hấp
thụ một số bức xạ điện từ thích hợp làm thay đổi sự phân bố của chúng trong
các mức. Bằng các biện pháp thích hợp người ta làm xuất hiện các tín hiệu
tương ứng với các nguyên tố đặc biệt trong nhóm chức, cũng như tương tác
giữa các nhóm chức.
Hòa tan 0,05g Cefixim trong 0,5 mL hỗn hợp deuterated dimethyl
sulfoxid và H
2
O (4:1). Xác định phổ, dùng tetramethyl sulfoxid làm chất
chuẩn đối chiếu cho tín hiệu đơn bội A tại δ=4,7 ppm và cường độ tín hiệu
đơn bội B tại δ= 6,5 ppm và 7,4 ppm ( tỉ lệ cường độ 2 tín hiệu 1:1)
Nhận xét: Phương pháp này có thể được ứng dụng trong cả định tính và
định lượng, có ưu điểm là không phân hủy mẫu và tốn ít thời gian.Tớn hiệu
cộng hưởng tỉ lệ với số hạt nhân cộng hưởng tại tần số đó cho phép xác định
tỷ lệ tương đối giữa các thành phần trong hỗn hợp. Nếu có chất đối chiếu có
thể xác định được nồng độ các chất.
* Đo năng suất quay cực [20]
Phương pháp này dựa trên nguyên tắc một số chất có khả năng quay
mặt phẳng của cỏc chựm tia phân cực đi qua nó. Những chất như vậy được
gọi là chất hoạt quang . Các chất hoạt quang phải có ít nhất 1 cacbon bất đối.
Góc quay cực của các chất lỏng hay dung dịch được đo bằng phân cực kế.
Căn cứ vào góc quay cực đo được, so sánh với các chỉ tiêu nêu trong tài liệu ta
có thể định tính, thử tinh khiết và định lượng.
Với Cefixim khi hòa tan 0,45 g cefixim trong NaHCO
3
khan (tỉ lệ 1:50)
đo năng suất quay cực thu được [α]
D

Lưu lượng
(mL/phút)
V
mẫu
λ Chuẩn nội
1
C
18
(250-300
mm x 4
mm, 7 àm)
25 mL TBAOH + H
2
O đủ 100 mL,
chỉnh pH đạt 6,5 bằng H
3
PO
4
0,1 M(dung
dịch A),
290 mL dung dịch A + 110 mL MeCN
bằng pha động.
Điều chỉnh
sao cho thời
gian lưu là 9
phút
10 μl 254 nm
Acid 2-
naphtalen
sulfonic

2
O đủ 1000 mL,
chỉnh pH đạt 6,5 bằng H
3
PO
4
0,1 M
(dung dịch A), 300 mL dung dịch A +100
mL MeCN bằng pha động.
1,0 mL/phút
10 μL
254 nm -
16
hệ tọa độ E-I, I là cường độ dòng điện qua mạch điện phân, E là điện thế đặt
lên hai điện cực
Phõn tích cefixim theo kỹ thuật Vụn-ampe trên nguyên tắc oxi hóa
cefixim và quá trình khuyếch tỏn cú kiểm soát phụ thuộc vào pH. Dùng đệm
phosphat pH 4,5 cho phép phát hiện cefixim nồng độ 6.10
-6
đến 2.10
-4
trong
huyết tương, 8.10
-6
đến 2.10
-4
trong nước tiểu và 6.10
-6
đến 10
-4

LOQ
(àg/mL)
Detector Chuẩn nội TLTK
1
Zorbax SB C
8
(150mm x 4,6mm, 5àm)
MeCN – H
2
O – acid formic
(40: 60: 0,5; v/v/v)
0,5 0,05
LC-
MS/MS
Cefetamet [28]
2
Hibar Lichrospher RP 8
(250mm x 4,0mm, 5àm)
KH
2
PO
4
0,025 M, pH 2,2 –
MeOH (75: 25, v/v)
1,2 0,2
UV 280
nm
- [43]
3
Nucleosil C

Nova-Pak C
18
(100mm x 4,6mm,5àm)
MeCN – đệm phosphat 12,5
mM, pH 2,7 (17:83, v/v)
1,2 0,2
UV 280
nm
7- hydroxy
coumarin [27]
19
Đánh giá: Phương pháp này có ưu điểm là có độ chọn lọc cao, độ nhạy
cao nên có thể ứng dụng để định lượng cefixim trong dịch sinh học qua đó
nghiên cứu sinh khả dụng và tương đương sinh học của các chế phẩm có chứa
Cefixim. Tuy nhiên phương pháp này phải dùng dung môi, hóa chất đắt tiền,
và đôi khi phải xử lý mẫu tương đối phức tạp và mất nhiều thời gian.
* Phương pháp điện di mao quản [19]
Định lượng cefixim trong dịch sinh học bằng phương pháp điện di mao
quản chưa được nghiên cứu nhiều so với các phương pháp khác, mới chỉ có 1
tài liệu nghiên cứu định lượng cefixim và các chất chuyển hóa của nó trong
nước tiểu với một số chương trình sau:
Bảng 1.5: Một số chương trình định lượng cefixim bằng điện di mao quản
Cột Dung dịch đệm
Điện
thế
(kV)
λ (nm) t
m
(phút)
L

Nhưng với kỹ thuật CZE có thể tách và định lượng được các chất này, cho
thấy sự ưu việt của điện di trong định lượng cefixim trong dịch sinh học.
1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH THƯỜNG ĐƯỢC SỬ DỤNG ĐỂ ĐỊNH
LƯỢNG THUỐC TRONG HUYẾT TƯƠNG
Có 3 phương pháp xử lý mẫu hay được sử dụng với các mẫu dịch sinh
học: tủa protein với dung môi hữu cơ hoặc acid, chiết lỏng-lỏng và chiết pha
rắn. Tùy thuộc vào điều kiện của phòng thí nghiệm và đặc điểm của từng chất
phân tích để lựa chọn phương pháp phù hợp.
1.4.1. Phương pháp chiết pha rắn (solid phase extraction SPE)[32], [36]
Đây là quá trình tách chất phân tích từ mẫu bằng một chất rắn, sau đó rửa giải
bằng một dung môi thích hợp. Nguyên liệu tạo pha rắn trong SPE là dẫn chất
polysiloxan, polymer, tạo ra pha liên kết. Ngoài ra còn sử dụng cả pha không liên kết.
Một số cephalosporin được tách khỏi huyết tương trước hết nhờ hấp thụ
trong chất rắn không phân cực như C
18
, C
8
sau đó được rửa giải. Trong
phương pháp này, nếu tương tác giữa các cephalosporin và chất mang lớn
tương tác giữa cephalosporin và protein thì độ lặp lại có thể gần 100%.
1.4.2. Phương pháp chiết xuất lỏng-lỏng [32], [36]
Chiết lỏng - lỏng là kỹ thuật dùng rất phổ biến để chuyển chất phân tích
hòa tan trong một dung môi sang một dung môi thứ hai không hòa tan trong
dung môi thứ nhất.
Trong thực hành chiết xuất, chất được chuyển từ pha nước vào pha dung
môi có thể thuộc nhiều loại hình hóa học khác nhau như: Các acid, base hoặc
các chất lưỡng tính; hợp chất nội phức; cặp ion.
Chiết lỏng – lỏng là kỹ thuật được phổ biến để tỏch cỏc chất hữu cơ, loại
cản trở phân tích. Tuy nhiên cefixim là chất rất phân cực do có chứa cỏc nhúm
carboxyl nên rất khó chiết toàn lượng bằng dung môi hữu cơ.

thêm cefixim các nồng độ khác nhau.
 Huyết tương thỏ có dùng cefixim được lấy sau 1 thời gian nhất định sau
khi dùng thuốc.
2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU
2.2.1. Chất chuẩn đối chiếu
 Cefixim: Chất chuẩn Viện kiểm nghiệm- Bộ Y tế hàm lượng 98,88%
tính theo chế phẩm khan. Độ ẩm 10,57%. Hàm lượng Ethanol 0,04%. SKS:
0105192.
 Natri cefoperazon: Chất chuẩn Viện kiểm nghiệm- Bộ Y tế hàm lượng
99,87% tính theo chế phẩm khan. Độ ẩm 4,57%, SKS: 010687.
 Natri diclofenac: Chất chuẩn Viện kiểm nghiệm- Bộ Y tế.
 Codein phosphat: Chất chuẩn Viện kiểm nghiệm- Bộ Y tế.
23
 Paracetamol: Chất chuẩn Viện kiểm nghiệm- Bộ Y tế.
 Cefadroxil, cefotaxim: Chất chuẩn Viện kiểm nghiệm- Bộ Y tế.
2.2.2. Hóa chất, dung môi
2.2.2.1.Hóa chất
 Dinatri hydrophosphat (Na
2
HPO
4
.2H
2
O): PA (MERCK, Đức).
 Natri dihydrophosphat (NaH
2
PO
4
.2H
2

 Bộ lọc nước siêu tinh khiết Elga: model ELGASTAT MAXIMA SC, áp
suất tối đa 1,4 bar/20 psi (bơm vào), 4,1 bar/60 psi (hoạt động) (Elga Ltd, Anh) .
 Máy siêu âm Ultrasonic LC 60H và Ultrasonic LC 30 (Elma, Đức).
 Máy đo pH Metrohm và Eutech Instruments cho kết quả đến ± 0,01
đơn vị pH (sai số ± 0,05).
 Cân phân tích Sartorius GP1503P .
 Máy ly tâm JOUAN B3.11 cho tốc độ quay tối đa 4000 vũng/phỳt.
 Máy lắc xoáy LABINCO L46.
 Tủ đá lạnh sâu -40°C ( bảo quản mẫu huyết tương), Sanyo MDF-236.
 Micropipet 10, 100, 1000 àL.
 Các loại dụng cụ thủy tinh có độ chính xác thích hợp.
24

Trích đoạn Giới hạn định lượng (LOQ) và giới hạn phát hiện (LOD) Định lượng cefixim trong huyết tương thỏ Chương 4 BÀN LUẬN Trần Tử An (2006), Đánh giá tương đương sinh học chế phẩm hai thành

---