BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
VÕ THỊ VIỆT TRINH
NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG
CARBAMAZEPIN TRONG HUYẾT TƯƠNG
BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2015
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VÕ THỊ VIỆT TRINH

thuận lợi giúp tôi hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể các thầy cô giáo Trường Đại học Dược
Hà Nội, những người đã tận tâm dạy dỗ, trang bị cho tôi các kiến thức và kỹ năng
trong học tập, nghiên cứu suốt 5 năm qua.
Chân thành cảm ơn những người anh chị em cùng những người bạn của tôi đã
luôn sát cánh, quan tâm, giúp đỡ tôi vượt qua khó khăn khi thực hiện đề tài để tôi có
thể đi đến ngày hôm nay.
Cuối cùng, với tất cả tình yêu thương, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất
dành cho gia đình của tôi - những người thân yêu đã luôn tin tưởng, động viên và
chăm sóc tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài này.
Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2015
Sinh viên
Võ Thị Việt Trinh
MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2
1.1. Tổng quan về carbamazepin (CBZ) 2
1.1.1. Công thức cấu tạo và đặc điểm hóa lý 2
1.1.2. Dược lý và cơ chế tác dụng 2
1.1.3. Dược động học 3
1.1.4. Chỉ định và chống chỉ định 4

3.2.6. Độ ổn định của mẫu huyết tương 41
3.3. Bàn luận 41
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
48
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CBZ : Carbamazepin
CBZ-E : Carbamazepine 10, 11- epoxide
CV : Hệ số biến thiên (Coefficient of Variation)
HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid
Chromatography)
HQC : Mẫu kiểm soát chất lượng nồng độ cao (High Quality Control
Sample)
HT : Huyết tương
IS : Nội chuẩn (Internal Standard)
LLOQ : Giới hạn định lượng dưới (Lower Limit Of Quantification)
LQC : Mẫu kiểm soát chất lượng nồng độ thấp (Lower Quality Control
Sample)
MeCN : Acetonitril
MeOH : Methanol

gian lưu của carbamazepin và nội chuẩn
35
3.2 Kết quả thẩm định đường chuẩn 35
3.3 Kết quả thẩm định giới hạn định lượng dưới 36
3.4 Kết quả thẩm định độ đúng, độ lặp lại trong ngày 37
3.5 Kết quả thẩm định độ đúng, độ lặp lại giữa các ngày 38
3.6 Kết quả thẩm định tỷ lệ thu hồi nội chuẩn 39
3.7 Kết quả thẩm định tỷ lệ thu hồi carbamazepin 40
3.8
Kết quả thẩm định độ ổn định dung dịch chuẩn nội trong thời gian
ngắn
41
3.9
Kết quả thẩm định độ ổn định dung dịch chuẩn carbamazepin gốc dài
ngày
41
3.10
Kết quả thẩm định độ ổn định của mẫu huyết tương sau 3 chu kỳ
đông–rã
42
3.11
Kết quả thẩm định độ ổn định của mẫu huyết tương ở nhiệt độ phòng
trong thời gian ngắn
43
3.12
Kết quả thẩm định độ ổn định của mẫu huyết tương ở thời gian dài ở
nồng độ thấp
44
3.13
Kết quả thẩm định độ ổn định của mẫu huyết tương ở thời gian dài ở

3.10 Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng thẩm định độ chọn lọc 34
3.11
Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng có pha chuẩn carbamazepin (nồng
độ 0,1µg/mL) và nội chuẩn
34 1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh động kinh được định nghĩa là sự rối loạn từng cơn chức năng của thần
kinh trung ương do sự phóng điện đột ngột, quá mức, đồng thời của các neuron.
Bệnh xuất hiện ở tất cả mọi nơi trên thế giới và có thể ở mọi lứa tuổi. Trong số các
bệnh nhân động kinh, khoảng 50% trẻ em có vấn đề khó khăn về nhận thức, 6%
bệnh nhân có bất thường về vận động, 6% rối loạn tâm thần nặng, 1/15 bệnh nhân
phụ thuộc vào người khác cho các công việc hằng ngày vì lý do bệnh động kinh và
mức độ tàn phế liên quan đến nó. Trên thế giới người mắc bệnh động kinh chiếm
khoảng 0,5% dân số và tại Việt Nam khoảng 2% dân số bị động kinh trong đó gần
60% số bệnh nhân là trẻ em [1], [20], [26].
Carbamazepin là một dẫn xuất của iminostiben, được xem là một trong những
thuốc cơ bản hàng đầu để điều trị bệnh động kinh, đặc biệt là động kinh cục bộ và
động kinh thể co cứng giật rung. Tuy nhiên khoảng điều trị của carbamazepin hẹp,
cơ chế tác dụng phức tạp, nhiều tương tác, tương kỵ và có nhiều trường hợp bệnh
nhân ngộ độc thuốc. Hơn nữa trong thực tế điều trị, tính cá thể thường thể hiện rất
rõ và phức tạp. Do đó việc nghiên cứu về sinh khả dụng, dược động học, dược lâm
sàng của các chế phẩm carbamazepin, đặc biệt kiểm soát nồng độ carbamazepin
trong huyết tương bệnh nhân để điều chỉnh liều cho phù hợp với từng cá thể là hết
sức cần thiết. Tại Việt Nam, năm 2010, Bộ Y Tế đã quy định các thuốc chứa hoạt

- Bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng.
- Rất khó tan trong nước và ether, hơi tan trong aceton và ethanol (96%), dễ tan
trong dicloromethan, methylen clorid, chloroform.
- Nhiệt độ nóng chảy: 189-193
°
C [3], [5], [10], [14].
1.1.2. Dược lý và cơ chế tác dụng
Carbamazepin là một hợp chất iminostilben - nhóm cấu trúc dibenzazepine, là
một trong những thuốc cơ bản trong điều trị động kinh cục bộ và động kinh co
cứng-giật rung. CBZ làm ổn định tình trạng quá kích thích tại màng thần kinh, kìm
hãm sự phóng lặp lại các xung thần kinh, giảm sự dẫn truyền synap của các xung
kích thích. Sự ức chế cảm ứng điện dòng Na
+
có thể là cơ chế hoạt động chính của
CBZ, nhờ đó CBZ có thể ức chế sự chuyển vận catecholamin, quá trình giải phóng
glutamate [2], [4], [23].
Tác dụng chống co giật của CBZ đặc biệt hiệu quả ở các bệnh nhân động kinh
cục bộ phức hợp tuy nhiên không hiệu quả trong động kinh cơn vắng. CBZ làm tăng
3
ngưỡng động kinh, làm giảm nguy cơ co cứng và giảm các triệu chứng cai nghiện
rượu.
CBZ có tác dụng hướng tâm thần, nâng cao tâm trạng ở một số bệnh nhân
trầm cảm bị động kinh và điều trị phối hợp với các thuốc chống loạn thần trong giai
đoạn cấp tính của bệnh tâm thần phân liệt. CBZ cũng có tác dụng điều trị bệnh rối
loạn lưỡng cực, đặc biệt trong trường hợp bệnh nhân không đáp ứng điều trị với cả
lithium và valproat.
Ngoài ra, CBZ còn có tác dụng giảm đau do thần kinh như đau dây thần kinh

1.1.4.1. Chỉ định:
- Bệnh động kinh: Ðộng kinh cục bộ có triệu chứng phức tạp (động kinh tâm thần
vận động và động kinh thùy thái dương), động kinh lớn (co giật cứng toàn bộ). Các
kiểu động kinh hỗn hợp gồm các loại trên, hoặc các loại động kinh cục bộ hoặc toàn
bộ khác.
- Ðau do nguyên nhân thần kinh: Giảm đau do dây thần kinh sinh ba và giảm đau
dây thần kinh lưỡi hầu, đau trong zona, giang mai thần kinh….
- Dự phòng bệnh hưng - trầm cảm (không đáp ứng với liệu pháp thông thường).
- Ðiều trị hội chứng cai rượu.
1.1.4.2. Chống chỉ định
- Loạn chuyển hóa porphyrin cấp tính.
- Quá mẫn với CBZ hoặc dị ứng với các thuốc có cấu trúc liên quan như các thuốc
chống trầm cảm ba vòng.
- Block nhĩ - thất.
- Người có tiền sử loạn tạo máu và suy tủy.
- Người mang thai, đặc biệt trong 3 tháng đầu [2], [4].
1.1.5. Một số chế phẩm trên thị trường
Các chế phẩm CBZ trên thị trường chủ yếu dùng ở dạng viên nén hàm lượng
200mg. Ngoài ra còn có các dạng viên nén nhai, viên nén giải phóng kiểm soát, viên
nang giải phóng chậm, hỗn dịch uống với hàm lượng 100, 200 hoặc 300 mg cho
phù hợp với nhu cầu người sử dụng. Một số chế phẩm chứa CBZ trên thị trường
được trình bày cụ thể tại bảng 1.1 sau:
5
Bảng 1.1. Một số chế phẩm CBZ trên thị trường [24], [25].
1.1.6. Một số phương pháp định lượng CBZ trong dịch sinh học bằng HPLC
Hiện nay, định lượng CBZ nguyên liệu có thể sử dụng phương pháp đo quang
hoặc phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Định lượng CBZ trong dịch

Tergetol-CR
100mg
200mg
Novartis
4
Viên nang giải
phóng chậm
Carbatol
200mg
300mg
Shire US
5 Hỗn dịch uống

Carbamazepin
suspension
100mg/5ml

Alpharma
6
được nhiều nghiên cứu sử dụng nhất do có nhiều ưu điểm. Một số phương pháp
định lượng CBZ trong huyết tương bằng HPLC được trình bày ở bảng 1.2
Bảng 1.2. Một số nghiên cứu định lượng CBZ trong dịch sinh học.
Nhận xét:
Phương pháp 1: Phương pháp cho độ nhạy cao và thời gian chạy sắc ký là 8
phút, thuận lợi cho quá trình phân tích. Tuy nhiên dung môi chiết chỉ sử dụng
cloroform – khó bay hơi nên có nhược điểm thời gian cô dài, dễ tạo nhũ tương gây
khó khăn cho quá trình chiết. Ngoài ra chất chuẩn nội 5 (p-metylphenyl) -5-

nước = 37:63
(v/v)
Tốc độ dòng:
1,5ml/phút
UV,
λ 254 nm

2
[18]
Huyết
tương
người
Chiết pha
rắn (SPE)
phenobarbital
Bakerbond-
BDC C18
(250mm x 4.6
mm)
Acetonitril :
10mM đệm
phosphat pH
7,0 = 30 :70
(v/v)
Tốc độ dòng:
1,5mL/phút
UV,
λ 210 nm

3

pháp này gặp nhiều khó khăn do không đủ kinh phí mua cột chiết và trang thiết bị
chiết pha rắn. Vì vậy phương pháp này khó có thể áp dụng ngay ở nước ta hiện nay
.
Phương pháp 3: Xử lý mẫu bằng phương pháp tủa protein trong dung môi
MeOH đơn giản, dễ thực hiện. Tuy nhiên, nền mẫu phức tạp, mẫu chưa sạch, pic
của chuẩn không tách được hoàn toàn pic tạp trên sắc ký đồ và thời gian lưu của
chuẩn nội khoảng 11,4 phút gây kéo dài thời gian phân tích, không thuận lợi cho
quá trình phân tích nhiều mẫu trong ngày.
Dựa trên sự tham khảo các tài liệu đã được công bố và dựa vào tính chất lý
hóa của CBZ, chúng tôi dự kiến xây dựng phương pháp định lượng CBZ trong
huyết tương bằng phương pháp HPLC với detector UV-VIS có sử dụng chất nội
chuẩn phù hợp đáp ứng yêu cầu độ đúng, độ chính xác cao của phương pháp phân
tích trong dịch sinh học, dễ thực hiện với điều kiện hiện có tại các phòng kiểm
nghiệm của Việt Nam.

We used a Model 601 (Perkin-Elmer Corp., Norwalk,
Conn. 06856) high-pressure liquid
8

chung, các cột phân tích thường có chiều dài từ 10-25cm, đường kính 2-5mm.

Bộ phận phát hiện (Detector)
9
Là bộ phận phát hiện chất phân tích. Tùy theo bản chất của các chất cần phân
tích mà sử dụng detector thích hợp, thường có các loại sau: Detector hấp thụ UV-
VIS, detector phổ phát xạ nguyên tử, detector huỳnh quang [6], [8].
1.2.3. Một số thông số cơ bản của quá trình sắc ký
1.2.3.1. Thời gian lưu t
R
& Thể tích lưu V
R


Thời gian lưu (t
R
)
Thời gian lưu (t
R
) của một chất là thời gian cần để một chất di chuyển từ nơi
tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới detertor và cho pic trên sắc ký đồ tính từ lúc tiêm đến
lúc xuất hiện đỉnh của pic.
Thời gian lưu là thông tin về mặt định tính của sắc ký đồ, nó là hằng số đối với
một chất nhất định khi tiến hành sắc ký trong điều kiện không đổi.
Trong một phép phân tích còn có thời gian lưu hiệu chỉnh hay thời gian lưu
thực (t
R

c
Với: F
c
là thể tích pha động trên một đơn vị thời gian.
Trên thực tế, thể tích lưu là lượng tổng cộng pha động tính từ lúc tiêm mẫu
đến khi ra khỏi hệ thống [6], [8].
1.2.3.2. Hệ số phân bố K
Hệ số phân bố (K) là hệ số phân bố ở trạng thái cân bằng xác định tốc độ trung
bình của mỗi vùng chất tan do pha động vận chuyển khi nó qua cột.
K =





Trong đó: C
S

và C
M
là nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh và pha động
10
Hệ số phân bố K phụ thuộc vào: bản chất chất tan, bản chất pha động, bản chất
pha tĩnh, nhiệt độ.
Trị số K càng lớn thì sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm [6].
1.2.3.3. Hệ số dung lượng k’
Hệ số dung lượng k’ cho biết khả năng phân bố của chất phân tích trong hai

chọn lọc α :
α =




=
′

′

=

()



()



Qui ước : Chất B là chất bị lưu giữ mạnh hơn chất A nên α>1
Để tách riêng 2 chất thường chọn 1,05 ≤ α ≤ 2,0 [6], [8].
1.2.3.5. Hệ số đối xứng của pic F
F =



Trong đó: W: chiều rộng của pic đo ở 1/20 chiều cao của pic
a: khoảng cách từ chân đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép

R
s
=
.(
(

)


(

)

)




hoặc
,.(
(

)


(

)

)

được chia thành 2 loại:
- Sắc ký pha thuận: pha tĩnh phân cực, pha động không phân cực, chất phân
tích thường là các chất phân cực hoặc là các chất có thể phân cực.
- Sắc ký pha đảo: pha tĩnh ít phân cực, pha động phân cực, chất phân tích
thường là các chất có thể phân cực hoặc ít phân cực.
Pha tĩnh thường được chế tạo trên nền Silica (SiO
2
), nền oxyd nhôm (Al
2
O
3
),
nền hợp chất cao phân tử (cellulose) hay trên mạch carbon. Trong sắc ký hấp phụ
pha đảo: pha tĩnh trên nền silica có nhiều ưu việt được sử dụng nhiều nhất.

Có thể phân loại chất nhồi cột theo gốc Siloxan:
12
- R là các nhóm phân cực (ưa nước): nhóm OH hoặc các alkylamin –CH2-
NH2, alkyl nitril – CH
2
– CN, sử dụng làm pha tĩnh trong sắc ký hấp phụ pha
thuận để phân tích các chất ít hoặc không phân cực [16].
- Với R là các nhóm ít phân cực như octyl, octadecyl, phenyl, được điều chế
bằng cách alkyl hóa các nhóm OH bề mặt silica trung tính bằng các gốc alkyl-
R của mạch carbon (C
2
;C
Có một cách khác để loại trừ bớt sự ảnh hưởng của nhóm –OH mà không cần
tương tác với nó là thay những nhóm methyl của –Si(CH
3
)
2
-C
18
bằng những nhóm
thế lớn hơn như isopropyl để những nhóm này sẽ che chắn đi những nhóm –OH,
được trình bày ở hình 1.2.

Hình 1.2 : Cấu trúc cột có gốc Isopropyl
Ngoài ra, trong một số trường hợp còn ghép lên dây C
18
một số nhóm phân
cực để tăng thêm độ phân cực của dây C
18
làm cột có khả năng tách chọn lọc hơn
đối với những hợp chất phân cực mạnh (Cột EPS–Expended Polar Selectivity) [16].
1.2.4.2. Lựa chọn pha động cho HPLC
Pha động là dung môi để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột sắc ký, là yếu tố
thứ hai quyết định hiệu suất phân tích của một hỗn hợp. Trong sắc ký pha đảo, pha
động là dung môi phân cực như: nước, methanol, acetonitril … hoặc hỗn hợp của
chúng. Các dung môi này có thể hòa tan thêm một lượng nhỏ acid hay base hữu cơ.
Pha động trong HPLC ảnh hưởng tới rất nhiều thông số của quá trình sắc ký
như: độ chọn lọc α, thời gian lưu t
R
, độ phân giải R

1.2.4.3. Lựa chọn Detector
Khi pha động rửa giải các chất ra khỏi cột sẽ ghi nhận bởi detector chuyển
thành tín hiệu và được ghi trên sắc ký đồ. Detector phổ biến nhất là Detector UV-
VIS. Tùy theo chất cần phân tích mà người ta đặt các bước sóng phát hiện khác
nhau [16].
1.2.5. Phương pháp định lượng bằng HPLC
1.2.5.1. Cách đánh giá pic
- Đánh giá diện tích pic: để tính diện tích pic có thể dùng tích phân kế hoặc
dùng máy tính đã cài đặt sẵn chương trình.
- Đánh giá chiều cao của pic với điều kiện các chỉ số k’ là hằng định. Đo chiều
cao của pic chỉ thích hợp khi nồng độ mẫu thử từ thấp đến trung bình.
1.2.5.2. Phương pháp định lượng và cách tính kết quả trong HPLC
Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng
độ của chất phân tích tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó.
Có 4 phương pháp định lượng hay được sử dụng trong sắc ký: phương pháp
chuẩn ngoại, phương pháp chuẩn nội, phương pháp thêm chuẩn, phương pháp
chuẩn hóa diện tích.
15
Hiện nay, phương pháp chuẩn nội được sử dụng nhiều nhất để định lượng
thuốc trong huyết tương. Phương pháp chuẩn nội khắc phục được những nhược
điểm của phương pháp chuẩn ngoại, giúp hạn chế tối đa những sai số có thể gây ra
do máy móc, kỹ thuật nhất là với những qui trình xử lý mẫu phức tạp và các mẫu có
hàm lượng chất cần định lượng thấp.

Nguyên tắc phương pháp chuẩn nội: thêm cả vào mẫu chuẩn và mẫu thử
những lượng bằng nhau của một chất tinh khiết (chất chuẩn nội) rồi tiến hành sắc ký
trong cùng điều kiện.

chứng minh rằng phương pháp phân tích đó là đáng tin cậy và có khả năng thực
hiện phân tích những mẫu được khảo sát.
Quá trình phân tích mẫu sinh học thường bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như
lượng mẫu ít, nồng độ chất phân tích thường rất thấp, lẫn nhiều tạp là các chất nội
sinh (các muối vô cơ, lipid, protein và chất chuyển hóa) và sự khác nhau giữa các cá
thể, do vậy phương pháp phân tích sinh học phải được thẩm định trước khi áp dụng
vào phân tích mẫu để đảm bảo độ tin cậy [11], [19], [22].
1.3.2. Nội dung thẩm định phương pháp
1.3.2.1. Tính chọn lọc – đặc hiệu
Tính chọn lọc hay tính đặc hiệu là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất
cần phân tích khi có mặt các thành phần khác như tạp chất hoặc các chất cản trở
khác. Nói cách khác, tính chọn lọc thể hiện khả năng phương pháp phân tích có thể
nhận diện chất cần phân tích và không bị nhầm lẫn bởi các chất khác.
Tính chọn lọc-đặc hiệu được coi là đạt khi kết quả thu được trên sắc ký đồ cho
các đáp ứng pic thỏa mãn đồng thời các điều kiện sau:
- Pic của chất phân tích được nhận diện rõ ràng, tách được hoàn toàn khỏi pic tạp.
- Đáp ứng của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của chất phân tích
không được vượt quá 20% đáp ứng của chất phân tích ở nồng độ LLOQ.
- Đáp ứng của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của IS không được
vượt quá 5% đáp ứng của IS [11], [19], [22].
1.3.2.2. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính
Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa các đáp ứng của pic (diện tích hay
chiều cao) và nồng độ chất cần phân tích trong dịch sinh học. Khoảng tuyến tính
là khoảng nồng độ từ thấp nhất đến cao nhất trong một đường chuẩn có đáp ứng
tuyến tính.
Đường chuẩn phải có ít nhất 6 nồng độ của chất chuẩn pha trong cùng một
mẫu dịch sinh học. Khoảng tuyến tính phải bao gồm toàn bộ khoảng nồng độ của

LLOQ là nồng độ thấp nhất trên đường chuẩn có thể định lượng được với độ
đúng và độ chính xác chấp nhận được. Do đó giá trị LLOQ thể hiện độ nhạy độ
đúng và độ chính xác của phương pháp.
Mẫu chuẩn có nồng độ thấp nhất trên đường chuẩn được chấp nhận là LLOQ
nếu thỏa mãn:

Trích đoạn Phương pháp nghiên cứu

---