BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM
KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

VÕ ĐỖ MINH HOÀNG

PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT TÍNH CHẤT CỦA MỘT SỐ TOXIN MỚI
TỪ NỌC BÒ CẠP ĐENHETEROMETRUS LAOTICUS

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
Mã số: 62.44.27.01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HOÁ HỮU CƠ

TP. Hồ Chí Minh – 2017


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM
KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

VÕ ĐỖ MINH HOÀNG

PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT TÍNH CHẤT CỦA MỘT SỐ TOXIN MỚI
TỪ NỌC BÒ CẠP ĐENHETEROMETRUS LAOTICUS


NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
1. TSKH. Hoàng Ngọc Anh
2. Giáo sư TSKH Utkin Yuri Nikolaevich

Tp. Hồ Chí Minh – Năm 2017

i


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
1) Luận văn này là sản phẩm nghiên cứu của tôi.
2) Số liệu trong luận văn là trung thực.
3) Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình.

ii


MỤC LỤC
Trang phụ bìa ............................................................................................................. i
Lời cam đoan ............................................................................................................ ii
Mục lục .................................................................................................................... iii
Danh mục các chữ viết tắt ....................................................................................... vi
Danh mục các bảng................................................................................................. vii
Danh mục các hình ................................................................................................ viii
Mở đầu ...................................................................................................................... 1
1. TỔNG QUAN ........................................................................................................2
1.1. Giới thiệu về bọ cạp ...........................................................................................................3
1.1.1. Phân bố và môi trường sống ....................................................................................4

2.4.Khảo sát sự tương tác của của các phân đoạn độc với kênh vận chuyển K+ .....43
3. NGHIÊN CỨU VÀ BIỆN LUẬN........................................................................45
3.1. Định danh bò cạp thu mua tại An Giang ........................................................46
3.2. Nuôi bọ cạp trong phòng thí nghiệm và thu hoạch nọc .........................................46
3.2.1. Nuôi bọ cạp trong phòng thí nghiệm ...................................................................46
3.2.2. Thu nọc bọ cạp H. laoticus .....................................................................................47
3.3. Khảo sát, đánh giá và phân tích nọc thô bọ cạp H. laoticus .................................49
3.3.1. Khảo sát độ pH của nọc thô ......................................................................49
3.3.2. Phân tích hàm lượng protein tổng trong nọc thô ..............................................49
3.3.3. Phân tích nọc bọ cạp bằng sắc ký lọc gel trên gel Sephadex G50 ...............50
3.3.4. Xác định khối lượng phân tử các phân đoạn nọc .............................................52
3.4. Khảo sát độc tính của nọc bọ cạp H. laoticus đối với chuột .................................54
3.4.1. Đánh giá độc tính của các phân đoạn nọc thu được trên chuột ....................54
3.4.2. Đánh giá độc tính cấp của các phân đoạn độc lên chuột ................................56
3.4.3. Phân tích thành phần phân đoạn 4 ........................................................................58
3.4.4. Khảo sát độc tính của các phân đoạn peptide thứ cấp lên chuột ..................59
3.5. Tinh chế và xác định khối lượng phân tử các phân đoạn thứ cấp có độc tính .62
3.5.1. Phân tách các peptide từ phân đoạn 4.6 ..............................................................62
3.5.2. Phân tách các peptide từ phân đoạn 4.7 ..............................................................64
3.5.3. Phân tách các peptide từ phân đoạn 4.11 ............................................................65
3.5.4. Phân tách các peptide từ phân đoạn 4.15 ............................................................66
iv


3.6. Khảo sát cấu trúc bậc một của các polypeptide phân đoạn 4.6 và tác động lên
kênh vận chuyển K+ .................................................................................................................67
3.6.1. Khảo sát cấu trúc bậc một của các polypeptide phân đoạn 4.6 ....................67
3.6.2. Khảo sát tác động của Hetlaxin lên kênh vận chuyển K+ ..............................70
3.7.Khảo sát độc tính của các phân đoạn của nọc bọ cạp H. laoticus lên dế ...........72
3.7.1. Kết quả khảo sát độc tính các phân đoạn nọc trên dế .....................................72


EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

HPLC

High performance liquid chromatography

LD

Lethal dose

MALDI

Matrix-assisted laser desorption/ionization

MS

Mass spectroscopy

NOESY

Nuclear Overhauser effect spectroscopy

PAGE

Polyacrylamide gel electrophoresis

PD

Bảng 3.4. Kết quả thử độc tính trên chuột của các phân đoạn nọc. ......................... 55
Bảng 3.5. Tỷ lệ tử vong của chuột ở các liều khác nhau trong khoảng LD0 và LD100
sau 24 giờ tiêm.......................................................................................................... 56
Bảng 3.6. Bảng tính theo phương pháp Karber – Behrens. ...................................... 56
Bảng 3.7. Kết quả thử độc tính các phân đoạn thứ cấp ............................................ 60
Bảng 3.8. Khối lượng phân tử của các polypeptide tách ra...................................... 68
Bảng 3.9. Kết quả thử độc tính trên dế của các phân đoạn nọc. .............................. 72
Bảng 3.10. Tỷ lệ tử vong của dế ở các liều khác nhau trong khoảng LD0 và LD100
sau 24 giờ tiêm.......................................................................................................... 73
Bảng 3.11. Bảng tính theo phương pháp Karber – Behrens. .................................... 74
Bảng 3.12. Kết quả thử độc tính các phân đoạn thứ cấp trên dế. ............................. 76
Bảng 3.13. Tóm tắt quá trình phân tách phân đoạn 5 bằng HPLC. .......................... 77

vii


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Một số loài bọ cạp đại diện các họ khác nhau ............................................ 4
Hình 1.2. Loài bọ cạp Heterometrus laoticus Couzijn, 1981 ..................................... 5
Hình 1.3. Cấu trúc toxin ngắn của nọc bọ cạp. ........................................................ 10
Hình 1.4. Cấu trúc không gian của một số toxin tách ra từ nọc bọ cạp. .................. 10
Hình 1.5. Sắc ký đồ trao đổi ion của nọc bọ cạp loài Tityus serrulatatus. ............... 18
Hình 1.6. Sắc ký đồ sắc ký lọc gel của nọc bọ cạp Scorpio Maurus. ...................... 19
Hình 1.7. Sắc ký đồ sắc ký hiệu năng cao của nọc bọ cạp Scorpio Maurus ............ 19
Hình 2.1. Thau nuôi bọ cạp trong phòng thí nghiệm. .............................................. 28
Hình 2.2. Thu nọc bọ cạp H. laoticus. ...................................................................... 31
Hình 2.3. Nguyên tắc của phương pháp Edman ....................................................... 36
Hình 2.4. Phản ứng phụ của phương pháp Edman ................................................... 37
Hình 2.5. Xác định trình tự các chuỗi polypeptide ngắn trong chuỗi ban đầu ......... 38
Hình 2.6. Tách hai chuỗi polypeptide liên kết bằng cầu disulfide ........................... 38

Hình 3.27. Phổ NMR của toxin 5.21.1 ..................................................................... 77
Hình 3.28. Cấu trúc của toxin 5.21.1 (Leu-Trp)....................................................... 78

ix


MỞ ĐẦU
Bọ cạp phân bố ở Việt Nam rộng khắp các vùng miền với số lượng tương đối
lớn. Trong dân gian và y học cổ truyền đã sử dụng bọ cạp làm nguyên liệu trong một
số phương pháp chữa bệnh. Tuy nhiên, việc nghiên cứu một cách có hệ thống và khoa
học về thành phần, tác dụng cũng như ứng dụng của nọc bọ cạp ở Việt Nam hiện nay
còn sơ khai và chưa có nhiều kết quả.
Trên thế giới hiện đã có nhiều nghiên cứu về thành phần, cấu trúc, tác dụng và
ứng dụng của nọc bọ cạp nhưng vẫn còn nhiều vấn đề chưa thể giải quyết triệt để. Nọc
bọ cạp là hỗn hợp các protein có tác động đối với hệ thần kinh, việc xác định cấu trúc
các protein này cũng như cách thức các protein này tác động lên hệ thần kinh con
người vẫn chưa được nghiên cứu triệt để và còn nhiều tiềm năng nghiên cứu cũng như
ứng dụng. Từ việc xác định được cấu trúc và cơ chế tác động của nọc bọ cạp đối với
hệ thần kinh con người, có thể đưa ra những phương án sử dụng nọc bọ cạp vào dược
phẩm nhằm phục vụ các mục đích về y tế.
Trong nọc bọ cạp chứa nhiều các polypeptide có khả năng tác động lên các thụ
thể và các kênh ion của màng tế bào bị kích thích, các loại polypeptide này đã và đang
được các nhà khoa học nghiên cứu nhằm tạo ra các loại dược phẩm mới. Nhằm đóng
góp một nguồn nguyên liệu mới và các nghiên cứu khoa học mới, hướng tới làm thuốc
chữa bệnh và làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo, tác giả đã tiến hành các nghiên
cứu về nọc bọ cạpHeterometrus laoticusCouzijn. Hiện nay, chưa phát hiện toxin tách
từ nọc bọ cạp chi Heterometrus có tác dụng mạnh đối với kênh thần kinh Kv1.3. Qua
đề tài “Phân lập và khảo sát tính chất toxin của một số toxin mới từ nọc bọ
cạpHeterometrus laoticus”, hi vọng sẽ mang đến cơ sở cho những nghiên cứu tiếp
theo về việc ứng dụng của nọc bọ cạp dùng làm nguồn nguyên liệu cho dược phẩm.


Loài Androctonus australis

Loài Heterometrus spinifer

Họ Vaejovidae

Họ Chactidae

Loài Smerinigurus vachoni

Loài Uroctonus mordax

Họ Bothriuridae

Họ Hemiscorpiidae

Loài Bothriurus keyserlingi Loài Hadogenes troglodytes
Hình 1.1. Một số loài bọ cạp đại diện các họ khác nhau.[69]

1.1.1. Phân bố và môi trường sống
Bọ cạp được tìm thấy trên tất cả các châu lục, trừ châu Nam Cực, nhưng phong
phú và đa dạng nhất là ở khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới. Môi trường sống của bọ
cạp rất đa dạng từ những khu vực sa mạc, bán sa mạc đến những vùng thảo nguyên,
rừng mưa nhiệt đới, rừng lá kim…Bọ cạp còn được tìm thấy trên những sườn núi cao
(ở độ cao trên 5,500 m) ở dãy Alps, Andes hay Hymalaya, hoặc trong
4


những hang động sâu (gần 1,000m dưới lòng đất). Môi trường sống ưa thích của bọ

chiHeterometrus là sự thay đổi về màu sắc. Khi mới sinh, bọ cạp con có màu trắng
như bông và chuyển màu sẫm dần sau vài ngày nằm trên lưng bọ cạp mẹ (màu nâu đen
với ánh màu xanh). Sau khi lột xác lần thứ nhất,bọ cạp con có màu nâu đen gần giống
màu của bọ cạp mẹ (chưa có ánh màu xanh).Khi mới sinh, bọ cạp con có kích thước
10-15 mm và tăng dần kích thước qua các lần lột xác. Thí dụ, loài H. spinifer có chiều
dài cơ thể qua các tháng tuổi như sau: tháng 1: 12-15 mm, tháng 2: 32-40 mm, tháng
3: 44-51 mm, tháng 4: 56-62 mm, tháng 5: 69-75 mm và tháng 6: 82-90 mm. Trong
phòng thí nghiệm, ở dạng trưởng thành loài này có chiều dài từ 95-110 mm, trong tự
nhiên có thể dài tới 125 mm. Nhiều loài bọ cạp rất khó phân biệt giữa con đực và con
cái. Một số loài bọ cạp con đực có kích thước nhỏ hơn con cái như loài H. spinifer, cơ
thể con đực dài 110 mm, con cái dài 125 mm. Ở một số loài thuộc chiIsometrus, sự
khác nhau giữa bọ cạp đực và cái biểu hiện rất rõ, bọ cạp đực có đuôi và các đốt đuôi
(phần bụng sau) dài hơn bọ cạp cái.[15]

1.1.3. Nọc độc
Nọc độc, chất tiếtra từ răng nanh hoặc ngòi châm của các sinh vật được sử dụng
như vũ khí săn mồi tự nhiên của các loài động vật ăn thịt này nhờ khả năng gây tê liệt
cơ thể con mồi.Thành phần chính trong nọc độc là các protein và polypeptide có độc
tính, các cấu tử trong nọc độc này có thể có mục tiêu và hiệu ứng khác nhau nhưng
được phối hợp hoạt động để đạt hiệu quả cao nhất trên con mồi. Tùy thuộc loài mà các
nọc độc có tác dụng khác nhau lên hệ thần kinh. Một số nọc độc làm tê liệt hệ thần
kinh bằng cách ngăn cản tín hiệu truyền đi giữa dây thần kinh và cơ bắp. Một số nọc
độc khác thì phá hủy các tế bào và mô ở mức độ phân tử. Ngoài ra, nọc độc còn có thể

6


làm đông máu và dừng sự hoạt động của tim hoặc ngăn cản quá trình đông máu tự
nhiên và xuất huyết để giết con mồi.[1, 3]
Tất cả các loài bọ cạp đều có nọcđộc sử dụng để giết hoặc làm tê liệt con mồi

LoàiIsometrus deharvengi sp. Lourenço, 2010phân bố ở Hòn Chồng, Kiên
Giang.
 Họ Scorpionidae[3]
Loài Heterometrus spinifer Ehrenberg, 1828 phân bố ở Bình Phước (Bù
Đốp, Bù Gia Mập, Đồng Phú).
Loài Heterometrus petersiiThorell, 1876ở thành phố Hồ Chí Minh, Bình
Thuận, Khánh Hoà, Gia Lai, Lâm Đồng, Quảng Ninh.
LoàiHeterometrus laoticus Couzijn, 1981: phân bố ở Thành phố Hồ Chí
Minh, Tây Ninh, Đồng Nai (Biên Hoà), An Giang.
Loài Heterometrus cyaneusC. L. Koch, 1836: phân bố ở Thừa Thiên Huế,
Quảng Trị.
 Họ Chaerilidae[3]
Loài Chaerilus petrzelkaiKovařík, 2000: ở miền nam Việt Nam, đảo Côn
Sơn.
LoàiChaerilus variegatus Simon, 1877 phân bố ở miền Nam Việt Nam.
Loài Chaerilus vietnamicus Lourenco và Zhu, 2008 phân bố ở miền Bắc.
Loài Chaerilus julietteaeLourenço, 2011 phân bố ở miền Nam.
Loài Chaerilus phamiLourenço, 2011: tập trung ở đảo Côn Sơn.

8


 Họ Pseudochactidae[3]
LoàiVietbocap canhi Lourenço& Pham, 2010.
LoàiVietbocap thienduongensisLourenço& Pham, 2012.
Cả 2 loài này đều được phát hiện ở động Thiên Đường, Phong Nha – Kẻ
Bàng thuộc tỉnh Quảng Bình.
1.2. Cấu trúc và ảnh hưởng của toxin nọc bọ cạp

1.2.1. Cấu trúc của toxin

 - toxin

cricket
toxin

 - toxin

insect
crustacean toxin
-like toxin
toxin
Hình 1.4. Cấu trúc không gian của một số toxin tách ra từ nọc bọ cạp.

10


1.2.2. Tác động và ảnh hưởng của nọc bọ cạp lên kênh vận chuyển ion
1.2.2.1. Tác động của nọc bọ cạp trên kênh vận chuyển Na+
Kênh vận chuyểnNa+ là một tập hợp các protein xuyên màng hình thành nên
kênh vận chuyển ion có chức năng điều tiết sự di chuyển của ion Na+ xuyên qua màng
sinh chất của tế bào. Kênh vận chuyển Na+ được phân loại dựa trên các tác nhân kích
thích làm mở kênh Na+, thí dụ như kênh điện thế (kênh cổng điện thế, nhạy điện thế
với tên viết tắt “VGSCs”), kênh cổng ligand natri. Về cấu tạo, kênh vận chuyển Na+
bao gồm một protein thứ cấp kích thước lớn α có khả năng tương tác với các protein
khác (protein thứ cấp β). Protein thứ cấp α hình thành nên trung tâm của kênh và hoạt
động tự do.Khi protein thứ cấp α bị tác động bởi tế bào, nó có thể hình thành kênh dẫn
điều khiển hướng đi của ion Na+ theo đường cổng điện thế, ngay cả khi protein thứ
cấp β hay các protein khác không được tác động.[17] Khi các protein đính kèm kết
hợp với protein α, hai protein sẽ hình thành phức có khả năng điều chỉnh sự phụ thuộc
điện thế của màng tế bào và vị trí của phức hai protein.[66, 67, 74]

1

AaHII

VKDGYIVDDVNCTYFCGRNAYCNEECTKLKGES

A. sustralis

GYCQWASPYGNACYCYKLPDHVRTKGPGRCH

2

CssII

KEGYLVSKSTGCKYECLKLGDNDYCLRECKQQY

C. suffussus S

GKSSGGYCYAFACWCTHLYEQAVVWPLPNKTC

3

Tsgamma KEGYLMDHEGCKLSCFIRPSGYCGRECGIKKGSS

T. serrulatus

GYCAWPACYCYGLPNWVKVWDRATNKC

4
5

q.

EHGYLLNKYTGCKVWCVINNEECGYLCNKRRGG

A. australis

YYGYCYFWKLACYCQGARKSELWNYKTNKCDL

8

CsEv3

KEGYLVKKSDGCKYGCLKLGENEGCDTECKAKN

C. sculpturatus

QGGSYGYCYAFACWCEGLPESTPTYPLPNKSC

9

Cn10

KEGYLVNKSTGCKYNCLILGENKNCDMECKAKN

C.noxius

QGGSYGYCYKLACWCEGLPESTPTYPIPGKTCRT

10


được mở ra khi có sự hiện diện của ion calcium hoặc các phân tử gây tín hiệu
khác.


Kênh vận chuyển K+ hiệu chỉnh trong (Inwardly rectifying) – Giúp dẫn

truyền dòng điện (tích điện dương) dễ dàng hơn vào bên trong tế bào.


Kênh vận chuyển K+ tandem pore domain – Nhóm kênh này luôn mở hoặc

cơ bản luôn ở trong tình trạng kích hoạt. Nhóm kênh này (“kênh vận chuyển
Kali hồi phục” hoặc “kênh thải”) có chức năng thiết lập điện thế âm trên màng
bao tế bào thần kinh. Khi mở, kênh cho phép ion Kali đi xuyên qua màng với
vận tốc ngang với tốc độ thẩm thấu phân tử nước.


Kênh vận chuyển K+ cổng hiệu điến thế (voltage-gated) – Dạng kênh này

có thể mở hoặc đóng tương ứng với sự thay đổi điện thế trên màng tế bào.

13


Từ mục đích sử dụng ban đầu như một chất ligand để nghiên cứu bản chất và
sự chọn lọc điện sinh lý học của các kênh ion, việc nghiên cứu nọc độc bọ cạp đã dần
dần phát triển trở thành nền tảng công nghệ sinh học đa năng để thiết kế các que thăm
dò chức năng đa dạng giúp xác định vị trí các kênh ion ở cấp độ phân tử, làm sạch các
kênh ion, xác định trung tâm khối u để hỗ trợ trị bệnh ung thư… Các kênh ion trong
cơ thể điều khiển dòng chảy của các ion giúp phát sinh và lan truyền các xung thần