BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN
SỰ SINH TRƯỞNG CỦA NẤM MEN SACCHAROMYCES
CEREVISIAE VAR. BOULARDII TỪ CHẾ PHẨM THUỐC
BIOFLORA

Họ và tên sinh viên: NGUYỄN THỊ THÚY LIỄU
Ngành: BẢO QUẢN CHẾ BIẾN NÔNG SẢN THỰC PHẨM
VÀ VI SINH THỰC PHẨM
Niên khóa: 2007-2011

Tháng 08/2011


PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ SINH
TRƯỞNG CỦA NẤM MEN SACCHAROMYCES CEREVISIAE VAR.
BOULARDII TỪ CHẾ PHẨM THUỐC BIOFLORA

Tác giả

NGUYỄN THỊ THÚY LIỄU

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Kỹ sư ngành
Bảo quản chế biến nông sản thực phẩm và Vi sinh thực phẩm

Giáo viên hướng dẫn:
ThS. DƯƠNG THỊ NGỌC DIỆP

nghiên cứu các vấn đề: phân lập tế bào nấm men S. boulardii từ chế phẩm thuốc Bioflora,
từ đó xây dựng đường cong sinh trưởng của S. boulardii và khảo sát sự ảnh hưởng của
nhiệt độ, pH, enzyme đến khả năng sinh trưởng và phát triển của loài vi nấm này. Tất cả
các thí nghiệm được bố trí theo kiểu khối hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố với 3 lần lặp
lại.
Kết quả thí nghiệm cho thấy tế bào nấm men S. boulardii sinh trưởng tốt trong môi
trường YNB ở 37 oC, sinh khối đạt cực đại sau 12 giờ nuôi cấy. Tế bào S. boulardii có thể
tồn tại được trong thời gian dài ở nhiệt độ 60 oC, tỷ lệ sống sót sau 1 giờ nuôi cấy là
94,48%. Ở nhiệt độ 80 oC, các tế bào chết hoàn toàn sau 30 phút nuôi cấy. Bên cạnh đó,
sự sinh trưởng và phát triển của nấm men S. boulardii không chịu tác động nhiều bởi môi
trường pH ở các giá trị 4, 6 và 8. Với môi trường có giá trị pH 2, số lượng tế bào nấm
men S. boulardii giảm nhưng không quá nhanh. Tỷ lệ sống sót sau 18 giờ nuôi cấy là
76,88%. Đồng thời, các tế bào nấm men S. boulardii có thể tồn tại được trong môi trường
có sự hiện diện của enzyme tiêu hóa pepsin và pH 1,9.

iii


MỤC LỤC
Trang
Trang tựa................................................................................................................................i
LỜI CẢM ƠN.......................................................................................................................ii
TÓM TẮT........................................................................................................................... iii
MỤC LỤC .......................................................................................................................... iii
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ...............................................................................vii
DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BẢNG............................................................................ viii
Chương 1. MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1
1.1 Đặt vấn đề ....................................................................................................................... 1
1.2 Mục tiêu đề tài ................................................................................................................ 2
1.3 Nội dung thực hiện ......................................................................................................... 2

3.4 Phương pháp thí nghiệm............................................................................................... 21
3.4.1 Phân lập nấm men S. boulardii từ chế phẩm thuốc Bioflora .................................... 21
3.4.1.1 Chuẩn bị mẫu .......................................................................................................... 21
3.4.1.2 Phương pháp phân lập nấm men S. boulardii ........................................................ 21
3.4.2 Xây dựng đường cong sinh trưởng của S. boulardii ................................................. 22
3.4.2.1 Mục đích ................................................................................................................. 22
3.4.2.2 Bố trí thí nghiệm ..................................................................................................... 22
3.4.2.3 Chỉ tiêu theo dõi ..................................................................................................... 22
3.4.2.4 Phương pháp thực hiện ........................................................................................... 23
3.4.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, enzyme đến khả năng sinh trưởng và phát
triển của nấm men S. boulardii........................................................................................... 23
3.4.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng và phát triển của nấm men S.
boulardii ............................................................................................................................. 23
3.4.3.2 Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng và phát triển của nấm men S.
boulardii ............................................................................................................................. 23
3.4.3.3 Ảnh hưởng của enzyme tiêu hóa đến khả năng sinh trưởng và phát triển của nấm
men S. boulardii ................................................................................................................. 24
v


3.5. Xử lý số liệu ............................................................................................................... 25
Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................................... 26
4.1 Phân lập nấm men S. boulardii từ chế phẩm thuốc Bioflora ....................................... 26
4.2 Khảo sát đường cong sinh trưởng của S. boulardii ...................................................... 27
4.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, và enzyme tiêu hóa đến khả năng sinh
trưởng và phát triển của nấm men S. boulardii ................................................................. 31
4.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng và phát triển của nấm
men S. boulardii ................................................................................................................. 31
4.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường pH đến khả năng sinh trưởng và phát triển của
nấm men S. boulardii ........................................................................................................ 33


DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BẢNG
Trang
Hình 2.1 Tế bào S. boulardii ............................................................................................ 8
Hình 2.2 Khả năng sản sinh kháng thể IgA của S. boulardii so với các tác nhân khác . 10
Hình 2.3 Cơ chế kháng khuẩn của S. boulardii .............................................................. 14
Hình 2.4 Tăng trưởng của S. boulardii và S.cerevisiae W303 trong môi trường YPD
(2% glucose) ở 30 oC và 37 oC ...................................................................................... 16
Hình 2.5 Sự sống sót của S. boulardii và S. cerevisiae W303 ở các điều kiện 49 oC,
52 oC, môi trường mô phỏng dạ dày và môi trường mô phỏng ruột .............................. 17
Hình 2.6 Thời gian loại thải S. boulardii ở người khi được dùng một liều duy nhất (1
g). .................................................................................................................................... 18
Hình 2.7 Tỷ lệ thu hồi S. boulardii ở 3 liều dùng 200 mg, 1 g và 3 g .......................... 18
Hình 3.1 Pha loãng và cấy trang mẫu ............................................................................. 22
Hình 4.1 Khuẩn lạc nấm men S. boulardii ..................................................................... 26
Hình 4.2 Tế bào S. boulardii dưới kính hiển vi.............................................................. 27
Hình 4.3 Đường cong sinh trưởng của S. boulardii trên môi trường YNB .................. 28
Hình 4.4 Đường cong sinh trưởng của S. boulardii trên môi trường YNB .................. 29
Hình 4.5 Đường cong tăng trưởng của S. boulardii ở 28 oC và 37 oC trong 48 giờ....... 30
Hình 4.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng và phát triển của nấm men
S. boulardii ..................................................................................................................... 31
Hình 4.7 Tỷ lệ sống sót của S. boulardii sau 30 phút và 1 giờ nuôi cấy trong môi trường
YNB ở nhiệt độ 60 oC..................................................................................................... 32
Hình 4.8 Tỷ lệ sống sót của S. boulardii sau 30 phút và 1 giờ nuôi cấy trong môi trường
YNB ở nhiệt độ 80 oC..................................................................................................... 33
Hình 4.9 Sơ đồ biểu diễn ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng và phát triển của
nấm men S. boulardii ..................................................................................................... 34

viii


• Khảo sát đường cong sinh trưởng của S. boulardii.
• Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, enzyme đến khả năng sinh trưởng và
phát triển của nấm men S. boulardii.

2


Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Tổng quan về probiotic
2.1.1 Lịch sử probiotic
Những nghiên cứu về probiotic mới chỉ bắt đầu vào thế kỷ 20. Vào năm 1907
Elie Metchnikoff - nhà khoa học người Nga làm việc tại viện Pasteur, được giải
thưởng Nobel - đã chứng minh được rằng việc tiêu thụ Lactobacillus sẽ hạn chế các
nội độc tố của hệ vi sinh vật đường ruột. Ông giải thích được điều bí ẩn về sức khỏe
của những người Cô-dăc ở Bulgary, họ sống rất khỏe mạnh và tuổi thọ có thể lên tới
115 tuổi hoặc hơn, nguyên nhân có thể là do họ tiêu thụ rất lớn các sản phẩm sữa lên
men, điều này được ông báo cáo trong sách “Sự kéo dài sự sống” – “The Prolongation
of life”, xuất bản năm 1908.
Cùng thời kỳ với Metchnikoff, Henry Tissier (1906), một nhà nghiên cứu nhi
khoa người Pháp, đã phát hiện ra rằng khi quan sát phân của những trẻ bị tiêu chảy thì
thấy số lượng vi khuẩn hình có hình chữ Y thấp so với trẻ bình thường nên đã đề xuất
cho thêm vi khuẩn này vào những trẻ bị tiêu chảy.
Có thể nói Tissier và Metchnikoff là những người đầu tiên đưa ra những đề
xuất mang tính khoa học về probiotic, làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về
probiotic.
Năm 1930, nhà khoa học người Nhật Minoru Shirota (1899 - 1982) phân lập và
nuôi cấy được một chủng vi khuẩn thuộc loài Lactobacillus casei. Chúng đề kháng
mạnh mẽ với dịch dạ dày (nơi có độ acid rất cao) và dịch mật cùng với các enzyme

hoặc nước uống tạo nên những ảnh hưởng có lợi cho vật chủ.
Hiện có hai định nghĩa được cho là phản ánh khá đầy đủ bản chất của probiotic
và được sử dụng nhiều trong các ấn phẩm khoa học:
• Theo Fuller (1989), probiotic là “chất bổ sung vi sinh vật sống vào thức ăn
giúp cải thiện cân bằng của hệ vi sinh vật đường tiêu hóa theo hướng có lợi
cho vật chủ”.
• Theo tổ chức Y tế thế giới (WHO, 2001), probiotic là “các vi sinh vật sống
khi đưa vào cơ thể theo đường tiêu hoá với một số lượng đủ sẽ đem lại sức
khoẻ tốt cho vật chủ”.
4


2.1.3 Vai trò và cơ chế hoạt động của probiotic
2.1.3.1 Vai trò của probiotic
Từ khi kháng sinh bị cấm sử dụng trong chăn nuôi ở một số nước thuộc khối
liên minh châu Âu (bắt đầu là Thụy Điển vào năm 1986) thì probiotic được coi là một
trong những nguồn thay thế có triển vọng nhất vì có nhiều đặc tính ưu việt. Trên cơ sở
các kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả, Patterson (2003) đã tổng kết các ảnh hưởng
có lợi của probiotic đối với đời sống động vật thể hiện ở các khía cạnh sau:
- Thay đổi cấu trúc quần thể vi sinh vật đường ruột theo chiều hướng có lợi cho vật
chủ.
- Tăng cường khả năng miễn dịch.
- Giảm phản ứng viêm.
- Ngăn cản sự xâm nhập và ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh.
- Tăng sản xuất các acid béo bay hơi.
- Tăng cường quá trình sinh tổng hợp các vitamin nhóm B.
- Tăng hấp thu chất khoáng.
- Làm giảm cholesterol huyết thanh.
- Làm tăng năng suất vật nuôi.
- Giảm hàm lượng amoniac và urê trong chất thải.

chủng probiotic phải bám dính được vào thành ruột non, khu trú tốt trong đường tiêu
hoá và sinh sôi nảy nở. Khả năng bám dính được xem là một yêu cầu quan trọng để
tăng khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh, bảo vệ biểu mô và tăng khả năng miễn dịch
của vật chủ. Đặc tính này làm tăng khả năng cạnh tranh của các chủng probiotic đối
với các vi sinh vật bất lợi khác.
- Hoạt tính kháng khuẩn chống lại các vi khuẩn gây bệnh: Lựa chọn được các
chủng có khả năng sản sinh các chất kháng khuẩn là đặc tính quan trọng nhất trong
phát triển probiotic. Các chủng probiotic cần có hoạt tính ức chế vi khuẩn gây bệnh
như E. coli, Salmonella và Campylobacterium. Hoạt tính kháng khuẩn của chúng có
thể theo nhiều cơ chế khác nhau như:
+ Sản sinh ra các chất bacteriocin.
+ Làm giảm độ pH bởi khả năng tạo ra acid lactic.
+ Tạo ra H 2 O 2 .
+ Làm giảm độc tố theo các cơ chế khác nhau.
+ Khả năng làm giảm sự bám dính của các vi khuẩn gây bệnh trên bề mặt.
+ Cạnh tranh dinh dưỡng với các vi khuẩn gây bệnh.
6


- Khả năng tồn tại trong môi trường acid dạ dày: Khoang miệng và dạ dày của
vật chủ là nơi có môi trường acid cao với giá trị pH từ 2-3 và có mặt các enzym tiêu
hoá (amylase, protease, lysozyme…). Các chủng vi sinh vật được coi như là nguồn
probiotic phải tồn tại được trong điều kiện này. Hiện nay hình thức vi bọc (hay vi nang
- microcapsule) được khuyến cáo ứng dụng cho các chế phẩm probiotic nhằm tăng khả
năng sống của vi khuẩn probiotic khi đi qua khoang miệng và dạ dày.
- Khả năng chịu muối mật: Thông thường, muối mật trong dịch tiêu hoá của
động vật dao động 1-3%. Để tồn tại và phát triển, các chủng probiotic phải có khả
năng tồn tại và phát triển với nồng độ muối mật ≥ 2%.
- Ngoài ra một số chủng probiotic (nấm men, Bacillus và Lactobacillus) có khả
năng sinh enzyme tiêu hoá như: amylase, xenlulase và protease, lipase và phytase có

2.2.2 Phân loại
Hàng loạt các cuộc nghiên cứu (McFarland (1996); McCullough và ctv (1998);
Hennequin và ctv (2001); Mitterdorfer và ctv (2002)), với nhiều biện pháp kỹ thuật
tiên tiến: điện di, PCR,… được tiến hành để xác định rõ hơn về nguồn gốc phân loại
của S. boulardii. Và kết quả phân loại về S. boulardii thu được:
Saccharomyces
ngành

boulardii

thuộc

Saccharomycotina,

lớp

giới

nấm,

ngành

Saccharomycetes,

bộ

Ascomycota,

phân


thể chịu được độ pH thấp ở dạ dày và chịu được tác động của muối mật ở ruột.
S. boulardii là loài nấm men yếm khí tùy tiện, nó có thể phát triển trong điều
kiện hiếu khí hoặc kỵ khí.
Theo Van Rij (1984); Martini (1998) và Lourens-Hattingh và Viljoen (2001), S.
boulardii không đồng hóa hay lên men đường lactose, sinh trưởng và phát triển tốt trên
cơ chất galactose, glucose. Trong quá trình chuyển hóa carbohydrate có sinh một
lượng nhỏ acid lactic (1,04%) và rượu (0,5%). Ngoài ra, S. boulardii còn chuyển hóa
được các monosaccharide, polysaccharide, oligosaccharide, ethanol, acetate, glycerol,
pyruvate và lactate. S. boulardii là vi sinh vật (VSV) dị dưỡng, sử dụng năng lượng từ
glucose qua con đường glycolysic. S. boulardii cũng không thể sử dụng một số acid
hữu cơ, như: acid citric và acid succinic, nhưng tăng trưởng tốt trên môi trường chứa
acid lactic, và không thủy phân các hợp chất protein, lipid.
S. boulardii sinh sản vô tính theo phương thức nảy chồi. Trong quá trình sinh
sản vô tính, chồi mới phát triển từ tế bào nấm men mẹ khi các điều kiện thích hợp và

9


sau đó, khi chồi đạt tới kích thước của tế bào nấm men trưởng thành thì nó tách ra khỏi
tế bào nấm men mẹ.
2.2.6 Vai trò của S. boulardii
Các nghiên cứu đã chứng minh rằng S. boulardii không chỉ mang lại hiệu quả
cho đường ruột mà còn trợ giúp đắc lực cho hệ miễn dịch:
• S. boulardii giữ vai trò quan trọng trong việc phát triển và hoạt động của hệ
miễn dịch niêm mạc ruột: nó giúp hệ miễn dịch ruột sản sinh kháng thể IgA
chống lại độc tố khi ruột nhiễm vi khuẩn gây bệnh, lưu ý rằng 80% hệ miễn
dịch của cơ thể nằm ở ruột (Hình 2.2).

Hình 2.2: Khả năng sản sinh kháng thể IgA của S. boulardii so với các tác nhân khác
(Nguồn: Qamar và ctv, 2000)

• Duy trì các acid béo chuỗi ngắn cần thiết cho sự hấp thu nước và chất điện
giải.
• S. boulardii có thể làm giảm các phản ứng tiền viêm của tế bào biểu mô
đường ruột.
Đặc biệt, S. boulardii là một nấm men chứ không phải là vi khuẩn do đó không
bị ảnh hưởng bởi tác động của kháng sinh và sulfamide. Do đó, S. boulardii được xem
là phương tiện hữu hiệu trong việc phòng trị tiêu chảy do mất cân bằng hệ vi sinh
đường ruột trên những bệnh nhân phải điều trị kháng sinh lâu ngày. Nhiều probiotic
khác không có khả năng này.
Hiện nay, tại Việt Nam và trên thế giới, S. boulardii được sử dụng dưới dạng
đông khô trong các dược phẩm giúp hỗ trợ tiêu hóa như Normagut, Bioflora, hay
Ultra-levure,…(Phụ lục 2).

11


2.2.7 Một số nghiên cứu về nấm men S. boulardii
2.2.7.1 Tính bám dính và khả năng chống chịu dưới tác động của pH acid,
enzyme tiêu hóa và muối mật của S. boulardii
Theo nghiên cứu của Van der Aa Kuqhle và ctv (2004) các chủng thuộc dòng S.
boulardii đều có khả năng tồn tại lâu trong môi trường có pH thấp (mô phỏng theo pH
môi trường dạ dày) (khoảng 4 giờ) mặc dù không có sự tăng trưởng trong điều kiện
này. Chúng đề kháng tốt và có khả năng tăng trưởng được trong môi trường có 0,3%
muối mật.
Cũng theo kết quả nghiên cứu của Van der Aa Kuqhle và ctv (2004) (Bảng 2.1)
khả năng bám dính của dòng S. boulardii rất tốt, đặc biệt là các chủng S. boulardii 259
(tỷ lệ bám dính 16,2%), S. boulardii LSB (tỷ lệ bám dính 28%).

12


Sb.P
+
1,9 ± 0,3
LSB
+
28,0 ± 5,9
S. cerevisiae từ thực phẩm và rau quả
KVL 012
+
1,9 ± 0,7
KVL 013
++
3,4 ± 1,2
CBS 1234
++
2,6 ± 1,4
CBS 1236
++
5,2 ± 1,2
56
+
13,6 ± 3,5
D4
+
++
3,7 ± 1,6
D7
+
++
16,8 ± 3,0

SR 82
+
5,3 ± 1,6
SR 41
++
7,7 ± 1,7
SR 246
++
4,4 ± 3,0
(Nguồn: Van der Aa Kuqhle và ctv, 2004)
Ghi chú:

- Không tăng trưởng
+ Tăng trưởng nhưng bị ức chế sau 4 giờ
++ Không bị ức chế tăng trưởng

13


2.2.7.2 Tính kháng khuẩn
S. boulardii được xem là tác nhân có hiệu quả trong việc phòng chống và điều
trị bệnh tiêu chảy có liên quan đến C. difficile. Theo Castagliuolo và ctv (1999), S.
boulardii tiết ra enzyme protease 54-kDa để tiêu hóa độc tố A và B do C. difficile sinh
ra. Đồng thời, theo Tasteyre và ctv (2002) các protein trên thành tế bào nấm men S.
boulardii cùng với các enzyme protease serine (PMSF) có thể ức chế sự bám dính của
C. difficile trên niêm mạc ruột từ đó làm giảm sự tác động có hại của C. difficile đối
với vật chủ.

Hình 2.3: Cơ chế kháng khuẩn của S. boulardii
(Nguồn: Zannelo và ctv, 2009).

chịu nhiệt, phát triển tối ưu ở 37 oC (nhiệt độ sinh lý của cơ thể người (Czrucka và ctv,
2007). Nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng S. boulardii có khả năng chịu đựng tốt
hơn với các điều kiện bất lợi trong môi trường dạ dày mô phỏng so với S. cerevisiae
W303.
Nghiên cứu của Fietto và ctv (2004) khi so sánh về sự sinh trưởng của S.
boulardii và S. cerevisiae lại cho thấy không có sự khác biệt gì nhiều trong tăng
trưởng của hai loài nấm men này ở hai điều kiện nhiệt độ 30 oC và 37 oC. Tuy nhiên,
theo Hình 2.4 có thể thấy S. boulardii tăng trưởng nhanh chóng so với S. cerevisiae ở
cả hai mức nhiệt độ. Đặc điểm này là một lợi thế của S. boulardii trong việc ứng dụng
như là một probiotic bởi thời gian thế hệ ngắn sẽ tạo thuận lợi cho sản xuất công
nghiệp, đồng thời cũng đảm bảo loài vi nấm này thực hiện tốt chức năng cạnh tranh
đối với các VSV khác trong đường tiêu hóa do khả năng tăng trưởng nhanh.

15