VIỆN HÀN LÂM KH&CN VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN
SINH VẬT
-----------***-----------

LUẬN VĂN CAO HỌC
Mã số chuyên ngành: 60420103

Đề tài:
Tuyển chọn, cải biến và nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn có
khả năng kháng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa phân lập ở Việt Nam

Học viên: Nguyễn Huy Hùng
Lớp: CHST _ K16
Hƣớng dẫn: TS. Nguyễn Xuân Cảnh

Hà Nội, 2014




Lời cảm ơn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Xuân Cảnh Khoa Công nghệ sinh học Học viện Nông nghiệp Hà Nội, là người thầy đã hướng cho tôi những ý tưởng khoa học, tận
tnh hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn
thành bản luận án này.
Tôi xin cảm ơn tất cả các thầy cô giáo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn
lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam đã chia sẻ, động viên, giúp tôi vượt qua mọi khó khăn để
hoàn thành tốt công việc nghiên cứu của mình.
Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến gia đình và bè bạn, những người luôn bên tôi,
động viên,góp ý và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học tập
và nghiên cứu.

..........................................................................................3
1.1.

GIỚI THIỆU VỀ XẠ KHUẨN ....................................................................3

1.1.1. Sự phân bố và ý nghĩa của xạ khuẩn trong tự nhiên........................................3
1.1.2. Vị trí của xạ khuẩn trong sinh giới ..................................................................4
1.1.3. Cấu tạo của xạ khuẩn .......................................................................................5
1.1.4. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn .....................................................................8
1.1.5. Sự hình thành bào tử xạ khuẩn ........................................................................9
1.1.6. Sinh tổng hợp chất kháng sinh .......................................................................11
1.2. PHÂN LẬP CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG
SINH ........................................................................................................................13
1.2.1. Phân lập các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh .......................................13
1.2.2. Phân loại và định tên xạ khuẩn ......................................................................14
2.1. VẬT LIỆU ........................................................................................................33
2.1.1. Chủng giống vi sinh vật .................................................................................33
2.1.2. Hóa chất .........................................................................................................33
2.1.3. Thiết bị ...........................................................................................................33
2.1.4. Môi trƣờng .....................................................................................................33
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................................................34
2.2.1. Bảo quản giống [3].........................................................................................34
2.2.2. Xác định đặc điểm sinh học ...........................................................................35
2.2.3. Xác định sinh khối .........................................................................................36
2.2.4. Xác định hoạt tính kháng sinh [6,19].............................................................36
2.2.5. Nghiên cứu điều kiện lên men [3, 6]..............................................................37



mục

TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................60
Tài liệu tiếng Việt ....................................................................................................60
Tài liệu tiếng anh......................................................................................................60




CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN
HSCC

Hệ sợi cơ chất HSKS

Hệ sợi khí sinh RNA
Ribonucleic acide
DNA

Deoxyribonucleic acide

RA

Cuống bào tử xoắn đơn hình móc câu RF

Cuống bào tử thẳng hay lƣợn song CSBT

Cuống sinh

bào tử
BMBT

Bề mặt bào tử CKS

ISP-1 (A) và ISP-2 (B)
Hình 3.5. Hình thái cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử của chủng xạ khuẩn NĐ
8.9 khi quan sát trên kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 1000 lần (A) và kính hiển vi điện
tử quết ở độ phóng đại 7500 lần
Hình 3.6. Sự sinh trƣởng của chủng xạ khuẩn 8.9 trên môi trƣờng có các nguồn cacbon khác
nhau
Hình 3.7. Sinh trƣởng và phát triển của chủng 8.9 trên môi trƣờng ISP-6
Hình 3.8. Điện di sản phẩm PCR gene 16S rRNA của chủng 8.9
Hình 3.9. Cây phát sinh chủng loại của chủng 8.9
Hình 3.10. Động thái của quá trình lên men sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng xạ
khuẩn 8.9 trên môi trƣờng Gauze-1
Hình 3.11. Biểu đồ giá trị Rf của chất kháng sinh thô 8.9




Danh mục bảng
Bảng 3.1.Kết quả phân lập vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa tại Viện huyết học truyền máu
TW.
Bảng 3.2. kết quả dựng kháng sinh đồ trên máy VITEK2 compact tại bệnh viện
Huyết học truyền máu TW
Bảng 3.3. Phân loại xạ khuẩn theo nhóm màu
Bảng 3.4. Hoạt tnh kháng sinh của các chửng xạ khuẩn tuyển chọn đối với vi khuẩn
Pseudomonas aeruginosa
Bảng 3.5. Đặc điểm hình thái nuôi cấy chủng 8.9
Bảng 3.6. Khả năng sử dụng nguồn cacbon của chủng xạ khuẩn 8.9
Bảng 3.7. So sánh đặc điểm hình thái của chủng 8.9 với chủng S. parvulus Bảng 3.8.
Khả năng sử dụng nguồn cacbon của 2 chủng 8.9 và S. parvulus Bảng 3.9. So sánh
trình tự gen 16S RNA trên ngân hàng gen quốc tế
Bảng 3.10. Hoạt tnh kháng sinh của chủng xạ khuẩn 8.9 trên các môi trƣờng

nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn có khả năng kháng vi khuẩn Pseudomonas
aeruginosa phân lập ở Việt Nam”.
*/ Mục tiêu của đề tài:
- Phân lập đƣợc vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa từ các mẫu thu thập tại một số
bệnh viện.
- Sàng lọc và tuyển chọn đƣợc chủng xạ khuẩn có khả năng kháng vi khuẩn
Pseudomonas aeruginosa từ bộ sƣu tập các chủng xạ khuẩn phân lập ở Việt Nam

1


- Phân loại và nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn đã tuyển chọn.
- Cải biến đƣợc chủng xạ khuẩn đã tuyển chọn để nâng cao hoạt tính kháng khuẩn
- Bƣớc đầu xác định đƣợc nhóm hoạt chất chính từ chủng xạ khuẩn đã tuyển chọn tác động lên
vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa.
*/ Nội dung
- Phân lập vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa từ các mẫu bệnh phẩm, nƣớc thải, đất thu thập
tại một số bệnh viện.
- Kiểm tra tnh mẫn cảm của các chủng Pseudomonas aeruginosa phân lập đƣợc với một số
loại chất kháng sinh
- Kiểm tra hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn đã phân lập đƣợc với vi khuẩn
Pseudomonas aeruginosa để tuyển chọn ra các chủng có hoạt tính cao.
- Phân loại và nghiên cứu các đặc điểm hình thái, nuôi cấy, sinh lý – sinh hóa của các
chủng xạ khuẩn tuyển chọn.

2


TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. GIỚI THIỆU VỀ XẠ KHUẨN

vitamin và các axít hữu cơ [3]. Do có các loại enzim này nên chúng cũng có khả năng phân giải
các hợp chất bền vững nhƣ kitn, xenluloza, lignin…. Một đặc điểm quan trọng của xạ khuẩn là
khả năng sinh chất kháng sinh. 60-70% xạ khuẩn phân lập đƣợc từ đất có khả năng này. Trong
số khoảng 8000 chất kháng sinh hiện đã đƣợc biết đến trên thế giới thì trên 80% là do xạ khuẩn
[17]. Chúng sống trên rễ cây hoặc củ và gây bệnh, nhất là ở vùng đất kiềm, đất cát khi thời tết
khô hạn, làm cho củ lở loét, sần sùi ngay từ ngoài đồng ruộng. Một số xạ khuẩn (thuộc chi
Frankia) có thể tạo nốt sần trên rễ một số cây không thuộc bộ đậu và có khả năng cố định Nitơ
không khí thành dạng dễ sử dụng cho cây. Các chủng Streptomyces spp. sinh độc tố phytotoxin
ảnh hƣởng lớn tới mùa vụ, do chúng có thể tồn tại trong đất trên 10 năm [3, 6].
1.1.2. Vị trí của xạ khuẩn trong sinh giới
Trƣớc đây, vị trí phân loại của xạ khuẩn luôn là câu hỏi gây nhiều tranh luận giữa các
nhà vi sinh học do nó có những đặc điểm vừa giống vi khuẩn, vừa giống nấm. Trƣớc thế kỉ
19, xạ khuẩn đƣợc xếp vào nhóm nấm. Về sau, khi đã nghiên cứu sâu hơn ngƣời ta đã tm ra
các bằng chứng về mối liên hệ giữa xạ khuẩn và vi khuẩn
nhƣ:
- Một số xạ khuẩn nhƣ các loài thuộc chi Actinomyces và Nocardia rất giống với các
loài vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus và Corynebacterium.
- Xạ khuẩn giống vi khuẩn ở chỗ không có nhân thật, chúng chỉ chứa nhiễm sắc chất
phân bố dọc theo các sợi hoặc các tế bào.
- Đƣờng kính của sợi xạ khuẩn và bào tử giống với vi khuẩn. Đồng thời xạ khuẩn
thƣờng không chứa vách ngăn.
- Xạ khuẩn là đích tấn công của các thực khuẩn thể giống nhƣ vi khuẩn, trong khi đó,
nấm không bị tấn công bởi thực khuẩn thể.
- Xạ khuẩn thƣờng nhạy cảm với các kháng sinh có tác dụng lên vi khuẩn nhƣng lại
thƣờng kháng với những kháng sinh tác dụng lên nấm nhƣ các polyen.

4


- Xạ khuẩn chứa chitn, chất có mặt trong sợi và bào tử của nhiều nấm, mà không

giới vi khuẩn thật (Eubacteria) (tƣơng đƣơng với 3 ngành Gracilicutes, Tenericute,
Mollicutes theo Gibbbens và Murray) và giới vi khuẩn cổ (Archaebacteria) (tƣơng
đƣơng với ngành Mendosicutes)[3].
Xạ khuẩn thuộc về nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria), lớp Actinobacteria, bộ Actinomycetales,
bao gồm 10 dƣới bộ, 35 họ, 110 chi và 1000 loài. Hiện nay, 478 loài đã đƣợc công bố thuộc chi
Streptomyces và hơn 500 loài thuộc tất cả các chi còn lại đƣợc xếp vào nhóm xạ khuẩn hiếm.
1.1.3. Cấu tạo của xạ khuẩn
Xạ khuẩn giống nấm mốc ở chỗ có thể tạo thành hệ sợi, nhƣng lại là cơ thể đơn
bào, không có nhân thực (procariotc) và có kích thƣớc giống vi khuẩn. Cấu trúc khuẩn lạc xạ
khuẩn đƣợc phân biệt ở hƣớng sinh trƣởng trong và ngoài mặt môi trƣờng thạch tạo
thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh. Khuẩn ty cơ chất

5


(substrate mycelium) cắm sâu vào môi trƣờng để lấy nƣớc và thức ăn. Khuẩn ty cơ chất phát
triển một thời gian thì dài ra trong không khí thành khuẩn ty khí sinh (aerial mycelium). Ngƣời ta
gọi khuẩn ty khí sinh là khuẩn ty thứ cấp để phân biệt với khuẩn ty sơ cấp phát triển từ các bào
tử nảy mầm. Nhiều loại chỉ có khuẩn ty cơ chất nhƣng cũng có loại (nhƣ chi Sporichthya) lại chỉ
có khuẩn ty khí sinh. Khuẩn ty khí sinh phát triển ra ngoài không khí và thƣờng phần cuối các
khuẩn ty này biến thành cuống sinh bào tử. Loại khuẩn ty không mang bào tử gọi chung là
khuẩn ty dinh dƣỡng. Khuẩn ty xạ khuẩn mảnh hơn khuẩn ty nấm mốc, và có đƣờng kính
thay đổi trong khoảng từ
0,2-1,0µm đến 2-3µm. Đa số xạ khuẩn có khuẩn ty không có vách ngăn và không tự đứt đoạn.
Một số xạ khuẩn có bao sợi là một bao mỏng bọc bên ngoài khuẩn ty khí sinh, có thể thấy rất rõ
khi phân hoá thành bào tử [3].
* Màng tế bào xạ khuẩn khá phức tạp: gồm có thành tế bào và màng tế bào:
- Thành tế bào xạ khuẩn (CW) có dạng kết cấu lƣới, dày khoảng 10-20nm, có tác dụng
duy trì hình dáng của khuẩn ty và bảo vệ tế bào. Căn cứ vào kết cấu hoá học ngƣời ta chia thành
tế bào xạ khuẩn thành 4 nhóm:

- Màng tế bào chất nằm dƣới lớp thành tế bào, dày 7,5-10,0 nm. Chúng có cấu trúc và
chức năng tƣơng tự nhƣ màng tế bào chất của vi khuẩn: chủ yếu gồm 2 thành phần là
photpholipit và protein; màng chứa nhiều enzym có vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình
vận chuyển và trao đổi chất qua màng [6].
* Thể trung gian (mezoxom) nằm ở phía trong màng tế bào chất, có hình phiến, hình
bọng hay hình ống. Công dụng của thể trung gian là làm tăng diện tch tếp xúc của màng tế bào
chất và do đó tăng cƣờng hoạt tính enzim, tăng chuyển điện tử...[3].
* Các vật thể ẩn nhập nằm trong tế bào chất của xạ khuẩn gồm có các hạt poliphotphat
(hình cầu, bắt mầu với thuốc nhuộm Soudan III), các hạt polisaccarit (bắt màu với dung dịch
Lugol) [3].
Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn Gram (+), “nhân” của xạ khuẩn cùng loại với nhân của “vi
khuẩn”, nhƣng khác với nhóm vi sinh vật không có nhân thực khác là tỉ lệ G+C cao (>70%)
trong khi đó ở vi khuẩn là 25 - 40%.
Một trong những đặc điểm đáng lƣu tâm của xạ khuẩn là chúng không bền vững về
di truyền và thƣờng xảy ra sự sắp xếp lại trong phân tử ADN. Điều này gây

7


ra một số hiện tƣợng kì lạ khác: tạo ra tnh đa dạng của hình thái, tnh kháng thuốc do sự xuất
hiện các dị vòng [3, 6, 23].
1.1.4. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn
Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn đặc biệt. Trên môi trƣờng đặc xạ khuẩn phát triển thành
những khuẩn lạc khô, kích thƣớc khuẩn lạc thay đổi tùy từng loại và điều kiện hoàn cảnh. Khuẩn
lạc xạ khuẩn không trơn ƣớt nhƣ ở vi khuẩn, nấm men mà thƣờng có dạng thô ráp, có các
nếp toả ra theo hình phóng xạ vì vậy mới có tên gọi là xạ khuẩn (actinomycetes, tếng Hi
Lạp: Akts là “ta”, mykes là “nấm”). Khuẩn lạc xạ khuẩn thƣờng chắc (dùng que cấy không di
đƣợc khuẩn lạc của xạ khuẩn vì khuẩn ty cơ chất bám sâu trong thạch). Mặt khuẩn lạc xù xì, có
dạng da, dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo. Khuẩn lạc của xạ khuẩn không thể lẫn
với khuẩn lạc của nấm vì khuẩn ty của xạ khuẩn thƣờng mảnh hơn của nấm mốc (khuẩn ty cơ

thể thon lại, uốn cong hay kéo dài. Những đặc điểm này

9


rất quan trọng khi định tên xạ khuẩn. Cuống sinh bào tử xạ khuẩn hình thành bào tử
theo 3 phƣơng thức sau:
- Phƣơng thức phát triển toàn bộ: toàn bộ hay một bộ phận của khuẩn ty hình thành ra
các thành của bào tử.
- Phƣơng thức phát triển trong thành: thành bào tử sinh ra từ tầng nằm giữa màng
nguyên sinh chất và thành khuẩn ty. Trƣờng hợp này gặp ở Planomonospora.
- Phƣơng thức phát triển bào tử nội sinh thật: thành khuẩn ty không tham gia vào
quá trình hình thành bào tử. Trƣờng hợp này gặp ở Thermoactnomycetes [3].
- Hình thái bảo tử cũng là một đặc điểm quan trọng trong định tên xạ khuẩn. Bào tử
trần (conodiospore) của xạ khuẩn có thể có hình tròn, hình bầu dục, hình que, hình trụ. Bề mặt
bào tử xạ khuẩn có dạng trơn nhẵn, xù xì, có vẩy, có gai, có lông. Bào tử trần là cơ quan
sinh sản chủ yếu của xạ khuẩn. Bào tử trần đƣợc hình thành đồng thời trên tất cả chiều dài
của cuống sinh bào tử theo hai phƣơng thức khác nhau:
- Vách ngăn hình thành dần từ phía trong của màng tế bào và tến dần vào trong tạo ra
những vách ngăn không hoàn chỉnh, sau đó sợi bào tử mới phân cắt thành các bào tử trần.
- Thành tế bào và màng tế bào đồng thời xuất hiện vách ngăn tến dần vào phía trong
làm cho sợi bào tử phân cắt, đồng thời tạo thành chuỗi bào tử trần [3].
Muốn kích thích hình thành bào tử, trƣớc hết phải kích thích sự sinh trƣởng của khuẩn
ty khí sinh. Ví dụ khi nghiên cứu 6 chủng S. griseus, Kalakoutski và Agre (1973) nhận thấy
muốn kích thích khuẩn ty khí sinh nên sử dụng các môi trƣờng có bổ sung pepton, NaCl và
glixerin. Một số tác giả khác cho rằng việc bổ sung CaCO3 và CaCl2 vào môi trƣờng cũng kích
thích quá trình hình thành bào tử ở xạ khuẩn. Tuy nhiên việc bổ sung các nguyên tố vào môi
trƣờng phải đƣợc nghiên cứu kỹ và chỉ sử dụng ở nồng độ nhất định. Môi trƣờng nuôi cấy
nghèo dinh dƣỡng sẽ kích thích hình thành bào tử ở xạ khuẩn còn môi trƣờng nuôi cấy giàu
dinh dƣỡng thì quá trình sinh bào tử thƣờng bị kìm hãm. Độ ẩm và nhiệt độ cũng có ảnh hƣởng

Đối với sinh tổng hợp chất kháng sinh ở xạ khuẩn, ngƣời ta thƣờng mô tả hai pha: pha
sinh trƣởng (trophophase): khuẩn ty sơ cấp phát triển nhanh với nguyên sinh chất đồng nhất
làm giảm nguồn cacbon, nitơ và pH; pha sinh tổng hợp (idiophase): sinh trƣởng chậm lại đôi
khi xuất hiện quá trình tự tan của khuẩn ty và sinh tổng hợp chất kháng sinh mạnh [6, 16].
Cũng có tác giả chia sự phát triển của giống thành 4 hoặc 6 pha theo các đặc điểm sinh hoá tế
bào. Trong một số trƣờng hợp quá trình sinh học này lại diễn ra mạnh mẽ trong pha sinh
trƣởng nhƣ trƣờng hợp của chủng xạ khuẩn Saccharothrix sp. SA 103 phân lập từ Sahara của
Algeria, sinh kháng sinh mutactmycin PR (Anthracycline mới). Quá trình tƣơng tự cũng đã
thấy ở chủng Saccharothrix sp. SA 233 sinh dithiolopyrrolone và chủng S. clavuligerus sinh axit
clavulanic [12,30].
Mặc dù chất kháng sinh có cấu trúc khác nhau và vi sinh vật sinh ra nó cũng đa dạng
nhƣng quá trình sinh tổng hợp chúng dƣờng nhƣ theo một số con đƣờng nhất định. Các con
đƣờng này chỉ là sự cải biên các con đƣờng sinh tổng hợp của tế bào. Các vật liệu ban đầu
của của qúa trình chuyển hoá chất trao đổi bậc hai (chất kháng sinh) là những chất trao đổi sơ
cấp. Chất kháng sinh đƣợc tổng hợp từ 1, 2 hoặc 3 chất trao đổi bậc nhất, hoặc có thể là trùng
hợp các hợp chất bậc nhất rồi biến đổi chúng bằng các enzim. Mọi con đƣờng sinh tổng hợp
chất kháng sinh đều có sự tham gia của các enzim hoặc hệ thống enzim đặc biệt. Các enzim này
đƣợc mã hoá bởi các gen nằm trong những cụm (cluster) trên nhiễm sắc thể hoặc trên plasmit.
Ví dụ tổng hợp chlotetraxyclin ở S. aureofaciens có 3 hệ thống enzim (hay hệ thống gen) tham
gia: hệ thống 1 với hơn 200 gen mã cho các enzim chuyển glucoza thành axetyl-CoA; hệ
thống 2 chuyển axetyl-CoA thành malonyl-CoA; hệ thống 3 chuyển malonyl CoA

12


thành chlotetracyclin. Tổng số gen ở 3 hệ thống liên quan tới tổng hợp chlotetracyclin lên tới
2000 gen [16,31,32,35].
Các chất kháng sinh từ xạ khuẩn rất phong phú và đa dạng, nguyên nhân là 1 loại kháng
sinh có thể do nhiều loài vi sinh vật khác nhau tổng hợp ra, cũng có khi 1 loại vi sinh vật tạo ra
nhiều loại kháng sinh khác nhau [31, 32]. Ví dụ, có tới 27 chủng xạ khuẩn khác nhau có thể

kỹ thuật khuếch đại gen nhờ plasmit. Kết quả của những nghiên cứu cơ bản này đã giúp cho
việc lựa chọn những giống có hoạt lực cao trong các điều kiện nuôi cấy ổn định và hình thành
quy trình công nghệ áp dụng trong sản xuất có quy mô rộng lớn [1, 9].
1.2.2. Phân loại và định tên xạ khuẩn
Trong số xạ khuẩn đã đƣợc đặt tên thì Actinomyces Hart

là loài lâu đời nhất.

Actinomyces israeli đƣợc coi là chủng xạ khuẩn kị khí thuần chủng đầu tên (1889), vì trƣớc khi
phát triển phƣơng thức giữ giống đông khô thì khó có thể bảo quản vi sinh vật lâu dài và
nhiều chủng giống đã bị thất lạc. Do vậy không có chủng xạ khuẩn nào đƣợc tm ra sớm hơn
các chủng mà Waksman phát hiện và lƣu trong danh mục Bộ sƣu tập giống của ông (19161919). Cho đến nay, có thêm rất nhiều chủng xạ khuẩn đƣợc lƣu trong danh mục giống xạ
khuẩn [6, 14].
Ba phƣơng pháp phân loại xạ khuẩn là phƣơng pháp phân loại truyền thống, phƣơng
pháp phân loại bằng kỹ thuật phân tử và phân loại số.
a)

Phương pháp phân loại truyền thống
Krainski (1914) lần đầu tên đề ra các chỉ têu về đặc điểm sinh lí và coi đó là mấu chốt

trong nguyên tắc phân loại để sơ bộ phân loại 17 chủng thuộc chi Actinomyces. Waksman và
Curts (1916), Waksman (1919) đã đề cập đến những dạng trung gian trong mô tả phân loại của
mình và coi đặc điểm hình thái của bào tử là đặc tnh quan trọng của các cá thể. Do vậy họ đã
đƣa ra một số loài mới có ý nghĩa. Tiếp đó Millard và Burr (1926) tm ra 17 loài, Jensen (19301931) – 2 loài, Dunche (1934)

14


– 13 loài. Baldacci và cộng sự đã bắt đầu nghiên cứu xạ khuẩn từ năm 1936 và đến năm
1953 công bố một khoá phân loại chi Streptomyces dựa trên cơ sở màu sắc khuẩn ty khí sinh,



ngƣời ta vẫn dùng 3 phƣơng pháp chính: lai ADN, lai ARN và phân tch rARN 16S [37, 38]. Kết
quả đƣợc biểu hiện bằng số phần trăm sự đồng nhất (homology). Hiện nay, đại đa số các nhà
khoa học đồng ý với quan niệm hai chủng đƣợc coi là hai loài riêng biệt nếu chúng giống nhau
dƣới 70% khi tến hành lai ADN. Phân tch rARN
16S để liệt kê thứ tự các nucleott đặc trƣng của cá thể và so sánh với bảng liệt kê của cơ thể
khác để xác định mức độ giống nhau của chúng. Keswani và cộng sự đã chứng minh rằng nếu
sự tƣơng đồng giữa hai trình tự rADN 16S là 98.6% thì xác suất để mức độ giống nhau trong
phép lai ADN thấp hơn 70% sẽ là 99%. Vì thế giá trị tƣơng đồng 98.6% của trình tự rADN 16S
đƣợc coi là ngƣỡng để phân biệt hai loài khác nhau. Tuy nhiên, cũng có nhiều nhà khoa học
lấy giá trị này là 98%.
Bằng phƣơng pháp phân loại này, những kiến thức về phân loại cũng có nhiều thay đổi.
Ví dụ các nhà phân loại cho rằng chi Nocardia dị nhân (heterogeneous), nên về mặt di truyền
đã xếp loài Nocardia mediterranci sinh rifamixin vào chi Streptomyces và mang tên mới là
S. mediterranci; hợp nhất hai chi Streptomyces và Streptovertcillium vào một chi Streptomyces
hoặc chuyển loài Nocardia erythropolis vào chi Mycobacterium (mang tên mới M. rodochrous)
[23].
Vì số lƣợng các loài xạ khuẩn mới đƣợc mô tả ngày càng nhiều và để việc phân loại
nhanh, chính xác về di truyền phân tử, ngƣời ta đã sử dụng phƣơng pháp phân loại số
(dùng máy vi tnh) cũng nhƣ đƣa thêm các đặc điểm phân loại và phát sinh chủng loại.
c)

Phân loại số (Numerical taxonomy)

Phân loại số đã đƣợc Williams và cộng sự (1983) sử dụng để phân loại chi
Streptomyces và các chi có quan hệ gần gũi. Phƣơng pháp này dựa trên sự đánh giá về số lƣợng
mức độ giống nhau giữa các vi sinh vật theo một số lớn các đặc điểm, chủ yếu là các đặc
điểm hình thái, sinh lý – sinh hoá. Để so sánh các chủng với nhau từng đôi một, Sneath (1973)
đề nghị tnh hệ số giống nhau S (similarity) theo phƣơng trình sau: