BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
*****************

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH VI KHUẨN Bifidobacterium TỪ SẢN
PHẨM SỮA GAINPLUS ADVANCED IQ 3, KHẢO SÁT CÁC
YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG CỦA VI
KHUẨN Bifidobacterium

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2004 - 2008
Sinh viên thực hiện: ĐẶNG THỊ MỸ HÀ

Tháng 10/2008


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

**************

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH VI KHUẨN Bifidobacterium TỪ SẢN
PHẨM SỮA GAINPLUS ADVANCED IQ 3, KHẢO SÁT CÁC
YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG CỦA VI
KHUẨN Bifidobacterium


iii


TÓM TẮT
Đề tài nghiên cứu “Phân lập và xác định vi khuẩn Bifidobacterium từ sản
phẩm sữa GainPlus Advanced IQ 3, khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh
trưởng của vi khuẩn Bifidobacterium” do TS. Hoàng Quốc Khánh hướng dẫn, được
Đặng Thị Mỹ Hà thực hiện tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới và trường Cao đẳng Kinh Tế Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh, thời gian từ tháng 3 năm 2008 đến tháng 9 năm
2008.
Thí nghiệm được tiến hành với hai nội dung chính:
1. Phân lập và xác định vi khuẩn Bifidobacterium từ sản phẩm sữa bằng:
- Thử nghiệm sinh lí và sinh hóa (nhuộm gram, quan sát hình thái, thử nghiệm
khả năng sinh acid, định tính acid lactic, khả năng lên men các nguồn carbohydrate).
- Kỹ thuật sinh học phân tử (PCR) với cặp mồi được sử dụng theo Matsuki
(2003) là: g – Bifid – F : 5’ – CTCCTGGAAACGGGTGG – 3’ và
g – Bifid – R: 5’ – GGTGTTCTTCCCGATATCTACA – 3’.
2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn
Bifidobacterium (nhiệt độ, pH, NaCl, tác nhân tạo điều kiện kỵ khí, điều kiện dao
động), nhằm kiểm tra khả năng sống sót của Bifidobacterium trong điều kiện tương
ứng trong đường tiêu hóa của người, phục vụ cho mục tiêu ứng dụng vào probiotic,
cũng như tìm ra điều kiện nuôi cấy phù hợp thu được lượng sinh khối lớn, đi vào
những thí nghiệm sâu hơn về Bifidobacterium.
Các kết quả thử nghiệm đã khẳng định:
1. Vi khuẩn phân lập thuộc giống vi khuẩn Bifidobacterium
2. Khả năng sống sót của Bifidobacterium ở điều kiện tương tự trong đường
tiêu hóa của người: 370C, pH 5 – 7,5, NaCl 0 – 7%, phù hợp với yêu cầu ứng dụng
vào các sản phẩm probiotic.

iv

SUMMARY....................................................................................................................v
MỤC LỤC .....................................................................................................................vi
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ...........................................................................x
DANH SÁCH CÁC BẢNG ..........................................................................................xi
DANH SÁCH CÁC HÌNH.......................................................................................... xii
DANH SÁCH SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ VÀ BIỂU ĐỒ......................................................... xiii
Chương 1: MỞ ĐẦU ......................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề ...............................................................................................................1
1.2. Mục đích ...........................................................................................................................1
1.3. Yêu cầu ....................................................................................................................1
Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.............................................................................2
2.1. Các nghiên cứu về Bifidobacterium .......................................................................2
2.1.1. Các nghiên cứu ngoài nước .................................................................................2
2.1.2. Các nghiên cứu trong nước...................................................................................2
2.2. Tổng quan về giống Bifidobacterium ......................................................................2
2.2.1. Đặc điểm phân loại...............................................................................................2
2.2.2. Đặc điểm hình thái................................................................................................5
2.2.3. Đặc điểm sinh lý...................................................................................................5
2.2.3.1. Dạng hô hấp.......................................................................................................5
2.2.3.2. Nhiệt độ và pH...................................................................................................6
2.2.3.3. Quá trình trao đổi chất.......................................................................................7
2.2.3.4. Nhu cầu dinh dưỡng ........................................................................................10
2.2.3.5. Tính kháng kháng sinh ....................................................................................11
2.2.4. Thành phần vách tế bào .....................................................................................11
2.2.5. Đặc điểm di truyền .............................................................................................12
vi


2.2.5.1. Thành phần DNA ............................................................................................12
2.2.6. Phân bố của giống Bifidobacterium ...................................................................13

vii


3.3.2. Tuyển chọn vi khuẩn kỵ khí bắt buộc ................................................................23
3.3.3. Xác định giống Bifidobacterium ........................................................................24
3.3.3.1. Xác định Bifidobacterium dựa vào hình thái...................................................24
3.3.2.2. Nhuộm gram....................................................................................................24
3.3.2.3 Khảo sát khả năng di động ...............................................................................25
3.3.2.4 Thử nghiệm hoạt tính catalase..........................................................................25
3.3.2.5. Khảo sát khả năng sinh acid ............................................................................26
3.3.2.6. Định tính acid lactic.........................................................................................26
3.3.2.7. Thử nghiệm khả năng lên men các nguồn carbohydrate.................................26
3.3.2.8. Xác định Bifidobacterium bằng phương pháp PCR ........................................27
3.4. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng
của vi khuẩn Bifidobacterium.......................................................................................30
3.4.1. Xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa độ đục và mật độ tế bào .............31
3.4.2. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ........................................................31
3.4.3. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện pH................................................................32
3.4.4. Kiểm tra ảnh hưởng NaCl ..................................................................................32
3.4.5. Khảo sát ảnh hưởng của các tác nhân kỵ khí lên sự sinh trưởng
của vi khuẩn Bifidobacterium.......................................................................................33
3.4.6. Khảo sát ảnh hưởng của sự dao động lên sự sinh trưởng
của vi khuẩn Bifidobacterium.......................................................................................33
Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN....................................................................35
4.1. Phân lập và chọn giống..........................................................................................35
4.1.1. Phân lập giống Bifidobacterium .........................................................................35
4.1.2. Tuyển chọn vi khuẩn kỵ khí bắt buộc ................................................................36
4.2. Xác định giống Bifidobacterium ..........................................................................37
4.2.1. Định tính gram và đặc điểm hình thái tế bào .....................................................37
4.2.2. Khả năng di động của vi khuẩn khảo sát............................................................38

- AOAC:

Association of Analytical Communities

- bp:

base pair

- CFU:

Colony forming unit

- dNTP:

Deoxyribonucleoside triphosphate

- DNA:

Deoxyribonucleic acid

- EDTA:

Ethylene diamine tetraacetic acid

- F – 6 – PPK:

Frutose – 6 – phosphate phosphoketolase

- FDA:


- OD:

Optical Density

- PCR:

Polymerase Chain Reaction

- SPW:

Saltly Peptone Water

- TAE:

Tris - acetate

- TCA:

Trichloro acetic acid

- UV:

Ultra violet

- WY:

Whey

x


TRANG

Hình 2.1: Hình thái của vi khuẩn Bifidobacterium ........................................................5
Hình 4.1: Khuẩn lạc vi khuẩn khảo sát trên môi trường MRS.....................................35
Hình 4.2: Khuẩn lạc của vi khuẩn khảo sát trên môi trường MRS ..............................36
Hình 4.3: Vi khuẩn được cấy đâm sâu trong môi trường MRS Agar ..........................37
Hình 4.4: Hình thái vi khuẩn khảo sát sau khi nhuộm gram (x100) ............................37
Hình 4.5: Khả năng phân giải CaCO3 của vi khuẩn khảo sát.......................................38
Hình 4.6: Định tính acid lactic của vi khuẩn khảo sát..................................................39
Hình 4.7: Khả năng lên men các nguồn carbohydrate của vi khuẩn khảo sát..............40
Hình 4.8: Bảng điện di các DNA khuếch đại của vi khuẩn khảo sát ...........................41

xii


DANH SÁCH SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ VÀ BIỂU ĐỒ
SƠ ĐỒ

TRANG

Sơ đồ 2.1: Đồng hóa oxigen của Bifidobacterium .........................................................6
Sơ đồ 2.2: Quá trình chuyển hóa các nguồn carbohydrate
của vi khuẩn Bifidobacterium.........................................................................................7
Sơ đồ 2.3: Con đường trao đổi chất của Bifidobacterium ..............................................8
Sơ đồ 2.4: Cấu trúc peptidoglycan của Bifidobacterium bifidum ................................12
Sơ đồ 3.1: Phân lập và chọn lọc giống vi khuẩn kỵ khí ...............................................23
Sơ đồ 3.2: Nguyên tắc của phương pháp PCR .............................................................29
ĐỒ THỊ
Đồ thị 4.1: Đường chuẩn tuyến tính giữa giá trị OD600
và mật độ tế bào vi khuẩn.............................................................................................42

khả năng ứng dụng loại vi sinh vật này vào trong các chế phẩm probiotic là rất lớn.
Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về giống vi khuẩn này, tuy nhiên, ở Việt Nam
do những điều kiện khách quan, những nghiên cứu về giống vi khuẩn này vẫn còn hạn
chế và ít được quan tâm, do vậy chúng tôi thực hiện khóa luận “Phân lập và xác định
vi khuẩn Bifidobacterium từ sản phẩm sữa GainPlus Advanced IQ 3, khảo sát các
yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi khuẩn Bifidobacterium”, mong góp
một phần nhỏ vào những nghiên cứu hiện nay và sau này.
1.2. Mục đích
Phân lập và xác định chủng Bifidobacterium, kiểm tra khả năng sống sót và tìm
ra điều kiện nuôi cấy phù hợp nhằm thu được một lượng lớn sinh khối vi sinh vật.
1.3. Yêu cầu
Sử dụng nhiều phương pháp khác nhau để xác định vi khuẩn Bifidobacterium từ
các sản phẩm sữa phân lập bằng các thử nghiệm sinh lí và sinh hóa và kỹ thuật PCR.
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của Bifidobacterium
trong điều kiện tương tự điều kiện trong đường ruột người (điều kiện nhiệt độ, yếu tố
pH, nồng độ NaCl, điều kiện dao động, yếu tố kỵ khí).
1


Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Các nghiên cứu về giống Bifidobacterium
2.1.1. Các nghiên cứu ngoài nước
Năm 1899, Tisser [37] đã phân lập và miêu tả được vi khuẩn kỵ khí từ phân
trẻ sơ sinh bú sữa mẹ và ông đặt tên là Bacillus bifidus communis.
Pacher và Kneifel (1996) đã phát hiện và định lượng Bifidobacterium trong
các sản phẩm lên men sữa.
Matsuki (2003) [34] đã dựa vào trình tự 16S rDNA của giống vi khuẩn
Bifidobacterium, thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR cho việc xác định và

vi sinh vật. Do đó, năm 1967, De Vries và Stouthamer chứng minh ở Bifidobacterium
có sự hiện diện của enzyme frutose – 6 – phosphate phosphoketolase (F – 6 – PPK) và
không có hai enzyme aldolase và glucose – 6 – phosphatase dehydrogenase, là hai
enzyme được tìm thấy ở lactobacilli. Sau đó, họ kết luận rằng việc đưa
Bifidobacterium vào giống Lactobacillus là không đúng. Từ đó hình thành hai khuynh
hướng đối lập: Các nhà khoa học Pháp phân tách Lactobacillus và Bifidobacterium
thành hai giống riêng biệt. Các nhà khoa học Anglo – Saxon đưa Bifidobacterium vào
giống Lactobacillus.
Tiến bộ của kĩ thuật phân loại hóa học vào những thập niên 60 đã mở ra một
bước tiến mới cho ngành phân loại học dựa trên những đặc điểm sinh hóa. Việc nghiên
cứu những đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn prokaryote đã cho thấy việc phân tích
các thành phần của tế bào có thể trở thành một công cụ hữu hiệu cho việc phân loại
và xác định vi khuẩn. Năm 1965, bằng kĩ thuật di truyền phân tử, Sebald và Werner
[33, 38] đã cho thấy phần trăm guanine và cysteine (G + C%) trong DNA của vi khuẩn
Bifidobacterium khác so với Lactobacillus, Corynebacterium và Propionibacterium.
Bảng 2.1: Phân loại khoa học của Bifidobacterium [27]
Ngành

Firmicutes

Lớp

Actinobacteria

Lớp phụ

Actinobacteridae

Bộ


Bergey’s Manual

1920

Bifidobacterium bifidum

Holland

1924

Bacterium bifidum

Orla-Jensen

1927

Tisseria bifida

Lehmann và Neumann

1929

Nocardia bifida

Pribram

1931

Actinomyces bifidus


Prevot

Cohnistreptothrix bifidus

Bergey’s Manual

1944

Corynebacterium bifidum

Negrovi và Fischer

1949

Lactobacillus bifidus

Olsen

1950

Lactobacillus bifidus var.
pennsylvanicus

Norris và cộng sự

1900
1919
1923 – 1934

1939 – 1957

Scadovi

1972

Bảng giống Bifidobacterium tổng hợp

Holdemann và Moore

từ 11 loài

Bergey’s Manual

4

1974


2.2.2. Đặc điểm hình thái
Vi khuẩn thuộc giống Bifidobacterium có dạng phổ biến hình que, không di
động và không sinh bào tử. Chúng có màng tế bào không bình thường, dạng lõm, các
chi của chúng thường phồng lên thành dạng u, giống như phân nhánh. Tuy nhiên,
Bifidobacterium có sự biến đổi khác thường từ dạng tròn thành dạng dài hoặc ngắn,
biến thể ở mức độ rộng. Việc nhuộm gram cho thấy sự phân bổ khác thường của
chromatin, thường được tích lũy ở hai khối u. Sự đa hình này không gây ra sự thoái
hóa các dòng phát sinh từ dạng gốc.

Hình 2.1: Hình thái của vi khuẩn Bifidobacterium [40, 41, 42]
Tùy theo thành phần môi trường nuôi cấy, chúng có thể có các dạng V, Y và X.
Nhiều thành phần của môi trường có thể tác động lên hình dạng của vi khuẩn:
Nồng độ của N – acetylglucosamine liên quan đến quá trình sinh tổng hợp


Con đường F6PPK

Acid acetic
Acid lactic

NADH

O2
O2 NADH: H2O2-oxidase

O2

H2O2

Superoxide
dismutase

NADH-peroxidase

H 2O

H2O2

Sơ đồ 2.1: Đồng hóa oxigen của Bifidobacterium [34]
2.2.3.2. Nhiệt độ và pH [30]
Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của các dòng Bifidobacterium có nguồn gốc từ
người là khoảng từ 36 – 380C. Trái lại, các dòng có nguồn gốc từ thú thì cao hơn,
khoảng 41 – 430C và thậm chí đạt đến 46,50C, sự tăng trưởng bị ức chế ở mức dưới
200C và trên 460C, chết ở 600C.


Pructose 6-P
2
Pi
Acetyl-P
2 Acetyl-P

Erythrose 4P

Glyceraldehyde 3-P

3 ADP
3 ATP

8

Sedoheptulose 7-P

3 Acetate
4

2 Pi
7

Ribose 5-P
5

1+1 Xylulose 5-P 2 Glyceraldehyde 3-P
2 Pi



Acetate

?

12

2 Phosphoenolpyruvate

Formate

15

13

2 ADP
2 ATP

2 Pyruvate
16

14

2 (NADH+H+)
2 NAD+

2 L(+) Lactate

1 - hexokinase and glucose-6-phosphate isomerase;
2 - fructose-6-phosphate phosphocetolase;

B.longum sản xuất một lượng lớn vitamin B2 và B6.
B.breve và B.infantis tạo lượng lớn vitamin PP.
Bảng 2.3 : Tổng hợp các vitamin bởi vi khuẩn Bifidobacterium [17]
B.breve

B.infantis

B.longum

B.bifidum

B.aldolescentis

Thiamine (B1)

+

+++

+

+++

+

Riboflavin (B2)

+

+


Cobalamine (B12)

+

++

+++

+

+

Ascorbic acid (C)

++

++

+++

++

+

Nicotinic acid (PP)

+++

+++

tổng hợp một lượng lớn amino acid. Điển hình, B.bifidum tạo ra alanine, valine, acid
aspartic và trên 150 mg/l threonine (Matteuzi, 1978) [22].
Theo Hatanaka và cộng sự (1987) [15, 16], hai enzyme glutamine synthetase và
glutamate dehydrogenase của Bifidobacterium có lẽ liên quan đến quá trình tiêu hóa
các phức hợp nitrogen của vi sinh vật.
 Các nguyên tố
B.bifidum chỉ sinh trưởng trong điều kiện có Mg, Mn và một lượng lớn các iron.
Iron có thể được tiêu hóa bởi B.bifidum trong hầu hết các quá trình oxy hóa, phụ thuộc
vào tính acid của môi trường (Bezkorovainy, 1986 và Ueda, 1983).
Iron Fe2+ được sử dụng ở pH 5. Việc vận chuyển dựa vào màng ATPase và việc
hấp thu nó có thể bị ức chế cạnh tranh bởi Zn. Iron Fe3+ được sử dụng ở pH trung tính.
Các iron này liên hệ đến quá trình sản sinh acid acetic của B.bifidum qua trung gian
các ferroenzyme (Bezkorovainy, 1986) [8]
 Các vitamin [34]
Các dòng Bifido có nguồn gốc từ người cần thiamine (B1), pyridoxine (B6),
acid forlic (B9), cyanocobalamine (B12) và acid nicotinic (PP) cho sự tăng trưởng
của chúng. (Teraguchi và cộng sự, 1984).
 Các yếu tố tăng trưởng [34]
Poch và Bezkorovainy (1988) bổ sung vào môi trường cơ bản các tác nhân
tăng trưởng để xác định những yếu tố thiết yếu cho sự phát triển của các dòng
Bifidobacterium. Chỉ có B.aldolescentis và B.longum có thể phát triển được trong môi
trường không bổ sung yếu tố tăng trưởng. Còn tất cả các dòng khác yêu cầu sự
hiện diện của các yếu tố tăng trưởng.
Năm 1953, Gyorgy phát hiện ra một dòng của B.bifidum (sau này được biết là
L.bifidus), dòng này chỉ phát triển trong điều kiện có sữa người và đặc biệt có

10


N – acetylglucosamine. Loài Bifidobacterium bifidum do Tisser phát hiện cần các yếu

các chuỗi polysaccharide mạch thẳng liên kết với nhau bằng cầu nối tetrapeptibringen.
11


Chuỗi polysaccharide chứa N – acetylglucosamine (NAG) hoặc N – acetylmuramic
acid (NAM). Tetrapeptide liên kết với NAM qua cầu nối peptide trung gian.
Các amino acid cấu thành nên các chuỗi peptide là alanine, glutamic acid,
ornithine hoặc lysine liên kết với một hoặc hai amino acid sau: glycine, serine,
aspartic acid hoặc threonine. Các amino acid có thể giống hoặc khác nhau giữa các
dòng, thậm chí khi các amino acid giống nhau thì trình tự của chúng trong các chuỗi
tetrapeptide cũng khác nhau, có thể chứa amino acid đơn, dipeptide hoặc tripeptide.
Điển hình như B.longum có cầu nối tetrapeptide loại ornithine và chuỗi liên kết
là L – Ser – L – Alar – L – Thr – L – Alar (Rasic, 1983).

N-AcetylD-glucosamine

N-Acetylmuramic acid

N-AcetylD-glucosamine

N-Acetylmuramic acid

L-Alanine

L-Alanine

D-Glutamic acid

D-Glutamic acid