BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA MỘT
SỐ LOẠI CAO CHIẾT VÀ BƯỚC ĐẦU ĐỊNH TÍNH
THÀNH PHẦN HÓA HỌC HOA SỨ VÀNG
(PLUMERIA RUBRA F. TRICILOR)
Ngành:

Công nghệ Sinh học

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Giảng viên hướng dẫn : ThS. Phạm Minh Nhựt
Sinh viên thực hiện
MSSV: 1311100485

: Đinh Vũ Nghị
Lớp: 13DSH04

TP. Hồ Chí Minh, 2017


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN
Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướng
dẫn của ThS. Phạm Minh Nhựt, giảng viên khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm –
Môi trường, Trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh.

Sinh viên thực hiện

ĐINH VŨ NGHỊ


Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC
MỤC LỤC ........................................................................................................................i
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT......................................................................................... v
DANH MỤC BẢNG ......................................................................................................vi
DANH MỤC HÌNH ẢNH ............................................................................................vii
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1
1. Tính cấp thiết của đề tài ......................................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................... 2
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN.......................................................................................... 3
1.1. Đại cương về Hoa Sứ vàng .................................................................................. 3
1.1.1. Nguồn gốc và tên gọi ....................................................................................... 3
1.1.2 Phân loại .......................................................................................................... 3
1.1.3. Đặc điểm hình thái .......................................................................................... 4
1.1.4. Phân bố............................................................................................................ 5
1.1.5. Tác dụng dược lý ............................................................................................. 5
1.1.6. Công dụng ....................................................................................................... 5
1.1.7. Thành phần hóa học và dược chất .................................................................. 6
1.2. Đại cương về một số hợp chất kháng khuẩn từ thực vật ................................. 7
1.2.1 Khái niệm và phân loại .................................................................................... 7
1.2.2. Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất từ thực vật ......................................... 7
1.2.3. Một số hợp chất kháng khuẩn trong Hoa Sứ vàng .......................................... 8
1.2.3.1. Alkaloid ..................................................................................................... 8

2.2.4.1. Thiết bị .................................................................................................... 26
2.2.5.2. Dụng cụ ................................................................................................... 26
2.3. Các phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 27
2.3.1. Phương pháp tách chiết các hợp chất từ thực vật......................................... 27
2.3.2. Phương pháp tăng sinh ................................................................................. 27
2.3.3. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật .......................................... 27
2.3.3.1. Phương pháp cấy truyền vi sinh vật ........................................................ 27

ii


Đồ án tốt nghiệp

2.3.3.2. Phương pháp bảo quản lạnh sâu ............................................................. 28
2.3.4. Phương pháp xác định mật độ tế bào............................................................ 28
2.3.5. Phương pháp pha loãng mẫu ........................................................................ 28
2.3.6. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ....................... 29
2.3.7. Phương pháp xác định thành phần hóa học.................................................. 29
2.3.9. Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................. 32
2.4. Bố trí thí nghiệm ................................................................................................ 32
2.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt tính
kháng khuẩn của cao chiết Hoa Sứ vàng. ............................................................... 36
2.4.3. Thí nghiệm 3: Định tính một số thành phần hóa học của các loại cao chiết từ
Hoa Sứ vàng. ........................................................................................................... 38
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 40
3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hàm lượng thu hồi
cao từ Hoa Sứ vàng ................................................................................................... 40
3.2. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Hoa Sứ vàng với các
loại dung môi tách chiết khác nhau trên các chủng vi khuẩn chỉ thị. .................... 41
3.2.1. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
TSB: Trypton Soya Broth
TSA: Trypticase Soya Agar
DMSO: Dimethyl Sulfoxide
NA: Non activity
DNA: Deoxyribonucleic acid
RNA: Ribonucleic acid

v


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Kết quả đường kính vòng ức chế (mm) các loại cao chiết khác nhau từ Hoa
Sứ vàng đối với 20 chủng vi sinh vật chỉ thị.................................................................. 55
Bảng 3.2. Kết quả định tính một số thành phần hóa học của cao chiêt Hoa Sứ vàng từ
ethanol 70%. ................................................................................................................... 59

vi


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Hoa Sứ vàng ..................................................................................................... 3
Hình 1.2. Cây Hoa Sứ vàng ............................................................................................. 4
Hình 1.3. Công thức hóa học của fulvoplumierin và plumierid ...................................... 6
Hình 1.4. Hình thái E.coli trên kính hiển vi điện tử ....................................................... 16


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Việt Nam là nước có hệ thực vật rất phong phú và đa dạng. Tổng số loài thực
vật đã ghi nhận ở Việt Nam khoảng 10.500 loài trong tổng số 12.000 loài theo ước
tính. Trong số đó, nguồn tài nguyên cây làm thuốc chiếm khoảng 30%. Kết quả điều tra
nguồn tài nguyên cây thuốc của Viện Dược liệu (2006) cho biết ở Việt Nam có 3.948
loài thực vật bậc cao, bậc thấp và nấm lớn được dùng làm thuốc. Trong thời gian qua,
nước ta đã có hơn 3.000 loại thuốc có nguồn gốc từ thảo dược được cấp số đăng ký,
chiếm gần 1/3 trong tổng số thuốc mới được cấp số đăng ký lưu hành hàng năm. Như
vậy nhu cầu sử dụng cây dược liệu chế xuất thuốc trong nước là rất lớn. Không những
vậy, việc sử dụng dược phẩm có nguồn gốc thiên nhiên cũng đang được các nước trên
thế giới hết sức quan tâm.
Cây thuốc được coi là di sản quý báu của dân tộc ta.Từ xa xưa, cây thuốc gắn
liền với cuộc sống của các gia đình người Việt và có giá trị lớn trong điều trị bệnh. Tuy
chỉ là những cỏ cây gần gũi, thân quen xung quanh con người nhưng chúng được sử
dụng tạo ra các bài thuốc rất hữu hiệu. Các loài thuốc thảo mộc ít gây tác dụng phụ,
độc hại cho người sử dụng và có khả năng dung nạp tốt với cơ thể sống.Hiện nay, hoạt
tính kháng khuẩn của cây thuốc ngày càng được nghiên cứu và phát triển nhiều hơn bởi
các nhà khoa học đã nhận ra các giá trị to lớn từ cây thuốc mang lại cho việc điều trị
bệnh. Trong thời đại mà việc sử dụng thuốc kháng sinh không còn hiệu quả thì thảo
dược tự nhiên là câu trả lời đáng tin cậy và dài hạn cho việc ức chế vi sinh vật có hại và
nâng cao đề kháng, hỗ trợ tốt cho quá trình điều trị bệnh. Theo một số nghiên cứu, các
loại thảo dược điển hình như Trầu Không (Piper betle L.), Sống Đời (Kalanchoe
pinnata (Lam). Pers.), Lô hội (Aloe barbadensis), Dâu Tằm (Morus acidosa Griff), Khổ
Qua (Momordica charantia L.)… đã được xác định là có hoạt tính kháng khuẩn rất
mạnh đối với nhiều loại vi khuẩn như Escherichia coli, Salmonella spp., Shigella spp.
… Chính vì thế mà ngày nay, không chỉ riêng ở Việt Nam mà cả trên thế giới, các nhà
1


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Đại cương về Hoa Sứ vàng
1.1.1. Nguồn gốc và tên gọi
Xuất xứ của hoa sứ từ Trung mỹ và Caribe. Ngày nay hoa sứ được tìm thấy
nhiều ở các hải đảo Thái Bình Dương, các quốc gia Nam Á, Ɖông Nam Á, Trung và
Nam Mỹ. Hoa sứ là quốc hoa của Lào và của Nicaragua, nơi hoa sứ được gọi
là Sacuanjoche. Quốc hiệu Champa mà ta gọi là Chiêm Thành có gốc tiếng Ấn Ɖộ
(Hindi) có nghĩa là cây hoa sứ.
Tên khoa học của cây hoa sứ là Plumeria rubra thuộc họ Apocynaceae của
trúc đào. Chữ Plumeria là tên của nhà thực vật học Pháp Charles Plumier vào thế kỷ
XVII. Người Anh gọi hoa sứ là temple tree vì ở Ấn Ɖộ và Sri Lanka cây hoa sứ được
trồng quanh các đền Ấn Giáo và chùa Phật Giáo. Nó cũng được trồng trong các nghĩa
địa. Ở Sri Lanka nó được xem là sinh mộc. Hoa sứ cũng còn được gọi là frangipani do
tên của hầu tước Ý Muzio Frangipani mà ra. Người Ấn Ɖộ gọi hoa sứ là Champa;
Lào:Champa; Sri Lanka tức đảo Ceylon: Champey; Indonesia: Kampoja; Trung
Hoa: Dai Ji Hua (Ɖại Cát Hoa); Khmer: Champei krahom (hoa sứ đỏ); tiếng Tagalog
(Phi Luật Tân): Kalasusi, v.v.
1.1.2 Phân loại
Lớp: Dicotyledons
Bộ: Gentianales
Họ: Apocynaceae (Trúc Đào)
Chi: Plumeria
Loài: P.rubra
Tên khoa học: Plumeria rubra L. tricilor
Tên thường gọi: Sứ cùi, cây Đại,…
Hình 1.1. Hoa Sứ vàng

3



vườn… Những đình, chùa, lăng miếu hay nghĩa trang cũng sử dụng loại cây này rất
nhiều.
1.1.5. Tác dụng dược lý
Hoa Sứ có vị ngọt, tính bình, thơm, có tác dụng thanh nhiệt, lợi tiểu, hòa vị,
nhuận tràng, bổ phổi. Có tác dụng hạ huyết áp rất rõ, ở hoa khô có tác dụng mạnh hơn
ở hoa tươi. Vỏ cây có vị đắng, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt, tả hạ, tiêu thủng, sát
trùng. Lá có tác dụng hành huyết, tiêu viêm. Nhựa có tác dụng tiêu viêm và làm mềm
những tổ chức rắn chai chân. (Võ Văn Chi, 2012).
1.1.6. Công dụng
Công dụng làm cảnh: Sứ có nhiều loại và màu sắc khác nhau, từ nhứng cây
nhỏ được trồng trong chậu đặt ở những vị trí nhỏ hẹp như sân thượng, ban công
nhà,…cho tới những cây lớn được trồng trong sân vườn, công viên, đình chùa,….đem
lại vẻ đẹp hương thơm từ hoa nở quanh năm và bóng mát từ tàn cây rộng.
Công dụng làm thuốc: Theo y học cổ truyền, các bộ phận sau của cây hoa sứ
có thể dùng làm thuốc như vỏ thân, vỏ rễ, hoa, nụ hoa, lá tươi và nhựa cây, nhưng sử
dụng nhiều nhất là hoa. Toàn cây có chứ một loại kháng sinh thực vật là fulvo
plumierin, có tác dụng ức chế sự tăng sinh và phát tiển của một số vi khuẩn
Mycobacterium tuberculosis. Từng bộ phận khác nhau của cây có những công dụng
khác nhau:
Hoa dùng trong các trường hợp như say nắng; viêm ruột, lỵ; khó tiêu, kém hấp
và kém dinh dưỡng ở trẻ em; nhiễm khuẩn, viêm gan; viêm phế khí quản, ho. Người ta
còn dùng hoa Sứ làm thuốc chữa bênh ưa chảy máu có kết quả tốt. Ngày dùng 10-15g
dạng thuốc sắc. Không dùng cho người suy nhược toàn thân, ỉa chảy và phụ nữ có thai.

5


Đồ án tốt nghiệp

Hoa sứ khô là nguyên liệu để làm gối rất tốt, có nhiều tác dụng trị bệnh mất ngủ, ngủ

siêu vi HIV-1 nơi người (Journal of Natural Products Số 54 (Jan-Feb)-1991).
1.2. Đại cương về một số hợp chất kháng khuẩn từ thực vật
1.2.1 Khái niệm và phân loại
Các hợp chất kháng khuẩn từ thực vật là những hợp chất hữu cơ có nguồn gốc
thực vật, có tác dụng tiêu diệt hay kìm hãm sự phát triển của các vi khuẩn, virus. Các
hợp chất kháng khuẩn thường có tác dụng khá đặc hiệu lên các loài vi khuẩn khác nhau
ở một nồng độ thường là rất nhỏ. Những chất này có thể thuộc nhiều cấu trúc hóa học
khác nhau như alkaloid, các hợp chất quinone, flavonoid, tinh dầu v.v…
Ngày nay người ta chia các hợp chất kháng khuẩn từ thực vật ra làm 2 nhóm
sau:
Nhóm bay hơi: gồm những chất do thực vật tiết ra có khả năng khuếch tán vào
không khí và có tác dụng ức chế sự sinh trưởng, phát triển của virus, vi khuẩn.
Nhóm không bay hơi: gồm những chất ở sâu trong các tế bào thực vật, không
có khả năng khuếch tán vào không khí. Muốn sử dụng nó, phải dựa vào đặc điểm, tính
chất của từng loại kháng sinh thực vật. Thường người ta hay sử dụng chúng dưới các
dạng: Giã nát lấy nước cốt, ngâm, sắc hoặc chiết bằng các dung môi thích hợp.
1.2.2. Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất từ thực vật
Cơ chế chung của các hợp chất kháng khuẩn có nguồn gốc thực vật bao gồm
việc phá vỡ màng chức năng và cấu trúc tế bào, gây ra sự gián đoạn quá trình tổng hợp
cùng chức năng của DNA và RNA, gây cản trở các chuyển hóa trung gian tế bào, gây
đông tụ các thành phần tế bào chất và làm gián đoạn quá trình truyền thông tin của tế
bào. Ngoài ra quá trình hoạt động kháng khuẩn còn bao gồm cả PSMs (Plant secondary
7


Đồ án tốt nghiệp

metabolites) tác động tới màng tế bào, khuếch tán qua màng tế bào rồi tác động tương
tác với các thành phần nội bào từ đó ảnh hưởng tác động tới hoạt động tế bào
(Radulovíc và ctv, 2013).

vàng như berberin, palmatin, chelidonin,
Độ tan: Nói chung các alkaloid base không tan trong nước, dễ tan trong các
dung môi hữu cơ như methanol, ethanol, ether, chloroform, benzen.. trái lại các muối
alkaloid thì dễ tan trong nước, hầu như không tan trong các dung môi hữu cơ ít phân
cực.
Đặc điểm hóa học: Hầu như alkaloid đều có tính base yếu, song cũng có chất
có tác dụng như base mạnh có khả năng làm xanh giấy quỳ đỏ như nicotin, cũng có
chất tính base rất yếu như cafein, piperin… vài trường hợp ngoại lệ có những alkaloid
không có phản ứng kiềm như colchicin, ricinin, theobromin và cá biệt cũng có chất có
phản ứng acid yếu như arecaidin, guvacin.
Do có tính base yếu nên có thể giải phóng alkaloid ra khỏi muối của nó bằng
những kiềm trung bình và mạnh như NH4OH, MgO, cacbonat kiềm, NaOH… khi định
lượng alkaloid bằng phương pháp đo acid người ta phải căn cứ vào độ kiềm để lựa
chọn chỉ thị màu cho thích hợp.
Tác dụng với acid, alkaloid cho các muối tương ứng.
Alkaloid kết hợp với kim loại nặng (Hg, Bi, Pt…) tạo ra muối phức.
Các alkaloid cho phản ứng với một số thuốc thử gọi là thuốc thử chung của
alkaloid.
c. Vai trò của alkaloid
Alkaloid nói chung là những chất có hoạt tính sinh học, có nhiều chất rất độc.
Tác dụng của alkaloid thường khác nhau. Nhiều alkaloid có tác dụng lên hệ thần kinh
trung ương gây ức chế như morphin, codein, scopolamin, reserpin hoặc gây kích thích
như strychnin, cafein, lobelin. Nhiều chất tác dụng lên hệ thần kinh giao cảm gây kích
thích: Ephedrin, hordenin, làm liệt giao cảm, ergotamin, yohimbin hoặc kích thích phó
giao cảm: pilocarpin, eserin; có chất gây liệt phó giao cảm: hyoscyamin, atropin; có
chất phong bế hạch giao cảm: nicotin, spartein, coniin.
9


Đồ án tốt nghiệp

Đồ án tốt nghiệp

hữu cơ, không tan trong nước. Các dẫn chất flavonoid có nhóm 7hydroxy thường dễ
tan trong dung dịch kiềm loãng.
c. Vai trò của flavonoid
Các dẫn chất flavonoid có khả năng dập tắt các gốc tự do như HO., ROO.. Các
gốc này sinh ra trong tế bào bởi nhiều nguyên nhân và khi sinh ra cạnh DNA thì sẽ gây
ra những ảnh hưởng nguy hại như gây biến dị, hủy hoại tế bào, gây ung thư, tăng
nhanh sự lão hoá.
Flavonoid cùng với acid ascorbic tham gia trong quá trình hoạt động của
enzyme oxy hoá - khử. Flavonoid được dùng trong các trường hợp rối loạn chức năng
tĩnh mạch, tĩnh mạch bị suy yếu, giãn tĩnh mạch, các bệnh trong nhãn khoa. Các dẫn
chất anthocyanosid có tác dụng tái tạo tế bào võng mạc.
Tác dụng chống độc của flavonoid thể hiện làm giảm thương tổn gan, bảo vệ
được chức năng gan. Flavonoid thể hiện tác dụng chống co thắt những tổ chức cơ nhẵn
(túi mật, ống dẫn mật, phế quản và một số tổ chức khác). Flavonoid còn có tác dụng
thông tiểu, chống loét chữa đau dạ dày, chống viêm điều trị ban đỏ, viêm da, tổn
thương da và màng nhầy trong trường hợp xạ trị, điều hòa nhịp tim.
Một số tài liệu gần đây có nói đến tác dụng chống ung thư của một số chất như
leucocyanidin, leucopelargonidin, leucodelphinidin và tác dụng kháng HIV của một số
dẫn chất thuộc nhóm flavon như chrysin, acacetin 7-O-b-Dgalactopyranosid.
1.2.3.3. Tinh dầu
a. Khái niệm về tinh dầu
Tinh dầu là một hỗn hợp của nhiều thành phần, thường có mùi thơm, không
tan trong nước, tan trong các dung môi hữu cơ, bay hơi được ở nhiệt độ thường và có
thể điều chế từ thảo mộc bằng phương pháp cất kéo hơi nước.
b. Tính chất chung của tinh dầu
Thể chất: Đa số là chất lỏng ở nhiệt độ thường, một số thành phần ở thể rắn:
Menthol, borneol, camphor, vanilin, heliotropin.
11

12


Đồ án tốt nghiệp

Saponin còn gọi là saponosid do chữ latin sapo là xà phòng (vì tạo bọt như xà
phòng), là một nhóm glycosid lớn, gặp rộng rãi trong thực vật. Người ta cũng phân lập
được saponin trong động vật như hải sâm, cá sao.
b. Tính chất chung của saponin
Saponin có một số tính chất đặc biệt: làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều
khi lắc với nước, có tác dụng nhũ hoá và tẩy sạch; làm vỡ hồng cầu ngay ở những
nồng độ rất loãng; có thể tạo phức với cholesterol hoặc với các chất 3-b hydroxysteroid khác.
Saponin gây độc với cá vì saponin làm tăng tính thấm của biểu mô đường hô
hấp nên làm mất các chất điện giải cần thiết, ngoài ra có tác dụng diệt các loài thân
mềm như giun, sán, ốc sên.
Saponin đa số có vị đắng, tan trong nước, alcol, rất ít tan trong aceton, ether,
hexan do đó người ta dùng 3 dung môi này để tủa saponin. Saponin khó bị thẩm tích,
người ta dựa vào tính chất này để tinh chế saponin trong quá trình chiết xuất.
c. Vai trò của saponin
Saponin có tác dụng long đờm, chữa ho. Một số dược liệu chứa saponin có tác
dụng thông tiểu như rau má, tỳ giải, thiên môn, mạch môn,... Saponin làm tăng sự thấm
của tế bào; sự có mặt của saponin sẽ làm cho các hoạt chất khác dễ hoà tan và hấp thu
Một số saponin có tác dụng chống viêm. Một số có tác dụng kháng khuẩn,
kháng nấm, ức chế virus. Một số có tác dụng chống ung thư trên thực nghiệm. Nhiều
saponin có tác dụng diệt các loài thân mềm (nhuyễn thể). Sapogenin steroid dùng làm
nguyên liệu để bán tổng hợp các thuốc steroid.
1.2.3.5. Tannin
a. Khái niệm chung về tannin
Từ "Tanin" được dùng đầu tiên vào năm 1796 để chỉ những chất có mặt trong
dịch chiết từ thực vật có khả năng kết hợp với protein của da sống động vật làm cho da

1.2.4. Tình hình nghiên cứu về Hoa Sứ trên thế giới và tại Việt Nam
Tình hình nghiên cứu về Hoa Sứ trên thế giới

14


Đồ án tốt nghiệp

 Năm 2010, Ajay Singh Baghel và cộng sự đã nghiên cứu về khả năng kháng
khuẩn của chiết xuất từ hoa Plumeria rubra L. bằng các loại dung môi nước,
ethanol, etyl acetate, chloroform.
 Năm 2015, Lawal và cộng sự đã khảo sát thành phần hóa học của chiết xuất
tinh dầu từ lá Plumeria rubra L. trồng ở Nigeria.
 Năm 2012, Ramproshad và cộng sự đã nghiên cứu chiết xuất etanol thô của
Plumeria rubra cho thấy có hoạt tính chống oxy hoá mạnh và có hoạt tính
kháng khuẩn trung bình. Hoạt động giảm đau của Plumeria rubra đã được
thử nghiệm bằng mô hình xoắn gây axit axetic ở chuột. Chiết xuất này gây
ra sự ức chế đáng kể ở liều 500mg/kg-thể trọng. Chiết xuất thô của
Plumeria rubra trong thí nghiệm cho thấy nó có hoạt tính giảm đau mạnh.
 Năm 2014, Muruganantham và cộng sự đã nghiên cứu khả năng kháng
khuẩn và kháng nấm của chiết xuất ethanol từ Plumeria rubra.
 Năm 2008, Laila Jarin đã nghiên cứu hoạt động kháng nấm và kháng khuẩn
từ chiết xuất tinh dầu của Plumeria rubra.
Tình hình nghiên cứu về cây Sứ tại Việt Nam đặc biệt là Hoa Sứ vàng hiện còn
chưa có tài liệu và nghiên cứu được công bố rộng rãi.
1.3 Giới thiệu một số nhóm vi sinh vật gây bệnh
1.3.1 Nhóm vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy
1.3.1.1 Nhóm vi khuẩn Escherichia coli
a) Đặc điểm
Escherichia là trực khuẩn Gram âm hình que, kị khí tùy nghi, không sinh bào