i

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LÝ THỊ THANH HÀ

LÝ THỊ THANH HÀ

NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN GEN  GLOBIN VÀ CHẨN ĐOÁN
TRƯỚC SINH BỆNH  THALASSEMIA TẠI BỆNH VIỆN
NHI TRUNG ƯƠNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2018


ii

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

L LÝ THỊ THANH HÀ
THANH HÀ

NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN GEN  GLOBIN VÀ CHẨN ĐOÁN
TRƯỚC SINH BỆNH  THALASSEMIA TẠI BỆNH VIỆN
NHI TRUNG ƯƠNG
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 9 42 01 21

nghiên cứu này!
Bố, mẹ là những người đã mang tôi đến với cuộc sống;chồng và các con của
tôi đã luôn động viên và yêu thương vô bờ bến! Tôi xin được chia sẻ thành quả này
với bố, mẹ và gia đình tôi. Họ là động lực để tôi luôn luôn cố gắng không ngừng.
Hà Nội, ngày 1 tháng 2 năm 2018
Tác giả
Lý Thị Thanh Hà


ii

sLỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các
cộng sự khác.
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được
công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các
đồng tác giả.
Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Hà Nội, ngày 1 tháng 2 năm 2018
Tác giả

Lý T Lý Thị Thanh Hà
hị Thanh Hà


iii

MỤC LỤC


Chẩn đoán trước sinh bệnh  thalassemia ............................................... 23

1.4.1. Dịch nước ối (Amniotic fluid sampling) ............................................. 24
1.4.2. Mẫu gai rau (Chorionic villus sampling - CVS) ........................................... 24
1.4.3. Chẩn đoán tiền phôi (Pre-implantation genetic diagnosis - PGD) ................ 26
1.5.

Tình hình nghiên cứu bệnh  thalassemia tại Việt Nam.......................... 26

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 28
2.1.

Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................................ 28


iv

2.2.

Đối tượng nghiên cứu ................................................................................ 28

2.2.1. Nhóm bệnh nhân bị bệnh  thalassemia thể nặng ............................... 28
2.2.2. Nhóm người mang gen bệnh  thalassemia ....................................... 28
2.2.3. Nhóm làm chẩn đoán trước sinh ......................................................... 29
2.3.

Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân................................................................ 29

2.4.


Đặc điểm của nhóm nghiên cứu ................................................................ 40

3.2.

Kết quả xác định đột biến gen β globin .................................................... 40

3.2.1. Kết quả tách chiết DNA...................................................................... 40
3.2.2. Kết quả xác định đột biến của bệnh nhân mắc  thalassemia thể nặng ......... 48

3.2.3. Kết quả xác định đột biến gen β globin ở người mang gen
bệnh  thalassemia. ............................................................................. 67


v

3.2.4. Kết quả chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia ............................... 81
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ...................................... 88
4.1.

Vai trò của kỹ thuật Multiplex ARMS PCR, giải trình tự gen và
Gap PCR trong chẩn đoán xác định bệnh  thalassemia ........................ 88

4.1.1. Kỹ thuật Multiplex ARMS PCR ......................................................... 88
4.1.2. Kỹ thuật giải trình tự gen Sanger ........................................................ 90
4.1.3. Kỹ thuật Gap PCR .............................................................................. 91
4.2.

Đặc điểm và tỷ lệ các đột biến các đột biến gen  globin trên
nhân  thalassemia tại bệnh viện Nhi Trung ương .................................. 91


Combine-Amplification Refractory Mutation System-PCR,

GAP-PCR

PCR khoảng cách

RT-PCR

Reverse transcrip PCR

MLPA

Multiplex ligation dependent probe amplification

Sequencing

Giải trình tự gen

Multiplex

Phản ứng đa mồi

ASO

Allele specific oligonucleotide dot blot, lai đặc hiệu oligo

RDB

Reserve dot blot, lai ngược



Chuỗi beta

γ

Chuỗi gamma

δ

Chuỗi delta


vii

ε

Chuỗi epsilon

ζ

Chuỗi zeta

(2β2)

Hemoglobin A

(2δ2)

Hemoglobin A2


Người mang gen  kết hợp mang gen HbE

RBC (1012/L)

Red Blood Cells, số lượng hồng cầu

HGB (g/dL)

Khối lượng hemoglobin (g/dL)

HCT (%)

Hematocrit (%)

MCV (fL)

Mean Corpuscular Volume, thể tích trung bình hồng cầu

MCH (pg)

Mean Corpuscular Hemoglobin, số lượng hemoglobin trung
bình hồng cầu (pg)

MCHC (%)

Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration, nồng độ
hemoglobin trung bình hồng cầu (%)

cffDNA



BV Nhi TƯ

Bệnh Viện Nhi Trung Ương

DT-SHPT

Khoa Di truyền - Sinh Học Phân Tử


ix

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Thành phần globin của các Hb bình thường .......................................... 5
Bảng 1.2. Tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh  thalassemia ........................................... 11
Bảng 1.3. Kiểu hình, kiểu gen bệnh  thalassemia .............................................. 16
Bảng 1.4. Các kĩ thuật sinh học phân tử được áp dụng trong phát hiện đột biến
gây bệnh  thalassemia. ...................................................................... 17
Bảng 1.5. Tình hình mang gen bệnh  thalassemia tại Việt Nam......................... 26
Bảng 1.6. Tỉ lệ các loại đột biến  thalassemia ở người Việt Nam....................... 27
Bảng 2.1. Tên và trình tự mồi sử dụng trong quy trình xác định 09 đột biến
trên trên gen β globin .......................................................................... 31
Bảng 2.2. Các bước sàng lọc trên gene β globin .................................................. 34
Bảng 2.3. Bộ mồi sử dụng trong kỹ thuật giải trình tự gen β globin .................... 36
Bảng 3.1. Phân bố đối tượng nghiên cứu theo các nhóm ..................................... 40
Bảng 3.2. Tần số và tỷ lệ các đột biến của gen β globin ở bệnh nhân 
thalassemia .......................................................................................... 41
Bảng 3.3. Tần số và tỷ lệ các đột biến của gen β globin ở bệnh nhân 
thalassemia theo vị trí đột biến ............................................................ 42
Bảng 3. 4. Kiểu gen và kiểu hình của 214 bệnh nhân  thalassemia ..................... 43

Hình 1.2.

Sơ đồ cơ chế bệnh sinh trong Thalassemia ........................................... 8

Hình 1.3.

Cấu trúc và quá trình tổng hợp chuỗi β globin .................................... 13

Hình 1.4.

Nguyên lý kĩ thuật ARMS-PCR ......................................................... 18

Hình 1.5.

Thủ thuật chọc ối trong chẩn đoán trước sinh. .................................... 24

Hình 1.6.

Thủ thuật lấy bệnh phẩm trong chẩn đoán trước sinh ......................... 25

Hình 2.1.

Quy trình xác định đột biến gen  globin ........................................... 32

Hình 2.2.

Sơ đồ mồi quy trình xác định đột biến gen β globin ........................... 37

Hình 2.3.


có đột biến IVS2-654 (C-T) ............................................................... 49

Hình 3.7.

Kết quả ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT140713 phát hiện
kiểu gen IVS2-654(C-T) .................................................................... 50

Hình 3.8.

Kết quả giải trình tự gen của bệnh nhân mã số WBbT140713
với đột biến dị hợp tử IVS1-1 (G-T) (A) và IVS2-654 (C-T) (B)........ 51

Hình 3.9.

Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT130504
có đột biến -28(A-G) .......................................................................... 51


xii

Hình 3.10. Kết quả ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT130504 phát hiện
kiểu gen -28(A-G) .............................................................................. 52
Hình 3.11. Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT130504
có đột biến CD71/72(+A) ................................................................... 53
Hình 3.12. Kết quả ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT130504 phát hiện
kiểu gen CD71/72(+A)....................................................................... 54
Hình 3.13. Kết quả giải trình tự gen của bệnh nhân mã số WBbT130504 với
đột biến dị hợp tử CD71/72 (+A) ....................................................... 55
Hình 3.14. Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT101215
có đột biến -28(A-G) .......................................................................... 55