TÓM TẮT NỘI DUNG
Vi khuẩn lactic có ý nghĩa rất quan trọng trong đời sống. Chúng sinh ra
nhiều chất kháng khuẩn để kháng các vi sinh v ật gây b ệnh. Do đó, vi ệc tìm ra
những chất kháng khuẩn sinh ra từ vi khuẩn lactic nhằm b ổ sung cho nh ững
nghiên cứu về chất kháng khuẩn và ứng dụng chất kháng khuẩn vào trong cu ộc
sống cũng như ứng dụng trong Dược học. Với đề tài “ Khảo sát khả năng ức chế
Escherichia coli và Salmonella của vi khuẩn acid lactic phân lập t ừ các s ản
phẩm sữa có trên thị trường” sử dụng môi trường MRS để phân lập và tuyển
chọn vi khuẩn lactic, sử dụng phương pháp nhuộm Gram, Catalase, Oxydase, kh ả
năng sinh hơi để định danh sơ bộ, sử dụng phương pháp khuếch tán gi ếng th ạch
và phương pháp nhỏ giọt để kiểm tra sự kháng lại vi khuẩn E.coli và Salmonella .
Kết quả cho thấy có tổng số 6 dòng vi khuẩn lactic được phân lập từ 16 mẫu s ữa
chua (được mua tại các siêu thị, tiệm tạp hóa, các cửa hàng bách hóa tại thành
phố Cần Thơ) cho vòng kháng khuẩn đối với dòng chỉ th ị. Đường kính vòng
kháng khuẩn từ 4,6 – 10,3mm. Như vậy, có thể sử dụng vi khuẩn lactic từ các sản
phẩm sữa chua trên thị trường để kháng lại vi khuẩn E.coli và Salmonella.

1


MỤC LỤC

2


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
E.Coli Escherichia coli
LAB Lactic acid bacteria
MRS Lactobacillus MRS Broth
TSA Lactobacillus MRS Broth
TSB Tryptic Soyabean Broth

phẩm nên kéo dài thời gian bảo quản và làm cho s ản phẩm an toàn đ ối v ới con
người .(Lê Văn Nhương và csv., 2009)
Ứng dụng về việc acid lactic làm cho thức ăn có vị chua d ễ ch ịu cũng nh ư gây ức
chế các dòng vi khuẩn có hại cho đường ruột mà người ta đã dùng nó đ ể ch ế
biến thực phẩm, như là một chất gia vị đối với các đồ uống nh ẹ nh ư : Sữa chua,
siro, dịch quả…(Lê Văn Nhương và csv., 2009). Trong đó, sữa chua hay còn g ọi là
yaourt là một sản phẩm rất nổi tiếng thế giới từ rất lâu và được tiêu thụ ph ổ
biến cho đến nay với nhiều loại sữa chua khác nhau trên th ị tr ường th ế gi ới nói
chung cũng như thị trường Việt nam nói riêng.
Ngày nay,với sự tiến bộ nhanh chóng của công nghệ sản xuất mà các công
ty trong và ngoài nước đã nghiên cứu và sản xuất nhi ều sản ph ẩm s ữa chứa l ợi
khuẩn với nhiều dạng bào chế khác nhau và được gọi chung là nh ững ch ế ph ẩm
probiotic

. Có nhiều chủng lợi khuẩn đường ruột được bi ết đến nh ư:

Lactobacillus, Bacillus, Bifidobacterium,… trong đó các vi khuẩn thuộc chi
Lactobacillus được ưa chuộng làm probiotic để nhằm gây ức chế và kháng lại các
vi khuẩn gây hại cho đường ruột trong đó có Escherichiacoli và Salmonella.
Ở Việt Nam tỉ lệ người mắc bệnh đường ruột khá cao đặc bi ệt là tr ẻ em,
do môi trường sống cũng như ăn uống không hợp vệ sinh, nên số lượng nhi ểm
khuẩn đường ruột xảy ra khá nhiều, việc dùng kháng sinh trong quá trình tr ị
liệu những khi nhiễm khuẩn là không thể tránh khỏi. Nhưng s ử d ụng dài lâu sẽ
gây hại đến sức khỏe người lớn lẫn trẻ em mà đó là những tác hại bên trong mà
chúng ta không hề hay biết được .Một trong những mặt trái của việc l ạm dụng
thuốc kháng sinh dài lâu là gây hại cho khuẩn có l ợi. Th ực t ế, kháng sinh có ph ổ
rộng tiêu diệt cả vi khuẩn xấu và tốt. Vì vậy nếu dùng không đúng h ướng d ẫn,
lạm dụng sẽ tiêu diệt cả khuẩn có lợi có trong đường ruột, làm mất cân b ằng
mang tính tự nhiên của cơ thể. Một khi bị mất cân bằng, khu ẩn xấu hoành hành,
dễ phát sinh nhiều bệnh như rối loạn dạ dày, làm cho các chứng bệnh nghiêm

Vi khuẩn axit lactic (LAB) là các vi sinh vật phổ bi ến r ộng rãi, có th ể tìm
thấy trong bất kỳ môi trường giàu carbohydrate, như thực vật, thực phẩm lên
men và niêm mạc bề mặt của con người, động vật trên cạn và biển. Trong cơ thể
người và động vật, LAB là một phần của vi sinh vật bình thường hoặc vi sinh v ật
hệ sinh thái tự nhiên sống trong đường tiêu hóa .(Florou-Paneri et al., 2013)
Vi khuẩn acid lactic được xếp chung vào họ Lactobacteriaceae. Các sản
phẩm lên men axit lactic truyền thống đã được sử dụng lâu đời như lên men rau
hoa quả, lên men thịt, lên men cá. Nhưng mãi đến năm 1878, Lister m ới phân l ập
được LAB , ông gọi vi khuẩn này là Bacterium lactic (hiện nay gọi là Trestococcus
lactic). Từ đó đến nay, nhiều loại LAB được phát hiện và ứng dụng có ích c ủa
chúng ngày càng đựợc mở rộng ra nhiều lĩnh vực, đặc biệt là th ực ph ẩm và th ực
phẩm chức năng. Công nghiệp lên men để sản xuất axit lactic có th ể nói đ ược
hình thành từ năm 1881 (Nguyễn Lân Dũng và csv, 1997).Vi khuẩn lactic tuy có
hình dạng khác nhau nhưng chúng điều có một đặc đi ểm chung sau: chúng là
những vi khuẩn Gram dương, không có khả năng sinh bào tử, catalase âm tính,
oxydase âm tính, khử nitrat âm tính và hâu hết không chuy ển đ ộng. (Lê Văn
Nhương và csv, 2009)
1.2 Phân loại
Orla Jensen mô tả bảy chi trong năm 1919, nhưng chỉ có tên c ủa m ột
trong số chủng, Streptococcus , vẫn còn hiệu lực ngày nay. Nhóm LAB hiện nay
bao gồm 16 chi (J.A. Narvhus, et al.,2003).Các vi khuẩn lên men acid lactic rất đa
dạng bao gồm nhiều giống khác nhau. Theo nghiêng cứu, vi khuẩn lactic được
xác định là một số loài (species) thuộc các gi ống (genus) sau : Aerococus,
Alloiococcus,
Lactobacillus,

Atopobium,
Lactococcus,

Bifidobacterium,

axit amin . Lactobacillus plantarum được tìm thấy trong nhiều môi trường sống
giàu dinh dưỡng, chẳng hạn như các sản phẩm từ sữa, thịt, rau và th ực v ật ( Cai
Y et al.,1999 )
Streptococcus: là loại có hình dạng của tế bào hình tròn hoặc hình ovan,
đường kính 0,5 - 1µm. Tế bào thường tạo chuỗi dài hoặc xếp đôi, ít khi đứng đơn
lẻ, có khả năng lên men các loại đường như glucose, fructose, galatose, lactose…
Chúng thường có nhiều trong sữa và sữa chua. Chúng có khả năng tích tụ 0,8 –
1% acid lactic.(Lê Văn Nhương và csv, 2009).
Leuconostoc : lại có hình hơi dài hoặc hình ovan, đường kính khoảng (0,5 –
0,8)µm và chiều dài khoảng 1,6µm. Nhưng đôi khi chúng lại có dạng h ơi tròn,
sắp xếp thành chuỗi và không tạo thành một đám.
Pediococcus có dạng hình cầu, có thể đứng riêng lẻ, kết đôi hay k ết chu ỗi
hoặc tạo đám tỷ cầu hay bát cầu khuẩn.(Lê Văn Nhương và csv, 2009)
1.3 Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lên men axit lactic có hai dạng hình chính là hình cầu và hình que.
Tuy nhiên, khi nuôi cấy trong điều kiện môi trường hay các điều kiện ngoại cảnh
khác nhau thì có hình dạng khác nhau nhưng chúng đều có m ột s ố đ ặc đi ểm sau:
chúng là những vi khuẩn Gram dương, không có khả năng sinh bào tử, catalase
âm tính, oxydase âm tính, khử natri âm tính và hầu hết đều không chuy ển đ ộng,
chúng không có khả năng tổng hợp nhân hem của các polyphyrine, chúng không
có chứa xitocrom. Chúng có thể sinh trưởng được khi 17 có mặt oxy, là lo ại c ơ
thể duy nhất có khả năng lên men hiếu khí cũng như yếm khí (Lê Văn Nhương và
csv , 2009).
1.4 Cơ chế của quá trình lên men lactic
Trong quá trình lên men axit lactic, cơ chất đầu tiên tham gia vào quá trình
lên men là đường glucose hoặc fructose. Khi sử dụng ngu ồn nguyên li ệu là các
đường đôi hay các chất chứa gốc đường thì trước khi tham gia vào quá trình lên
men chúng phải được thủy phân thành glucose hay fructose nh ờ các enzyme
tương ứng. Lên men axit lactic là quá trình chuy ển hoá y ếm khí đường thành axit
9

bật

cho

các

vi

khuẩn

axit

lactic

khác

thu ộc

chi Lactobacillus và Pediococcus ở giai đoạn sau.
2. SỰ ỨC CHẾ VI KHUẨN BỆNH CỦA ACID LACTIC
2.1 Tạo ra các sản phẩm acid hữu cơ trong quá trình lên men
Trong quá trình lên men vi khuẩn lactic sinh ra các acid h ữu c ơ. Các acid
này là chất kháng khuẩn trực tiếp của vi khuẩn lactic. Chúng bao gồm acid lactic,
acid acetic, acid probionic, acid butyric, trong đó acid lactic và acid acetic là s ản
phẩm chính. Chúng tạo ra môi trường không thích hợp cho sự phát tri ển các vi
sinh vật gây bệnh, gây hỏng. Theo Mariae và Thomas, một số vi sinh vật gây bệnh
(Samonella, Listeria sp.) và một số vi sinh vật sinh độc tố ( Staphylococcus aureus,
Bacillus cereus, Clostridium hotulinum) bị ức chế thậm chí bị tiêu diệt khi pH môi
trường


Người ta đã chứng minh chắc chắn rằng nhiều loại vi khuẩn lactic s ản sinh ra
bacteriocin. (Lê Văn Nhương và csv, 2009)
Bacteriocin bao gồm một lượng lớn các peptide tổng h ợp ribosomally có
hoạt tính kháng khuẩn đối với các chủng liên quan chặt chẽ, m ặc dù có m ột s ố
lượng lớn các vi khuẩn được báo cáo có hoạt tính kháng khuẩn r ộng. Trong thập
kỷ qua, sự quan tâm đến nghiên cứu bacteriocin, đặc bi ệt là từ vi khu ẩn axit
lactic, đã đạt được động lượng lớn nhờ khả năng bảo quản thực ph ẩm tự nhiên
và kháng sinh trị liệu.Vi khuẩn có một số thu ộc tính tích cực đã khi ến chúng đ ặc
biệt hấp dẫn đối với các ứng dụng khác nhau. LAB bacteriocins vốn đã được biết
đến với hoạt động của chúng trên một phạm vi pH r ộng. Các peptide kháng
khuẩn này cũng không màu, không mùi và không vị, giúp tăng cường tính hữu
dụng tiềm năng của chúng. Mặc dù lịch sử lâu dài của việc sử dụng bacteriocin,
không có báo cáo về sự phát triển của vi khuẩn kháng thu ốc. Một lý do có thể là
do bacteriocin có cơ chế tác động nhanh, tạo thành l ỗ chân lông trong màng c ủa
vi khuẩn, ngay cả ở nồng độ cực thấp. Chúng cũng dễ bị phân hủy bởi các
enzyme phân giải protein do tính chất protein của chúng. Do đó, các mảnh vi
11


khuẩn không sống lâu trong cơ thể con người hoặc trong môi tr ường, giúp giảm
thiểu cơ hội của các chủng để tương tác với các kháng sinh bị suy thoái. Đây là
điểm khởi đầu phổ biến trong sự phát triển kháng kháng sinh. Có lẽ, lợi thế đáng
kể nhất của bacteriocin trên kháng sinh thông thường là ch ất chuy ển hóa chính
của chúng vì chúng có cơ chế sinh tổng hợp tương đối đơn gi ản so v ới các kháng
sinh thông thường, là các chất chuyển hóa thứ cấp. Sự khác biệt chính giữa
bacteriocin và kháng sinh thông thường được tóm tắt trong bảng lợi thế đáng kể
nhất của bacteriocin trên kháng sinh thông thường là chất chuy ển hóa chính c ủa
chúng vì chúng có cơ chế sinh tổng hợp tương đối đơn giản so v ới các kháng sinh
thông thường. Thực tế này làm cho chúng dễ dàng tuân theo thông qua công
nghệ sinh học để tăng hoạt động hoặc tính đặc hiệu của chúng đ ối v ới các vi


Hầu như hẹp

Chất chuyển hóa thứ
cấp
Chủ yếu là rộng

Cường độ hoạt tính
sinh học

Hoạt động ở phạm vi
mol-to-micro

Khả năng phân hủy
enzyme phân giải
protein
Ổn định nhiệt

Cao
Cao

Thấp

Phạm vi PH hoạt động

Rộng

Hẹp
12


chế sinh tổng hợp vách tế các mục tiêu tế bào
bào
Tương đối không
Có

Về mặt hóa học bacteriocin được xếp vào nhóm các chất dị gen nhưng
trong phân tử luôn có thành phần protein hoạt tính. M ột s ố bacteriocin là phân
tử protein hoạt tính. Một số bacteriocin là phân tử protein thuần khi ết, trong khi
một số khác lại có phân tử cấu tạo phức hợp gồm nhi ều thành ph ần: lipid,
carbonhydrat và protein. Người ta đã phát hiện được m ột s ố gen mã hóa sinh
tổng hợp Bacteriocin tồn tại độc lập trong tế bào vi khu ẩn, chúng n ằm trên các
plasmid. Hiện nay, bacteriocin của vi khuẩn lactic được chia thành 4 nhóm sau:
Nhóm I: là nhóm lantibiotic, là loại polypeptit có kh ối l ượng phân tử nh ỏ
(< 5KDa) , chứa amino acid lanthionine, β-methyllanthionine. Ví dụ: nisin, lacticin
481, carnocin U149, lactocin S.(Lê Văn Nhương và csv, 2009)
Nhóm II: Gồm các bacteriocin không phải là lantibiotic, kh ối l ượng phân
tử nhỏ (< 10KDa). Cấu trúc gấp nếp β, bền nhiệt, có thể chịu được nhiệt độ
trong khoảng 100-121℃. Các bacteriocin trong nhóm này lại được chia thành 3
nhóm nhỏ sau:
 Bacteriocin có chứa N-terminal là –Tyr-Gly-Ans-Val-Xaa-Cys-. Các

bacteriocin tiêu biểu nhóm này là: sakacin A, sakacin P, leucocin A,
curvacin A.
 Bacteriocin có chứa nhóm Thiol
Nhóm III: Các bacteriocin có khối lượng phân tử lớn (> 30KDa), khả năng
bền nhiệt cao .
Nhóm IV: Đây là bacteriocin phức tạp.

13


3.2 Ứng dụng lactic trong sản xuất sữa chua
Lên men acid lactic được ứng dụng nhiều trong ngành sữa đ ể tạo ra các
sản phẩm như: sữa chua, phomat và các loại sữa lên men lactic .
Sản xuất sữa chua quá trình lên men lactic là do vi khu ẩn lactic phát tri ển
và tích tụ một lượng acid lactic gây đông tụ casein của sữa và tạo hương v ị đ ặc
trưng cho sản phẩm. Nguyên liệu dùng để sản xuất sữa chua là s ữa t ươi, s ữa
bột hay sữa đặc. Sữa sau thanh trùng sơ bộ, được cấy b ổ sung vi khu ẩn lên men
lactic điển hình ( Phối hợp nhiều loài để làm tăng giá trị cho s ản ph ẩm ), th ường
sử dụng các loài : Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus. Tiến hành
lên men ở nhiệt độ duy trì 40 - 50℃. Vi khuẩn lên men tích tụ acid lactic, làm
giảm pH, kết quả gây đông tụ casein. Để đảm bảo khẩu vị cho sữa chua , th ường
chỉ để quá trình lên men đến độ nhất định rồi phân phối vào các bao bì phù
hợp và đưa đi bảo quản lạnh. Sản phẩm có màu trắng ngà , h ơi chua, ng ọt nh ẹ,
có mùi thơm đặc trưng, sữa đông kết và đồng nhất.(Lê Văn Nhương và csv, 2009)
Ho ạ t tính sinh h ọc c ủa vi khu ẩn (LAB) đ ượ c s ử d ụng trong s ản xu ất
s ản phẩ m , cho đ ến nay, nhi ều nghiên c ứu t ập trung vào vai trò c ủa
probiotic bao g ồm (LAB) vi khu ẩn trong s ữa chua đ ể tăng c ường ch ức năng
tiêu hóa thông qua tăng h ấp thu khoáng ch ất, gi ảm không dung n ạp lactose
(thi ếu lactase) và thông qua vi ệc tiêu th ụ s ữa chua nuôi c ấy Lactobaccilus
acidophilus. Vi khuẩn LAB cho phép ức ch ế s ự lây nhi ễm m ầm b ệnh thông
14


qua s ản xu ất axit axetic, axit lactic và bacteriocin cũng nh ư ổn đ ịnh h ệ vi
sinh đườ ng ru ột , Ứ c ch ế các ch ất gây ung th ư có h ại liên quan đ ến ung th ư
đại tràng và tăng mi ễn d ịch b ằng cách s ản xu ất globulin mi ễn d ịch. Đi ều tr ị
táo bón, gi ảm cholesterol huy ết thanh và ki ểm soát tiêu ch ảy thông qua
vi ệc tiêu th ụ s ữa chua. (Ayman Suliman Mazahreh, Omer Turki Mamdo
Ershidat, 2009).
4 VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI VÀ SALMONELLA

nhóm gây bệnh ngoài đường ruột (ExPEC- extraintestinal pathogenic E. Coli ) ( Lê
Văn Phủng và csv, 2009)
15


Các loại E.Coli gây bệnh đường ruột ( IPEC ) đã được biết đến gồm:
•
•
•
•
•
•

EPEC (Enteropathogenic E.Coli ): E.Coli gây bệnh đường ruột
ETEC (Enterotoxigenic E.Coli ): E.Coli sinh độc tố ruột
EIEC (Enteroinvasive E.Coli ): E.Coli xâm nhập ruột
EAEC (Enteroaggregative E.Coli ): E.Coli ngưng tập ruột
DAEC (Diffusely adherent E.Coli ) : E.Coli bám dính phân tán
EHEC (Enterohaemorrhagic E.Coli ): E.Coli gây xuất huyết ruột

Hai loại E.Coli gây bệnh ngoài đường ruột quan trọng nhất là:
•
•

MAEC (Meningitidis-associated E.Coli ): E.Coli gây viêm màng não
UPEC ( Uropathogenic E.Coli ): E.Coli gây nhiễm khuẩn đường tiết
niệu.

4.1.3 Khả năng gây bệnh
E.Coli là thành viên thuộc vi hệ bình thường của đường tiêu hóa, chi ếm tỷ

16

paratyphi A, B, C


( typhphoid = bệnh thương hàn, para = “ phó”), hoặc theo vật chủ nh ư S.
typhimurium gây bệnh ở chuột (murine = chuột ). Về sau, người ta th ấy r ằng,
một loài Salmolella có thể gây ra một số hội chứng và có thể phân lập được ở
nhiều loài động vật khác nhau.
Salmolella đã từng được chia thành các chi phụ ( subgenus) và nhi ều loài
(species). Mỗi loài lại có thể được chia thành các loài ph ụ ( subspecies). M ỗi loài
lại có thể được chia thành các loài phụ ( subspecies). Ví d ụ loài Samonella
enterica được chia thành sáu loài phụ gồm Salmonella enterica, Salmonella
salamae, Salmonella arizonae, Salmonella diarizonae, Salmonella houtenae và
Salmonella indica. Với cách phân loại này, S. enteritidis ( tên v ẫn được gọi t ắt) có
tên đầy đủ là Salmolella enterica loài phụ enterica type huyết thanh enteritidis
PT4 (phage type). Để giảm bớt sự phức tạp , trong các phần còn lại của mục
Salmolella chúng tôi gọi một vi khuẩn được viết bằng hai chữ bắt đ ầu b ằng ch ữ
Salmonella là một loại Salmolella – nó có thể là loài, loài phụ hay m ột type huy ết
thanh. (Lê Văn Phủng và csv, 2009)
4.2.3 Khả năng gây bệnh
Tùy theo từng loại, Salmonella có thể chỉ gây bệnh cho người ( như
Salmonella typhi, Salmonella paratyphi A, Salmonella sendai…), chỉ gây bệnh cho
động vật (như Salmonella abortusovis, Salmonella typhisuis, Salmonella
gallinarum…), nhưng cũng có thể vừa gây bệnh cho người vừa gây bệnh cho
động vật (như Salmonella

enteritidis, Salmonella

typhimurium, Salmonella

hợp nên đang là một hướng nghiên cứu được nhiều nhà khoa học quan tâm.
Cũng đã có những công trình nghiên cứu và ứng dụng thành công, góp ph ần vào
việc nâng cao chất lượng cuộc sống của nhân loại. Chất kháng khu ẩn là m ột
chất có khả năng ức chế một số vi khuẩn gây bệnh, nhờ khả năng này mà vi ệc
ứng dụng của LAB được đa dạng và phong phú hơn. Chất kháng khu ẩn đã đ ược
các nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu từ rất lâu và đạt nhiều thành tựu.
• Theo Kekessy et al., (1970) đã nghiên cứu m ột ph ương pháp m ới trong

việc phát hiện chất kháng khuẩn. Chủng vi sinh vật đối kháng được
nuôi ủ trên đĩa môi trường thạch dinh dưỡng, sau đó tạo gi ếng có
đường kính 0.5 mm bằng cách đục bỏ agar trên đĩa. Cho một l ượng vi
khuẩn có khả năng sinh tổng hợp chất kháng khuẩn vào gi ếng, sau
thời gian nuôi ủ vòng kháng khuẩn sẽ xuất hiện, thể hiển bởi một
vòng sáng rõ quanh giếng.
• Năm 1976 tại Minnesota, Tagg et al., đã nghiên cứu v ề nh ững lo ại ch ất
kháng khuẩn của vi khuẩn gram dương và cho ra nhiều kết qu ả có giá
trị. Nghiên cứu đã cho biết được tính đối kháng của chất kháng khuẩn,
cách đặt tên và phân loại chất kháng khuẩn, chiết tách và tinh s ạch
chất kháng khuẩn, phân tích hoạt tính chất kháng khuẩn, các loại hoạt
động của chất kháng khuẩn và ứng dụng của chất kháng khuẩn.
• Năm 1992 tại Laramie, Yang et al., đã nghiên cứu m ột ph ương pháp
mới để chiết tách một lượng lớn chất kháng khuẩn từ LAB. Phương
pháp này dùng môi trường pediocin AcH, nisin, sakacin A, leuconocin
Lcm1 làm tăng hiệu quả chiết tách và thu được một lượng ch ất kháng
•

khuẩn nhiều hơn quá trình phân lập.
Năm 1999 tại Bỉ, Raf Callewaert và Luc De Vuyst đã nghiên c ứu vi ệc
sinh tổng hợp chất kháng khuẩn của Lactobacillus amylovorus DCE
471 và có ứng dụng cải tiến và làm ổn định các sản phẩm lên men.

• Năm 2006, Stefan Marcinowski cho biết kẹo cao su có ch ứa các ch ủng
vi khuẩn có lợi lactobacillus do công ty hoá chất BASF của Đức phát
triển. Đây là sản phẩm giúp người dùng loại trừ các bệnh về răng
miệng.
• Tháng 3/2007, Todorov, S.D. và Leon M.T. Dicks K.M. (Nam Phi) đã
nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp chất kháng khuẩn của chủng
Lactobacillus pentosus ST712BZ được phân lập từ boza.

19


CHƯƠNG 3 : PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. THỜI GIAN ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
1.1. Địa điểm
Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thực hành Vi Sinh của Khoa dược Điều dưỡng, trường đại học Tây Đô.
Địa chỉ: Số 68, Trần Chiên, phường Lê Bình, quận Cái Răng, TP Cần Thơ.
1.2. Thời gian thực hiện
Từ 26/2 năm 2018 đến 4/6 năm 2018
2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu
Sữa Chua mua ở các siêu thị, cửa hàng bách hóa, tiệm tạp hóa ở Cần Th ơ.
2.2. Dụng cụ thiết bị
Dụng cụ:
- Đĩa Petri

- Giấy cân

- Que cấy

- Đầu co


- Tủ ấm.

•

- Nồi hấp tiệt trùng

•

- Bếp điện

•

- Lò vi sóng

2.3. Hóa chất và môi trường
•

Hóa chất:
• Nước Cất
20


• CaCO3
• MRS (MRS broth Lactobacillus broth acc. To DEMAN. ROGOSA and

SHARPE for microbiolody) Peptone from casein 10.0, Meat extract 8.0,…
• TSA (Tryptone 15g; Soya peptone 5g; Sodium chloride 5g; Agar 15g)
• TSB (Tryptone 17g; Papaic digest soybean meal 3.0g; Glucose 2.5g;



3.1 Phương pháp thu và bảo quản mẫu
•

Mẫu sữa chua được mua tại các siêu thị, tiệm tạp hóa, cửa hàng

bách hóa tại Tp. Cần Thơ. Mẫu được giữ riêng bi ệt từng lo ại trong h ộp nh ựa
nhỏ đặt tại phòng thí nghiệm với nhiệt độ phòng
3.2. Phân lập vi khuẩn lactic và thử nghiệm CaCO3

•

Phân lập vi khuẩn là quá trình tách riêng vi khu ẩn từ quần th ể ban

•

đầu để nhận được những giống thuần khiết.
•

Các mẫu sữa chua , lấy mỗi mẫu một ít đem hòa tan vào môi tr ường MRS

lỏng. Sau đó đem vào tủ ủ với nhiệt độ 37 ℃ trong 24 giờ. Sau khi ủ dung dịch có
màu đục, lắc đều lên đem cấy vào môi trường MRS đặc (ch ứa agar). Quá trình
cấy này được diễn ra đến khi đạt được độ thuần.
21


•

Quy trình phân lập


•

Lấy• khuẩn lạc thuần đem tăng sinh trong môi trường MRS lỏng
•

Ủ ở nhiệt độ 37℃, trong 24 giờ
•
•
•

Trữ ở tủ đông -40℃
Hình 3. 1 Quy trình phân lập LAB

•
•
•
•
•
•

23


•
•
•
•

Kiểm tra hình thái khuẩn lạc đặc trưng và được chấp nhận khi:


Nhuộm Gram
•

Là phương pháp phân chia vi khuẩn thành từng nhóm Gram dương

và Gram âm dựa vào đặc tính vật lý và hóa học của vách tế bào.
•

Bước làm:

•

Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng l ấy một ít vi khu ẩn từ môi

trường đặc sau khi cấy 24 giờ, hòa vào 1 giọt nước cất ở giữa lam để khô tự
nhiên trong không khí, hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần.
•

Nhuộm:
• Nhỏ dung dịch Crystal violet để yên trong 1 phút, rửa nước.
• Nhỏ dung dịch Lugol để yên trong 1 phút, rửa nước.
• Nhỏ cồn 95º giữ khoảng 30 giây hoặc cho c ồn chảy qua vết bôi vi

khuẩn liên tục đến khi xuất hiện giọt đầu tiên không còn màu, ngừng
lại và rửa nước.
• Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin đ ể yên trong 1 phút, r ửa
nước, để khô trong không khí.
• Soi kính: dùng vật dầu 100X để quan sát
•

• Không chuyển màu hoặc sau 60 giây chuy ển sang màu âm tính (Âm

tính nếu là vi khuẩn lactic)
•

Xét nghiệm Catalase
•

Enzim catalase có tác dụng xúc tác phản ứng hydrgen peroxide

(H2O2) thành nước và khí oxygen.
•

Dụng cụ và hóa chất :
• Que cấy, lam kính
• Hóa chất: dung dịch H2O2 3-10%
• Vật liệu: Vi khuẩn đã phân lập riêng lẽ
•

Bước làm:
• Lấy dung dịch H2O2 nồng độ 3-10% nhỏ một giọt lên lam kính hoặc

nhỏ trực tiếp lên khuẩn lạc trên đĩa thạch.
• Dùng đầu que cấy lấy một ít vi khuẩn được nuôi trong 24 gi ờ tr ộn vào
giọt H2O2 trên phiến kính.
•

Đọc kết quả:
• Dương tính: sủi bọt
• Âm tính : không sủi bọt (Âm tính nếu là vi khuẩn lactic)