TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

======

HOÀNG THỊ QUỲNH

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ
THUỐC NEOMYCIN SULFATE CỦA
VẬT LIỆU CELLULOSE TẠO RA TỪ
GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY
TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC DỪA GIÀ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

HÀ NỘI - 2019


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

======

HOÀNG THỊ QUỲNH

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ
THUỐC NEOMYCIN SULFATE CỦA
VẬT LIỆU CELLULOSE TẠO RA TỪ
GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY
TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC DỪA GIÀ

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là đề tài do chính tôi thực hiện dưới sự hướng
dẫn của TS. Cao Bá Cường. Tất cả các số liệu đều được thu thập từ thực
nghiệm, qua xử lý thống kê, không có số liệu sao chép hay bịa đặt, không
trùng với kết quả đã công bố. Những trích dẫn trong khóa luận lấy từ các công
bố chính thức và có ghi chú rõ ràng.
Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.
Hà Nội, tháng 5 năm 2019
Sinh viên

Hoàng Thị Quỳnh


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU........................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài........................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu..................................................................................... 2
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu................................................................. 2
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn....................................................................... 2
NỘI DUNG ....................................................................................................... 3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3
1.1. Tổng quan về vật liệu cellulose (VLC)...................................................... 3
1.1.1. Vi khuẩn tổng hợp lên VLC.................................................................... 3
1.1.2. Môi trường nuôi cấy G. Xylinus.............................................................. 3
1.1.3. Cấu trúc của VLC.................................................................................... 4
1.1.4. Tính chất của VLC .................................................................................. 6
1.1.5. Ứng dụng của VLC ................................................................................. 6
1.2. Tình hình nghiên cứu VLC ........................................................................ 7
1.2.1. Trên thế giới ............................................................................................ 7
1.2.2. Tại Việt Nam........................................................................................... 7

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

1

VLC

Vật liệu cellulose

2

G.xylinus

Gluconacetobacter xylinus

3

NS

Neomycin sulfate

4

OD

5

PBS

Mật độ quang phổ
Phosphate buffered saline

trong 1 giờ, 1,5 giờ, 2 giờ ............................................................... 21
Hình 3.8. Hiệu suất hấp thụ thuốc NS của VLC(0,3cm) và VLC(0,5cm)
trong 1 giờ, 1,5 giờ, 2 giờ ............................................................... 21


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài

1


Ngày nay việc sử dụng các vật liệu sinh học để ứng dụng trong các lĩnh
vực như: y học, mỹ phẩm, thực phẩm,…đang được các nhà nghiên cứu khoa
học trong nước và trên thế giới đặc biệt quan tâm. Một trong những vật liệu
sinh học được các nhà khoa học đặc biệt chú ý đến đó là vật liệu cellulose
(VLC).
VLC được tổng hợp bởi rất nhiều vi khuẩn, trong đó phải kể đến đó là
vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus ( G.xylinus) – loại vi khuẩn có khả năng
tạo ra VLC tốt nhất.
VLC là hợp chất tương hợp sinh học, không độc hại, với cấu trúc siêu
mịn, đặc tính cơ học bền, dai, khả năng giữ ẩm cao nên có rất nhiều ứng dụng
trong nhiều lĩnh vực như: công nghệ giấy, thực phẩm, y học, …[4].
Trong y học, VLC đã được ứng dụng làm màng trị bỏng, mặt nạ dưỡng
da, mạch máu nhân tạo... [4]. Không chỉ vậy, VLC còn có khả năng hấp thu
thuốc, tăng tác dụng của thuốc, hạn chế được tác dụng phụ của thuốc.
Để tạo ra VLC, G.xylinus có thể nuôi cấy trong các môi trường như:
nước dừa già, rỉ đường, dịch ép hoa quả, …Trong đề tài này tôi chọn nước
dừa già là môi trường nuôi cấy G.xylinus vì nước dừa già chứa nhiều chất
dinh dưỡng cần thiết để nuôi cấy vi khuẩn G.xylinus.
Neomycin sunfate (NS) là loại thuốc kháng sinh nhóm aminoglycoside.

Ý nghĩa khoa học:
Nghiên cứu tiềm năng của VLC trong việc hấp thu thuốc định hướng sử
dụng trên da.
Nghiên cứu khả năng hấp thụ các thuốc khác nhau của VLC nhằm tăng
hiệu quả điều trị của các loại thuốc đó.
Ý nghĩa thực tiễn:
Sử dụng VLC làm vật liệu để hấp thụ thuốc NS có thể làm tăng hiệu
quả của thuốc, khắc phục được tác dụng phụ không mong muốn trong việc
điều trị các bệnh viêm da bằng thuốc NS.

3


NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về vật liệu cellulose (VLC)
Cellulose là một hợp chất hóa học, là thành phần chính của sinh khối
thực vật. Cellulose ngoài được tổng hợp từ thực vật nó còn được tổng hợp từ
vi khuẩn gọi là VLC.
1.1.1. Vi khuẩn tổng hợp lên VLC
VLC được tổng hợp bởi các loài khác nhau của vi khuẩn, chẳng hạn
như Acetobacter, Achromobacter, Agrobacterium, Pseudomonas, Rhizobium
và Sarcina [31]. Đặc biệt phải kể đến đó là vi khuẩn G. Xylinus – có khả năng
tổng hợp VLC tốt nhất.
Theo hệ thống phân loại của nhà khoa học Bergey (2005) Acetobacter
xylinum được đổi tên thành G. Xylinus và xếp vào chi Gluconacetobacter
thuộc họ vi khuẩn Acetobacteraceae.
G. Xylinus là vi khuẩn gram âm, thuộc loại vi khuẩn hiếu khí bắt buộc
có khả năng tổng hợp sinh màng cellulose trong môi trường nuôi cấy tĩnh.
Chúng có dạng trực khuẩn, hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước khoảng

94,99% Zn

0,1 mg

Protein

0,72% Cu

0,04 mg

Chất béo toàn phần
Carbonhydrat

0,2% Mangan
3,17% Selenium

Đường

2.16% Vitamin C

2,4 mg

Ca

24 mg Vitamin B1

0,03 mg

Fe



1.1.3. Cấu trúc của VLC
VLC là một chuỗi polymer do các glucopyranose nối với nhau bằng
liên kết β-1,4-glucan

5


Hình 1.1. Cấu trúc hóa học cơ bản của VLC
VLC có cấu trúc hóa học cơ bản giống cellulose của thực vật, nhưng lại khác
nhau về cấu trúc đại thể [14],[16].
Theo AJ. Brown (1886) [18], VLC gồm nhiều sợi thứ cấp có bản chất là
hemicellulose, bề rộng 1,5 nm. Các sợi thứ cấp này kết hợp với nhau tạo
thành vi sợi có kích thước lớn hơn. Các vi sợi này lại kết hợp với nhau thành
bó. Nhiều bó hợp thành dải, mỗi dải có chiều dày 3-4nm, chiều dài khoảng
130- 177nm.

Hình 1.2. Cấu trúc của VLC (Yamanaka et al, 2000)

Đặc tính cấu trúc của VLC phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy:
Khi nuôi cấy theo phương pháp tĩnh (S - BC: Static - Cellulose vi
khuẩn), trong môi trường lỏng G.xylinus tổng hợp tạo thành lớp màng dày
trên bề mặt môi trường. VLC thu được dẻo dai, dày, độ tinh sạch, độ bền cơ

6


học cao, khả năng chịu nhiệt tốt, có thể bị phân hủy sinh học, không độc hại,
không gây dị ứng, đặc biệt là khả năng cản khuẩn [4].
Khi nuôi cấy động (A - BC: Agitated - Cellulose vi khuẩn), cellulose

nhân vận chuyển thuốc,…
Mỹ phẩm: Làm chất ổn định trong kem dưỡng da, gel vuốt tóc, làm mặt
lạ dưỡng da,…
Môi trường: Sử dụng VLC để loại bỏ thủy ngân trong nước, nước thải.
Hút vết dầu tràn trên sông, biển ngăn ngừa ô nhiễm môi trường nước.
Phòng thí nghiệm: Màng cố định protein, cố định enzim, vi khuẩn,…
Ngành công nghiệp khác: VLC được sử dụng làm màng loa âm thanh
của tai nghe.
1.2. Tình hình nghiên cứu VLC
1.2.1. Trên thế giới
Với tính chất vô cùng độc đáo của VLC, VLC được các nhà khoa học
đặc biệt quan tâm tới việc nghiên cứu ứng dụng của nó vào trong nhiều lĩnh
vực. Trong đó, các nhà khoa học đã nghiên cứu ứng dụng của VLC làm vật
liệu hấp thụ thuốc qua da.
Fontana và cộng sự (1990) [22] đã chỉ ra VLC có khả năng băng kín
vết thương, duy trì dịch tiết, làm giảm đau vết thương, tăng tốc tái tạo tế bào,
làm giảm tỷ lệ nhiễm trùng vết thương, giảm sẹo và dễ dàng tháo gỡ, kiểm
tra.
Czaja và cộng sự (2007) [21] sử dụng VLC đắp lên vết bỏng đã thu
được kết quả tốt.
1.2.2. Tại Việt Nam
Ngày nay, việc nghiên cứu ứng dụng VLC ngày càng được các nhà
khoa học chú trọng. Một số sản phẩm từ VLC đã được thương mại hóa trên
thị trường như: thạch dừa, màng trị bỏng Acetul, mặt lạ dưỡng da, màng bao
xúc xích,...
Nguyễn Văn Thanh và cộng sự (2006) [9] đã tiến hành thử nghiệm in
vivo ứng dụng VLC để điều trị bỏng với hai loại. Một loại VLC cho thêm
hoạt chất tái sinh mô và một loại cho thêm hoạt chất kháng khuẩn. Kết quả
cho thấy tác dụng của màng có thêm hoạt chất tái sinh mô tốt hơn hẳn dạng
màng thông thường.

NS có dạng bột tinh thể màu trắng đến hơi vàng. Rất dễ tan trong nước,
khó tan trong ethanol 96%, không tan trong aceton [2]. Quang phổ hấp thụ ở
bước sóng 277 nm. Định tính NS trong các chế phẩm (thuốc tiêm, thuốc mỡ,
viên nén, dung dịch nhỏ mắt, ...)
1.3.3. Dược lý học và dược động học
NS là kháng sinh nhóm aminoglycoside có cơ chế và phổ tác dụng
tương tự gentamicin sulfat. Khi phối hợp với bacitracin, thuốc có tác dụng với
phần lớn các vi khuẩn Gram âm và Gram dương gây nên các nhiễm khuẩn
ngoài da. Những vi khuẩn nhạy cảm với NS như: Staphylococcus aureus,
Escherichia coli, Heamophilus influ- enzae, Klebsiella, Enterobacter,
Neisseria.
NS được hấp thu kém qua đường tiêu hóa, khoảng 97% lượng thuốc
uống vào cơ thể được bài tiết dưới dạng không đổi qua phân. Khi được hấp
thu, thuốc sẽ thải trừ nhanh qua thận dưới dạng hoạt tính. Điều này gây hại
cho thận.
1.3.4. Chỉ định và chống chỉ định
NS được dùng tại chỗ để điều trị các nhiễm khuẩn ngoài da, tai và mắt
do tụ cầu và các vi khuẩn khác nhạy cảm [1].
NS không được dùng trong đường tiêm hoặc toàn thân vì độc tính của
thuốc. Không dùng NS tại chỗ lâu với liều lượng cao vì có thể gây mẫn cảm
trên da và dễ mẫn cảm chéo với các kháng sinh aminoglycosid khác [15].
Bên cạnh đó thì NS có những tác dụng phụ như: mụn, làm khô da,
nhiễm trùng da, không có khả năng cản khuẩn. NS có khả năng thẩm thấu
qua da không cao đạt 45%, nhanh bị khô bề mặt trên da,…[1]. Để khắc phục
được tác dụng phụ của thuốc cần phải sử dụng một loại vật liệu có khả năng
giữ ẩm, cản khuẩn. Chính vì vậy mà tôi chọn VLC nạp NS để hạn chế tác
dụng phụ của thuốc.

10


2.1.2. Nguyên liệu và hóa chất
- Neomycin sulfate mua từ Trung Quốc
- Dung môi và chất phản ứng khác được mua từ Đức.
- VLC được sản xuất bằng cách sử dụng vi khuẩn G. xylinum lên men
trong môi trường nước dừa già.
- Nguyên liệu làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật tạo VLC: đường
glucose, peptone, diamoni photphat, amoni sulfat, nước dừa già.
2.1.3. Trang thiết bị
Máy đo quang phổ UV – 2450 (Shimadzu – Nhật Bản); cân phân tích
(Sartorius – Thụy sỹ); cân kỹ thuật (Sartorius - TE612); nồi hấp khử trùng
HV-110/HIRAIAMA; kính hiển vi điện tử quét; buồng cấy vô trùng
(Haraeus); tủ sấy; tủ ấm (Binder - Đức); khuấy từ gia nhiệt (IKA – Đức););
máy lắc tròn tốc độ chậm (Orbital Shakergallenkump - Anh); tủ lạnh Daewoo
và nhiều dụng cụ hóa sinh thông dụng khác.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Chuẩn bị VLC
2.2.1.1. Lên men thu VLC thô

13


Bảng 2.1. Thành phần môi trường lên men thu VLC
Thành phần

Khối lượng

Glucose

20 g



ở 26 C.
Bước 7: Thu VLC thô, rửa sạch chúng dưới vòi nước. Dựa trên một số
kết quả nghiên cứu của một số tác giả [7] , [9] tôi chọn VLC có độ dày từ
0,3 - 0,5cm làm hệ thống hấp thu thuốc định hướng sử dụng qua da. Sau khi
nuôi cấy tĩnh G. xylinum sau 6 - 8 ngày tiến hành thu VLC, VLC lúc này có
độ dày 0,3 cm – 0,5 cm
2.2.1.2. Tạo VLC tinh khiết
0

Sau khi ủ tĩnh trong 6 - 8 ngày ở 26 C, VLC được tách ra. Để tạo được
VLC tinh chế thì phải trải qua các bước sau:
Bước 1: Tách VLC thô ra khỏi môi trường nuôi cấy, ép bỏ bớt nước.
Bước 2: Ngâm VLC 48 giờ trong NaOH 3%, sau đó bỏ ra rửa và ép.

14


Bước 3: Ngâm tiếp trong HCl 3% trong 48 giờ, sau đó bỏ ra rửa và ép
loại bỏ nước.
Bước 4: Ngâm VLC 48 giờ trong nước, sau đó bỏ ra kiểm tra tạp chất
Bước 5: Thu VLC tinh chế
2.2.1.3. Phương pháp đánh giá độ tinh sạch củaVLC.
Để kiểm tra VLC đã tinh khiết hay chưa ta thực hiện các bước sau: Bước
1: VLC (0,3 cm), VLC (0,5 cm) sau khi tinh chế, lấy dịch thử,
chia vào 2 ống: ống thử 1 (VLC 0,3 cm), ống thử 2 (VLC 0,5 cm).
Bước 2: Chuẩn bị mẫu đối chứng: D – Glucose và nước cất 2 lần. Nhỏ
thuốc thử Fehling vào 2 ống đối chứng mỗi ống 1 ml. Ống chứa D – Glucose
sẽ có kết tủa đỏ nâu, còn ống chứa nước cất 2 lần sẽ không có hiện tượng gì.
Bước 3: Cho vào các ống thử mỗi ống nghiệm 1 ml thuốc thử Fehling


Bổ sung nước tới 1000 ml.

Na2HPO4

0,22g

Khử trùng.

15


2.2.2.2. Xây dựng đường chuẩn NS
Sử dụng hệ thống quang phổ tử ngoại UV để ghi mật độ quang hấp thụ
của thuốc NS.
Chuẩn bị dung dịch NS ở các nồng độ (mg/ml) khác nhau: 0,05; 0,1;
0,15; 0,2; 0,25; 0,3.
Sử dụng dung môi là PBS (pH = 7,4). Dùng máy đo quang phổ tử ngoại
(OD) UV – 2450 để đo UV ở bước sóng 277 nm (bước sóng hấp thụ cực đại
của NS). Tiến hành đo 3 lần, lấy giá trị trung bình quang phổ của thuốc NS để
xây dựng đường chuẩn của thuốc.
2.2.2.3. Chuẩn bị môi trường cho VLC nạp thuốc
Bước 1: VLC sau khi tinh chế ta lấy giấy thấm bỏ 60% nước
Bước 2: Chuẩn bị 3 bình 250 ml, mỗi bình cho NS (2 mg/ml) sau đó
cho dung dịch đệm PBS (pH= 7,4) đến vạch 100 ml.
Bước 3: Cho màng vào dung dịch vừa pha, rung động ở 180 vòng và
0

40 C trong 1 giờ, 1,5 giờ, 2 giờ đảm bảo cho màng hấp thụ tối đa. Sau đó lấy
0