BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÀI PHÚC TRÌNH
THỰC TẬP KỸ THUẬT PHÂN TÍCH VÀ THIẾT BỊ
MSHP: CS127

Cần Thơ 30/ 11/2019


TT. Kỹ thuật phân tích thiết bị

Nhóm C7 (Tổ 3)

PHẦN I: PHÚC TRÌNH KẾT QUẢ THỰC HÀNH
BÀI 1:
ĐỊNH TÍNH MỘT SỐ HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN TRONG THỰC
VẬT BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA HỌC
Dụng cụ vật liệu và hóa chất
Dụng cụ
- Ống nghiệm
- Kẹp ống nghiệm
- pipet
- Đèn cồn
- Găng tay cao su
Vật liệu và hóa chất
2.1 Vật liệu
- Mẫu cao chiết từ thực vật ( nhóm 3: Cao cải trời)
2.2 Hóa chất
-Thuốc thử Wagner



TT. Kỹ thuật phân tích thiết bị
3. Thí

nghiệm 3: Định tính Flavonoid

-Tiến hành: Cho 1mL cao chiết vào ống nghiệm
và thêm 1mL chì acetate vào
-Kết quả: Có kết tủa màu vàng xuất hiện.
-Kết luận: Có Flavonoid trong mẫu cao chiết

4. Thí

nghiệm 4: Định tính Phenol

-Tiến hành: Cho 2mL cao chiết vào ống nghiệm
và thêm 4 giọt FeCl3 5% vào
-Kết quả: Xuất hiện màu xanh dương sẫm đen
(hoặc màu đen)
-Kết luận: Có Phenol trong mẫu cao chiết

5. Thí

nghiệm 5: Định tính Saponin

-Tiến hành: Cho 2mL cao chiết và 4mL nước
cất vào ống nghiệm. Đun nóng nhẹ và lắc mạnh
khoảng 1-2 phút
-Kết quả: Không xuất hiện bọt.

-Kết luận: Có Terpenoid hiện diện trong mẫu cao
chiết

8. Thí

nghiệm 8: Định tính Tannin

-Tiến hành : Cho 2mL cao chiết vào ống nghiệm và
thêm 2mL nước cất vào. Sau đó, thêm 2-3 giọt FeCl 3
5% vào.
-Kết quả: Xuất hiện kết tủa xanh lá hoặc xanh lá hơi
nâu
-Kết luận: Có Tannin trong mẫu cao chiết
4

Nguyên tắc của việc định tính các hợp chất ở thí nghiệm trên là: Dựa vào sự thay đổi
màu sắc, hiện tượng hóa học của mẫu ban đầu với các thuốc thử. Từ đó xác định được các
hợp chất hóa học tồn tại trong mẫu cao chiết.

CS 127


TT. Kỹ thuật phân tích thiết bị

Nhóm C7 (Tổ 3)

BÀI 3
PHÂN TÍCH MỘT SỐ HỢP CHẤT BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG
(TLC)
I. Dụng cụ, vật liệu và hóa

để yên khoảng 30 phút đến 1 giờ đến khi dung môi bão hòa
Chuẩn bị bản mỏng TLC: sử dụng bản mỏng TLC có tráng silica gel kích thước
20x20cm. Cắt tấm bản mỏng thành tấm với kích thước 2,5x10cm. Từ mép trên kẻ đường chỉ
mảnh, với khoảng cách 1cm, để làm dừng quá trình phân tích sắc ký. Từ mép dưới, kẻ
đường chỉ mảnh cách 1,5cm, sao cho các vết chấm không bị ngập vào dung môi. Trên
đường chỉ chấm 4 điểm mỗi điểm cách nhau 0,4 cm, để nhỏ chất phân tích.
Chấm dung dịch phân tích lên bản mỏng: dùng ống mao quản (được kéo nhọn một đầu bằng
kẹp và ngọn lửa đèn cồn) . Chấm nhiều lần và mỗi lần chấm dung dịch chất cần được sấy
khô rồi mới được chấm tiếp.
Phân tích sắc ký: đặt thẳng đứng tấm bản mỏng vào cốc dung môi, để yên đến khi dung môi
chạy đến đường chỉ ở mép trên, lấy tấm bản mỏng ra, sấy ở 500C , trong 3-5 phút.
Quan sát kết quả và tính giá trị Rf: Rf được tính bằng tỉ số của khoảng cách chất cần phân
tích di chuyển và khoảng cách của dung môi di chuyển.
2. Kết quả

5

CS 127


TT. Kỹ thuật phân tích thiết bị

Nhóm C7 (Tổ 3)

Hình: Sắc ký lớp mỏng
-Trong những điều kiện nhất định (dung môi, nhiệt độ…), mỗi chất được đặc trưng bởi
một trị số nhất định gọi là hệ số Rf.
Rf = A/B
Trong đó:
- A: là khoảng cách di chuyển của chất phân tích.

BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐO ĐỘ HẤP THU QUANG PHỔ
4.1 Ghi nhận kết quả và xây dựng đường chuẩn tinh bột – iod bằng phần mềm exel

Hình 1: Mẫu sau khi pha loãng với nồng độ từ 0 – 1 mg/mL.
Bảng 1: Kết quả đo độ hấp thu quang phổ

Lần đo OD

7

Lặp lại

Nồng độ
(mg/mL)

Trung bình
R1

R2

R3

Ống 1

0

0,024

0,016


0.6

0,19

0,188

0,189

0,189

Ống 5

0.8

0,277

0,281

0,294

0,284

Ống 6

1

0,311

0,324



BÀI 5: PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VI SINH VẬT
I.
1.

2.
3.

II.


III.
1.

9

2.

CS 127

DỤNG CỤ, VẬT LIỆU VÀ HÓA CHẤT
Dụng cụ
- Bình tam giác 250 ml
- Ống nghiệm và khay đựng ống nghiệp
- Đĩa petri
- Đèn cồn, que cấy trải
- Đầu cone các loại
Vật liệu
Mẫu cần phân lập ( mẫu đất)
Hóa chất

- Kiểm tra hình thái khuẩn lạc trên kính hiển vi sao cho chỉ có một loại tế bào có
hình thái giống nhau là chọn được dòng vi khuẩn thuần.
Nêu nguyên lý hoạt động của tủ cấy và các bước cơ bản trong thao tác cấy
- Không khí trong phòng đi vào từ phía trên cùng của tủ qua bộ lọc trước (ở đây
các hạt lớn được giữ lại, việc này gia tăng tuổi thọ cho lọc chính. Vì bộ lọc chính
không cần phải lọc các hạt lớn nữa)
- Không khí bị ép đồng đều trên toàn bộ màng lọc ULPA cho dòng khí sạch thống
nhất. Làm loãng và làm sạch chất ôi nhiễm không khí từ bên trong.


TT. Kỹ thuật phân tích thiết bị

Nhóm C7 (Tổ 3)

Vận tốc bề mặt lọc 0-45m/s(90FPM) đảm bảo đủ số lượng thay đổi không khí để
duy trì sạch trong khu vực làm việc.
- Không khí đi xuống khu vực thao tác làm việc theo một dòng chảy chiều thẳng
đứng, và thoái khỏi khu vực làm việc trên toàn bộ diện tích mở ra trước tủ sau khi
làm việc chệch hướng khỏi bề mặt làm việc,
- Lỗ ở tường phía sau được thiết kế để làm giảm thiểu biến động bề mặt làm việc
và giảm thiếu khả năng không khí góc chết trong vừng làm việc.
Các bước cơ bản trong thao tác cấy
- Sát trùng tay bằng dung dịch cồn 70%, sát trùng mặt bàn làm việc trước và sau
khi làm việc.
- Vô trùng que cấy, que trang
- Vô trùng pipet
- Chuẩn bị, pha loãng dịch huyền phù
- Cấy truyền dịch huyền phù lên môi trường thạch trong đĩa petri
- Đậy nắp hộp lồng, dán nhãn cho hộp lồng gồm ngày thực hiện, nồng độ pha loãng
của dịch huyền phù, tên môi trường

Khay đựng ống nghiệm eppendorf
Vật liệu
Mẫu DNA vi khuẩn hay thực vật
3. Hóa chất
- Master mix của công ty Sinh Hóa Phù Sa
- Mồi xuôi 27F ( 27F: 5’- GAG AGT TTG ATC CTG GTC CAG – 3’) đối với vi
khuẩn.
- Mồi ngược 1495R(1495R 5’ – CTA CGG CTA CCT TGT TAC GA – 3’) đối với
vi khuẩn.
- Nước cất thanh trùng.
II.
TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM
Thành phần hỗn hợp chuẩn bị cho PCR (50 µL):
- 25 µl master mix của công ty Sinh Hóa Phù Sa.
- 1 µl mồi xuôi (27F) 10µM
- 1 µl mồi ngược (1495R) 10µM
- 3 µl mẫu DNA ( nồng độ - 100 µL)
- 20 µL nước cất thanh trùng.
Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR
I.
1.
2.





95oC
2m


cũng như mồi được làm nóng. DNA-Polymerase có thể có trong giai đoạn khởi
đầu, hoặc nó có thể được thêm vào ngay sau bước này.
Bước 2: Biến tính (Melting). 95°C trong 1 phút. Đối với mỗi chu kì thì lượng thời
gian này là đủ để biến tính DNA.
Bước 3: Gắn mồi (Annealing). 50°C trong 2 phút.
Bước 4: Kéo dài (Elongation).72°C trong 3 phút.
Bước 5: Các bước từ 2 đến 4 được lặp lại 35 lần, tuy nhiên với mồi và polymerase
tốt, có thể có ít chu kì hơn.


TT. Kỹ thuật phân tích thiết bị
-

-

-

-

12

CS 127

Nhóm C7 (Tổ 3)

Bước 6: Giữ hỗn hợp ở 4°C. Tại nhiệt độ này DNA sẽ không bị hư hại trong vòng
1 đêm.
2. Tại sao có sự khác biệt về nhiệt dộ trong quá trình PCR?
Sự khác biệt về nhiệt độ trong quá trình PCR do trong quá trình PCR cần khuếch
đại đoạn gen nên cần có những nhiệt độ thích hợp cho từng giai đoạn để đoạn gen

thư) nên phù hợp với sinh viên trong công tác học tập.


Tại sao phải chọn nồng độ agarose thích hợp cho mỗi đoạn gene có kích thước
khác nhau?
-Vì khi thực hiện quá trình điện di Gel agarose, tốc độ di chuyển của mỗi đoạn gen là khác
nhau. Tốc độ di chuyển của DNA phụ thuộc vào một số thồng số sau:
-Kích thước DNA: các phân tử DNA thẳng có kích thước lớn khi di chuyển qua lỗ gel sẽbị
cản trở nên chậm so với DNA có kích thước nhỏ
-Nồng độ agarose: tùy kích thước DNA muốn phân tích mà ta chọn nồng độ agarose thích
hợp. Kích thước DNA càng nhỏ muốn dễ phân tích thì nên sử dụng nồng độ agarose phải
càng cao và ngược lại.
-Tùy kích thước DNA muốn phân tích mà ta chọn nồng độ agarose thích hợp. Kích thước
DNA càng nhỏ muốn dễ phân tích thì nên sử dụng nồng độ agarose phải càng cao và ngược
lại.
13
 Nêu nguyên lý của kỹ thuật phân tích điện di?
-Điện di là một kĩ thuật để phân tích các phân tử DNA, RNA, Protein dựa trên các đặc điểm
vật lý của chúng như kích thước, hình dạng hay điểm đẳng điện.


CS 127


TT. Kỹ thuật phân tích thiết bị

Nhóm C7 (Tổ 3)

-Kĩ thuật này sử dụng một dung dịch đệm để dẫn diện và tạo điện trường đều, một bản gel
(thường là agarose hay polyacrylamide) làm nền để phân tách các phân tử, và các chất

- Khi cân, không thực hiện thao tác khuấy, gõ lên chén cốc đựng mẫu. Các thao tác nói
trên và tương tự cần phải được thực hiện bên ngoài cân hoặc thay thế bằng các thao
tác khác không gây tác động trực tiếp lên mặt bàn cân.
- Để cân phân tích trên vị trí bằng phẳng.
- Mỗi khi di dời cân phân tích, cần kiểm tra và hiệu chỉnh độ thăng bằng của mặt bàn
cân. Tùy theo loại cân phân tích, chúng ta có thể kiểm tra độ lệch khỏi vị trí trung
tâm của giọt nước .
2./ Mô tả cách sử dụng máy đo pH, cách chỉnh pH chuẩn, nêu các loại pH chuẩn và
khoản pH của các pH chuẩn?
14 -

CS 127

Các bước tiến hành chuẩn lần lượt như sau:
Gắn điện cực vào máy đo rồi bật công tắc bên hông máy về vị trí pH. Tháo vỏ nhựa
bao đầu điện cực (lưu ý bên trong có chứa dung dịch KCl 3M. Rửa điện cực bằng
nước cất. Dùng giấy thấm để thấm bớt nước đầu điện cực.


TT. Kỹ thuật phân tích thiết bị
-

-

-

-

-


trình mV / pH của đồng hồ được điều chỉnh để phù hợp với các đặc tính của điện cực
pH được sử dụng.
Hiệu chuẩn nhiều điểm – Với một số mét pH, hiệu chuẩn có thể được thực hiện cho
hơn hai giá trị pH trên cả hai mặt của điểm zero, trong trường hợp này là pH 7,00.
Hiệu chuẩn ở ba hoặc nhiều giá trị pH làm tăng phạm vi đo của thiết bị mà không cần
hiệu chuẩn lại.
Cần dùng 2 dung dịch đệm có trị số là pH 7 và pH X
Khi dung dịch cần đo có pH < 7, chọn pH X là pH 4
Nếu dung dịch cần đo có pH > 7, chọn pH X là pH 10, phép đo sẽ chính xác hơn
Các loại pH chuẩn:
Quỳ tím
Máy đo pH
Bút đo pH: Bút đo pH đất, bút đo pH nước
Test sera
3./ Những lưu ý khi sử dụng máy cô quay chân không (rotatory evaporator)?
Đọc hoặc tìm hiểu kỹ các bước vận hành sử dụng trước khi sử dụng máy.
Tìm hiểu trước về đặc tính (ví dụ: nhiệt độ sôi, nhiệt độ nóng chảy,...) của các chất,
các dung môi đem đi cô quay.
Cô quay các hợp chất có tính ổn định trong quá trình cô quay.
Kiểm tra các bộ phận của thiết bị đảm bảo trạng thái hoạt động bình thường (ví dụ:
bình thủy tinh chứa mẫu và dung môi, ống sinh hàn không bị rạn nứt, máy hoạt động
bình thường)
Cẩn thận nâng và đặt bình chứa và bình bay hơi vào máy, giữ bình chứa mẫu cho đến
khi bật máy hút chân không và cảm thấy bình mẫu đã bị hút chặt vào vị trí lắp . Phải
cẩn thận để tránh làm vỡ bình.
Khi lắp hệ thống xong, cần kiểm tra lại độ kín của hệ thống cô quay.
Điều chỉnh độ mạnh của chân không một cách từ từ (hoặc nhiệt cung cấp từ nồi nước
nóng) để điều chỉnh tốc độ bay hơi, hoặc thêm hóa chất như boiling chíp (để hỗ trợ
quá trình bay hơi).
Cài đặt tốc độ quay vừa đủ.

trong của hệ thống thông với không khí bên ngoài nhờ ống sinh hàn, vì thế khi nối
dài ống sinh hàn không được làm ống bị bít.
Sau khi chiết kiệt với một loại dung môi, muốn tiếp tục chiết với dung môi có tính
phân cực cao hơn thì ta phải rút bao chứa nguyên liệu ra khỏi ống, mở miệng bao cho
dung môi bay hết, rồi cho bao trở lại ống, rót dung môi mới vào và bắt đầu quy trình
chiết mới.
5./ Những lưu ý khi sử dụng tủ cấy?
Cần phải vệ sinh sạch sẽ tủ trước và sau khi sử dụng bằng dung dịch ethanol 70%,
calcium hypochloride 10%,...
Sắp xếp dụng cụ, vật liệu cần thiết (trừ mẫu thí nghiệm) cho quy trình theo trật tự
hợp lý và phải làm sạch với chất khử nhiểm (ethanol 70%),…
Bật UV đủ thời gian cần thiết để đảm bảo vô trùng tủ trước khi sử dụng (thường 30 –
50 phút) và tránh tiếp xúc với tủ khi đang bật UV.
Không để giấy, thiết bị,… chặn các lỗ khí phía trước tủ (có thể gây xáo trộn không
khí, mang nguồn không khí ô nhiễm vào tủ) và thực hiện cách các lỗ khí này ít nhất
10cm.

6/. Những lưu ý khi sử dụng sắc ký bản mỏng (TLC)?
-

16 -

Chú thích bằng viết chì lên bản sắc ký. Khi chú thích nhớ vạch nhẹ đừng đè mạnh,
tránh làm hỏng lớp silica gel trên sắc kí
Khi cầm bản sắc kí tránh dùng tay trực tiếp lên lớp silica gel, sẽ ảnh hưởng đến kết
quả của quá trình sắc ký.
Sử dụng máy sấy hoặc đợi cho khô rồi mới được chấm tiếp tục mẫu lên bản sắc ký.
Sau khi sắc ký xong nhớ dùng đánh dấu lại vạch màu, mực nước tránh khi bản sắc ký
khô sẽ bay mất.
Khi đặt bản sắc ký vào dung môi thì cần chú ý đặt thẳng đứng nhất có thể tránh

Chỉ sử dụng khi được sự cho phép và hướng dẫn sử dụng của cán bộ phòng thí
nghiệm.
Cần tìm hiểu rõ cách vận hành, các thao tác sử dụng nồi hấp thanh trùng đúng cách
Đặt nồi hấp trên nền phẳng, cân bằng và giữ khoảng cách hơn 6cm giữa tường và vỏ
máy.
Kiểm tra gioăng cao su đã được đặt đúng vị trí chưa. Trước khi sử dụng cần dùng
khăn ẩm sạch lau phía bên ngoài và bề mặt tiếp xúc với nồi của gioăng để tránh có
vật thể lạ làm thoát hơi trong quá trình tiệt trùng
Chú ý: thao tác mở nắp nồi cần nhẹ nhàng, sau khi mở nắp không nên bỏ tay ra ngay
khỏi tay nắm để tránh trường hợp hỏng lò xo đàn hồi của nắp nồi
Đợi áp suất trong nồi về 0 mới được mở nắp nồi
Khi mở nắp cần thực hiện đúng để tránh bị thương
Kiểm tra nguồn điện trước khi sử dụng. Ngắt điện sau khi sử dụng.
Sau khi mở nắp nồi, lấy rổ lưới và các phụ kiện ra khỏi nồi sau đó dùng khăn sạch
tiến hành lau bên trong nồi.
Trước khi bật nồi, cần kiểm tra lượng nước trong nồi có cạn quá không ( tránh việc
cháy role trong nồi)
Nhớ canh thời gian khử trùng.

9/. Những lưu ý khi sử dụng máy cất nước và máy lọc nước RO?

-

Máy cất nước
Phải khoá vòi khi không có nước.

Máy lọc nước RO

-


CS 127

Nhóm C7 (Tổ 3)