BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NUÔI
CẤY LÊN KHẢ NĂNG NHÂN NHANH
SINH KHỐI PHÔI SÂM NGỌC LINH
TRONG ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY IN VITRO

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hƣớng dẫn: TS. Hà Thị Loan
Sinh viên thực hiện

: Phạm Thảo My

MSSV: 1411100365 Lớp: 14DSH02

TP. Hồ Chí Minh, Tháng 8 Năm 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP


Xin đƣợc gửi lời cơm ơn sâu sắc đến TS. Hà Thị Loan và KS. Đào Bá Uy
những ngƣời đã hƣớng dẫn, chỉ bảo và truyền đạt kiến thức, kỹ năng, tài liệu trong
suốt thời gian tôi thực hiện đề tài. Tôi cũng xin cảm ơn tất cả các anh chị trong
phòng thực nghiệm cây trồng đã luôn sẵn sàng giúp đỡ và hỗ trợ tôi trong công việc
và học tập.
Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn đến trƣờng Đại học Hutech thành phố Hồ Chí
Minh, cảm ơn TS. Nguyễn Thị Hoài Hƣơng Viện Khoa học Ứng dụng Hutech đã
tạo điều kiện cho tôi đƣợc gặp gỡ tiếp xúc với môi trƣờng làm việc thực tế và đƣợc
nghiên cứu đề tài tại Trung tâm Công nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh.
Cuối cùng tôi xin kính chúc ban giám hiệu trƣờng Đại học Hutech, ban lãnh
đạo Trung tâm Công Nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh, TS. Hà Thị Loan, KS.
Đào Bá Uy luôn dooif dào sức khỏe, gặt hái đƣợc nhiều thành công trong công
việc, cuộc sống luôn tràn đầy niềm vui và hạnh phúc.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày

Tháng

Sinh viên thực hiện

i

Năm 2018


CÔNG TRÌNH ĐƢỢC HOÀN THÀNH
TẠI TRƢỜNG ĐẠI HỌC HUTECH
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và đƣợc sự
hƣớng dẫn khoa học của TS. Hà Thị Loan và KS. Đào Bá Uy; Các nội dung nghiên
cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và chƣa công bố dƣới bất kỳ hình thức
nào trƣớc đây. Những số liệu trong các bảng, Biểu đồ phục vụ cho việc phân tích,

Tên đề tài: “Ảnh hƣởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng nhân nhanh sinh
khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro”.
Ngƣời hƣớng dẫn: TS. Hà Thị Loan.
Địa điểm: đề tài đƣợc tiến hành tại phòng thí nghiệm thực nghiệm cây trồng
Trung tâm Công nghệ Sinh học quận 12 thành phố Hồ Chí Minh.
Địa chỉ: 2374 Quốc lộ 1, phƣờng Trung Mỹ Tây, quận 12 TP HCM
Đề tài gồm 5 thí nghiệm lần lƣợt khảo sát ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh
trƣởng thực vật BA, BA kết hợp nới NAA, Oligochitosan, của điều kiện nuôi cấy
ánh sáng và nhiệt độ lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh trong
nuôi cấy in vitro.
Sau 10 tuần nuôi cấy, ở thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của BA, BA và
NAA, kết quả cho thấy mẫu đƣợc nuôi cấy ở môi trƣờng MS có bổ sung 1mg/l BA
và 0,5m/l NAA (nghiệm thức đạt kết quả tốt nhất thí nghiệm 2) cho kết quả tốt hơn
so với phôi đƣợc nuôi cấy ở môi trƣờng MS chỉ bổ sung 0,5mg/l BA (nghiệm thức
đạt kết quả tốt nhất thí nghiệm 1) với Hệ số nhân sinh khối là 9,55 lần. Bên cạnh đó
đối với thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của Oligochitosan, kết quả cho thấy
Oligochitosan không những không kích thích khả năng tăng sinh khối cho phôi sâm
Ngọc Linh mà còn ức chế khả năng sinh trƣởng phôi sâm Ngọc Linh. Ở thí nghiệm
ánh sáng, mẫu phôi sâm Ngọc Linh sinh trƣởng mạnh nhất ở điều kiện nuôi cấy
dƣới ánh đèn LED phối hợp theo tỉ lệ 60 đỏ:40 xanh. Và đồng thời qua kết quả thí
nghiệm 4 chúng tôi nhận thấy mẫu phôi sâm Ngọc Linh thích hợp sinh trƣởng trong

iii


0

0

khoảng nền nhiệt từ 19 C – 23 C tuy nhiên trong đề tài này nhiệt độ tốt nhất là

2.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến nuôi cấy mô tế bào thực vật .................................. 11

v


3.1 Địa điểm và thời gian tiến hành ....................................................................... 19
3.2 Vật liệu thí nghiệm .......................................................................................... 19
3.2.1 Vật liệu ...................................................................................................... 19
3.2.2 Trang thiết bị và dụng cụ ........................................................................... 20
3.2.3 Hóa chất ..................................................................................................... 20
3.3 Phƣơng pháp thí nghiệm .................................................................................. 20
3.4 Bố trí thí nghiệm .............................................................................................. 21
3.4.1 Thí nghiệm 1: ảnh hƣởng của BA lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi
sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro. ............................................................. 21
3.4.2 Thí nghiệm 2: ảnh hƣởng của NAA và BA lên khả năng nhân nhanh sinh
khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro. ............................................. 22
3.4.3 Thí nghiệm 3: ảnh hƣởng của ánh sáng lên khả năng nhân nhanh sinh khối
phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro. ..................................................... 23
3.4.4 Thí nghiệm 4: ảnh hƣởng của nhiệt độ lên sự nhân nhanh sinh khối phôi
sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro. ............................................................. 25
3.4.5 Thí nghiệm 5: ảnh hƣởng của nồng độ chitosan lên sự nhân nhanh phôi
sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro. ............................................................. 26
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 28
4.1 Kết quả thí nghiệm 1: ảnh hƣởng của BA lên khả năng nhân nhanh sinh khối
phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro .......................................................... 28
4.2 Kết quả thí nghiệm 2: ảnh hƣởng của NAA và BA lên khả năng nhân nhanh
sinh khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro .......................................... 31
4.3 Kết quả thí nghiệm 3: ảnh hƣởng của ánh sáng lên khả năng nhân nhanh sinh
khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro .................................................. 35
4.4 Kết quả thí nghiệm 4: ảnh hƣởng của nhiệt độ lên khả năng nhân nhanh sinh


: 3 – indol butyric acid

MS

: Murashige và Skoog (1962)

2i – P

: 2 – isopentenyladenine

Tp. Hồ Chí Minh

: Thành phố Hồ Chí Minh

KHCN

: Khoa học công nghệ

Cty TNHH

: công ty trách nhiệm hƣu hạn

viii


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ BA lên khả năng
nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh



40

Bảng 4.5: so sánh ảnh hƣởng của Oligochitosan lên khả năng nhân phôi và chồi
sâm Ngọc Linh

ix

43


DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 4.1: Biểu đồ so sánh khối lƣợng phôi tƣơi và số chồi giữa các nồng độ
BA khác nhau

28

Biểu đồ 4.2: Biểu đồ so sánh khối lƣợng phôi tƣơi và số chồi giữa các nồng độ
BA và NAA khác nhau

32

Biểu đồ 4.3: Biểu đồ so sánh khối lƣợng phôi tƣơi và số chồi giữa các loại ánh
sáng khác nhau

36

Biểu đồ 4.4: Biểu đồ so sánh khối lƣợng phôi tƣơi giữa các mức nhiệt độ khác
nhau 40
Biểu đồ 4.5: Biểu đồ so sánh khối lƣợng phôi tƣơi và số chồi giữa các nồng độ


33

Hình 4.5: Ảnh hƣởng của ánh sáng lên sự nhân nhanh sinh khối phôi samm Ngọc
Linh ở giai đoạn 4 tuần tuổi và 10 tuần tuổi
Hình 4.6: Sự khởi tạo lại phôi non xung quanh phôi già (thái hóa) trong thí
nghiệm ánh sang

xi

37

38


Hình 4.7: Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên sự nhân nhanh phôi sâm Ngọc Linh ở giai
đoạn 4 tuần tuổi và 10 tuần tuổi

41

Hình 4.8: Màu sắc phôi sâm Ngọc Linh của các nghiệm thức thí nghiệm........................... 42
Hình 4.9: Ảnh hƣởng của Oligochitosan lên sự nhân nhanh phôi sâm Ngọc Linh ở
giai đoạn 4 tuần tuổi và 10 tuần tuổi

xii

44


CHƢƠNG 1: GIỚI THIỆU

Tìm ra nồng độ chất điều hòa sinh trƣởng thực vật bổ sung và các điều kiện
môi trƣờng thích hợp (nhiệt độ, ánh sáng) cho quá trình nhân nhanh sinh khối phôi
sâm Ngọc Linh nhằm tạo ra số lƣợng lớn mẫu sâm Ngọc Linh In vitro.
1.3 Nội dung nghiên cứu
Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của BA lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi
sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro.
Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của NAA và BA lên khả năng nhân nhanh sinh
khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro.
Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của ánh sáng lên khả năng nhân nhanh sinh khối
phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro.
Thí nghiệm 4: Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên khả năng nhân nhanh sinh khối
phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro.
Thí nghiệm 5: Ảnh hƣởng của Oligochitosan lên khả năng nhân nhanh sinh
khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro.
1.4 Ý nghĩa đề tài
Thông qua đề tài nghiên cứu, có thể tìm đƣợc điều kiện nuôi cấy thích hợp
nhất cho sự nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh. Tạo điều kiện thuận lợi cho
các nghiên cứu về sâm Ngọc Linh sau này. Đồng thời góp phần nghiên cứu để sản
xuất cây giống sâm Ngọc Linh ở quy mô công nghiệp, làm nguồn nguyên liệu để
nhân sinh khối, đáp ứng nhu cầu trong nƣớc và nƣớc ngoài.
Giúp cho sinh viên hiểu và có nhiều kiến thức hơn về sâm Ngọc Linh. Tìm
hiểu và nắm rõ kiến thức về phƣơng pháp nghiên cứu khoa học, thu thập, xử lý và
phân tích số liệu. Biết cách trình bày một nghiên cứu khoa học.

2


CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN ĐỀ TÀI
2.1 Sơ lƣợc về nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.1.1 Nuôi cấy mô tế bào thực vật là gì?


Nguồn ảnh: https://hoc247.net
2.1.2 Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật
Năm 1902, nhà thông thái Haberlandt lần đầu tiên đƣa ra ý tƣởng cấy mô
sinh vật ra ngoài cơ thể nhƣng ông đã dùng tế bào quá chuyên biệt nên không thành
công.
Năm 1934, White đã thành công trong việc phát hiện ra sự sống vô hạn của
việc nuôi cấy tế bào rễ cà chua.
Năm 1951, Skoog và Miller đã cải tiến môi trƣờng nuôi cấy đánh dấu một
bƣớc tiến trong kỹ thuật nuôi cấy mô. Môi trƣờng của họ đã đƣợc dùng làm cơ sở
cho việc nuôi cấy nhiều loại cây và vẫn còn đƣợc sử dụng rọng rãi cho đến ngày
nay.
Năm 1964, Ball là ngƣời đầu tiên tìm ra mầm rễ từ việc nuôi cấy chồi ngọn.
Ông đã thành công trong việc chuyển cây non của cây sen cạn từ môi trƣờng nuôi
cấy tối thiểu. Tuy nhiên, việc nhân giống cây vẫn chƣa hoàn chỉnh. Sau đó nhiều

4


nhà nghiên cứu đã khám phá ra những thành phần dinh dƣỡng qua trọng cần thiết
cho sự phát triển của các tế bào đƣợc nuôi cấy.
Năm 1960 - 1964, Morel cho rằng có thể nhân giống vô tính lan bằng nuôi
cấy đỉnh sinh trƣởng. Từ kết quả đó, lan đƣợc xem là cây nuôi cấy mô đầu tiên
đƣợc thƣơng mai hóa. Từ đó đến nay, công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã
đƣợc phát triển với tốc độ nhanh trên nhiều cây khác và đƣợc ứng dụng thƣơng
mại hóa. (Dƣơng Công Kiên, 2003)
2.1.3 Ứng dụng
Nuôi cấy mô tế bào thực vật đƣợc sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu thực
vật, lâm nghiệp, và đồng ruộng (BioMedia VN, 2016). Các ứng dụng bao gồm:
 Thƣơng mại hóa sản xuất các loài thực vật sử dụng nhƣ là cây cảnh, trang trí

khoai tây và rất nhiều các loài có quả mềm.
 Có thể tạo ra các loài lai vô trùng giống hệt nhau
2.2 Tổng quan về c y s m Ngọc Linh

Hình 2.1. hình ảnh cây sâm Ngọc Linh
(Nguồn: nhansamlinhchi.net.vn)
2.2.1 Lịch sử phát hiện
Năm 1973, đoàn Điều tra dƣợc liệu Ban Dân Y khu 5 do dƣợc sỹ Đào Kim
Long và Nguyễn Châu Giang hƣớng dẫn đã phát hiện đƣợc một loài Panax mọc
thành quần thể ở độ cao 1800m tại vùng Ngọc Lây, Huyện Đắc Tô, Tỉnh KonTum
và đặt tên là “sâm đốt trúc“ với tên khoa học sơ bộ xác định là Panax articulates L.
, họ Nhân sâm (Araliaceae)

6


Trải qua hơn 30 năm sâm K5 còn gọi là sâm Ngọc Linh hay sâm Việt Nam,
một loài sâm đặc hữu của nƣớc ta đã đƣợc thế giớ biết đến với tên khoa học là
Panax vietnamenis Ha et Grushv. (Hà Thị Dụng và Grushvisky, 1985)
2.2.2 Nơi ph n bố của sâm Ngọc Linh
Cây sâm đƣợc phát hiện ở độ cao từ 1200 m trở lên,có tài liệu cho biết cao
độ tìm thấy sâm Ngọc Linh là khoảng 1500m (Cam Lu – Trƣơng Hiệu, 2003), đạt
mật độ cao nhất ở khoảng từ 1700 - 2000m dƣới tán rừng già, và cho tới nay chỉ có
hai tỉnh KonTum và Quảng Nam là có cây sâm này.
Sâm mọc tập trung dƣới chân núi Ngọc Linh, một ngọn núi cao 2578m với
lớp đất vàng đỏ trên đá Granit dày trên 50 cm, có độ mùn cao, tơi xốp và rừng
nguyên sinh còn rộng, nên đƣợc gọi là sâm Ngọc Linh
Những nghiên cứu thực địa mới nhất cho thấy sâm còn mọc cả ở núi Ngọc
Lum Heo thuộc Xã Phƣớc Lộc, Huyện Phƣớc Sơn, Tỉnh Quảng Nam, đỉnh núi
Ngọc Am thuộc Quảng Nam, Đắc Glây thuộc KonTum, núi Langbian ở Lạc Dƣơng

quả chứa một hạt, một số quả chứa 2 hạt và số quả trên cây bình quân khoảng 10
đến 30 quả.

Hình 2.2. Các bộ phận của cây sâm Ngọc Linh
(Nguồn agi.gov.vn)

8


b) Đặc điểm sinh lí:
Mọc dƣới tán rừng ẩm, nhiều mùn, thích hợp với nhiệt độ ban ngày từ 20°C
- 25°C, ban đêm 15°C - 18°C, sâm Ngọc Linh có thể sống rất lâu, thậm chí trên 100
năm (Võ Tuấn, 2014, báo Lao Động), sinh trƣởng khá chậm. Bộ phận dùng làm
thuốc chủ yếu là thân rễ, củ và ngoài ra cũng có thể dùng lá và rễ con. Vào đầu
tháng 1 hàng năm, sâm xuất hiện chồi mới sau mùa ngủ đông, thân khí sinh lớn dần
lên thành cây sâm trƣởng thành có 1 tán hoa. Từ tháng 4 đến tháng 6, cây nở hoa và
kết quả. Tháng 7 bắt đầu có quả chín và kéo dài đến tháng 9. Cuối tháng 10, phần
thân khí sinh tàn lụi dần, lá rụng, để lại một vết sẹo ở đầu củ sâm và cây bắt đầu giai
đoạn ngủ đông hết tháng 12. Chính căn cứ vào vết sẹo trên đầu củ mỗi mùa đông
đến mà ngƣời ta có thể nhận biết cây sâm bao nhiêu tuổi, phải ít nhất 3 năm tuổi tức
trên củ có một sẹo (sau 3 năm đầu sâm chỉ rụng một lá) mới có thể khai thác,
khuyến cáo là trên 5 năm tuổi. Mùa đông cũng là mùa thu hoạch tốt nhất phần thân
rễ của sâm (Cam Lu – Trƣơng Hiệu, 2003).
d)Dƣợc tính
Theo tiến sĩ Nguyễn Bá Hoạt cán bộ Viện Dƣợc liệu thì về mặt hoá học, thân
rễ và rễ củ sâm Ngọc Linh hiện nay (2007) đã phân lập đƣợc 52 saponin trong đó
26 sanopin thƣờng thấy ở sâm Triều Tiên, sâm Mỹ, sâm Nhật. Trong lá và cọng đã
phân lập đƣợc 19 saponin pammaran, trong đó có 8 saponin có cấu trúc mới. Đã xác
định đƣợc trong sâm Ngọc Linh 17 axít amin, 20 chất khoáng vi lƣợng và hàm
lƣợng tinh dầu là 0,1% ( Võ Tuấn, 2014, báo Lao Động)

bất định, nhân rễ bằng bioreactor sục khí , sánh kịp các nƣớc trong khu vực và thế
giới về trình độ khoa học – công nghệ. Hơn nữa, do thao tác nuôi cấy không phức
tạp; sinh khối thu đƣợc có thể đáp ứng cho nhiều mục đích sử dụng khác nhau nhƣ
thực phẩm chức năng, mỹ phẩm và y dƣợc; và điều kiện nuôi không chịu sự chi
phối của môi trƣờng bên ngoài. (Nguyễn Hữu Hổ, 2014)
Nghiên cứu tạo và nuôi nhân mô sẹo có khả năng sinh phôi soma từ mô sẹo
lá trong môi trƣờng lỏng; tạo mô phôi soma từ mô sẹo có khả năng sinh phôi, sự
phát sinh hình thái chồi/rễ của mô phôi soma trong nuôi cấy và nuôi nhân phôi
10


soma sâm Ngọc Linh trong môi trƣờng lỏng tạo kết quả tiền đề cho nghiên cứu
nhân sinh khối quy mô lớn hai loại mô có khả năng sản sinh hàm lƣợng hợp chất
thứ cấp cao do chúng đã mang ít nhiều trạng thái biệt hóa. (Nguyễn Hữu Hổ, 2014)
Tại Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học thành phố Hồ Chí Minh nhóm nghiên
cứu Hà Thị Loan đã nghiên cứu thành công đề tài “nghiên cứu tạo rễ tóc sâm ngọc
linh Panax vietnamensis bằng phương pháp chuyển gen rol nhờ vi khuẩn
agrobacterium rhizogenes”. Vì sâm Ngọc Linh có hàm lƣợng saponin trong thân rễ
cao hơn so với những loài sâm cùng chi Panax. Biến nạp gen nhằm thay đổi thông
tin di truyền giúp cải thiện tạo đƣợc những hoạt chất sinh học có giá trị, đặc biệt là
dùng vi khuẩn đất Agrobacterium rhizogenes chứa gen rol cảm ứng tạo rễ tóc. (Tạp
chí sinh học, 2014)
GS.TS Dƣơng Tấn Nhựt tạo mô sẹo sâm Ngọc Linh bằng cách lấy mảnh lá
(0,5 x 0,5 cm) đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng tạo mô sẹo MS có 2 mg/l 2,4-D. Mô
sẹo đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng MS + 1 mg/l 2,4-D + 1 mg/l NAA + 0,2 mg/l
kinetin + 10% nƣớc dừa để tạo mô sẹo có khả năng sinh phôi và môi trƣờng MS½
+ 0,2 mg/l 2,4-D + 10% nƣớc dừa để tạo mô phôi. Mô sẹo có khả năng sinh phôi
tăng nhanh sinh khối qua nuôi cấy trong môi trƣờng lỏng MS + 0,5 mg/l 2,4-D +
0,5 mg/l NAA. Mô phôi có khả năng tăng sinh nhanh trong môi trƣờng lỏng MS½
+ 0,2 mg/l NAA + 0,2 mg/l BA. Tùy môi trƣờng nuôi cấy ban đầu và ở các giai