BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY LÊN
KHẢ NĂNG NHÂN NHANH SINH KHỐI PHÔI SÂM
NGỌC LINH TRONG ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY IN
VITRO

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hƣớng dẫn: TS. Hà Thị Loan
Sinh viên thực hiện

: Phạm Thảo My

MSSV: 1411100365 Lớp: 14DSH02

TP. Hồ Chí Minh, Tháng 8 Năm 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP


Xin đƣợc gửi lời cơm ơn sâu sắc đến TS. Hà Thị Loan và KS. Đào Bá Uy
những ngƣời đã hƣớng dẫn, chỉ bảo và truyền đạt kiến thức, kỹ năng, tài liệu trong
suốt thời gian tôi thực hiện đề tài. Tôi cũng xin cảm ơn tất cả các anh chị trong
phòng thực nghiệm cây trồng đã luôn sẵn sàng giúp đỡ và hỗ trợ tôi trong công việc
và học tập.
Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn đến trƣờng Đại học Hutech thành phố Hồ Chí
Minh, cảm ơn TS. Nguyễn Thị Hoài Hƣơng Viện Khoa học Ứng dụng Hutech đã
tạo điều kiện cho tôi đƣợc gặp gỡ tiếp xúc với môi trƣờng làm việc thực tế và đƣợc
nghiên cứu đề tài tại Trung tâm Công nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh.
Cuối cùng tôi xin kính chúc ban giám hiệu trƣờng Đại học Hutech, ban lãnh
đạo Trung tâm Công Nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh, TS. Hà Thị Loan, KS.
Đào Bá Uy luôn dooif dào sức khỏe, gặt hái đƣợc nhiều thành công trong công việc,
cuộc sống luôn tràn đầy niềm vui và hạnh phúc.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày

Tháng

Sinh viên thực hiện

i

Năm 2018


CÔNG TRÌNH ĐƢỢC HOÀN THÀNH
TẠI TRƢỜNG ĐẠI HỌC HUTECH
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và đƣợc sự
hƣớng dẫn khoa học của TS. Hà Thị Loan và KS. Đào Bá Uy; Các nội dung nghiên
cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và chƣa công bố dƣới bất kỳ hình thức
nào trƣớc đây. Những số liệu trong các bảng, Biểu đồ phục vụ cho việc phân tích,

Tên đề tài: “Ảnh hƣởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng nhân nhanh sinh
khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro”.
Ngƣời hƣớng dẫn: TS. Hà Thị Loan.
Địa điểm: đề tài đƣợc tiến hành tại phòng thí nghiệm thực nghiệm cây trồng
Trung tâm Công nghệ Sinh học quận 12 thành phố Hồ Chí Minh.
Địa chỉ: 2374 Quốc lộ 1, phƣờng Trung Mỹ Tây, quận 12 TP HCM
Đề tài gồm 5 thí nghiệm lần lƣợt khảo sát ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh
trƣởng thực vật BA, BA kết hợp nới NAA, Oligochitosan, của điều kiện nuôi cấy
ánh sáng và nhiệt độ lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh trong
nuôi cấy in vitro.
Sau 10 tuần nuôi cấy, ở thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của BA, BA và
NAA, kết quả cho thấy mẫu đƣợc nuôi cấy ở môi trƣờng MS có bổ sung 1mg/l BA
và 0,5m/l NAA (nghiệm thức đạt kết quả tốt nhất thí nghiệm 2) cho kết quả tốt hơn
so với phôi đƣợc nuôi cấy ở môi trƣờng MS chỉ bổ sung 0,5mg/l BA (nghiệm thức
đạt kết quả tốt nhất thí nghiệm 1) với Hệ số nhân sinh khối là 9,55 lần. Bên cạnh đó
đối với thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của Oligochitosan, kết quả

cho thấy

Oligochitosan không những không kích thích khả năng tăng sinh khối cho phôi sâm
Ngọc Linh mà còn ức chế khả năng sinh trƣởng phôi sâm Ngọc Linh. Ở thí nghiệm
ánh sáng, mẫu phôi sâm Ngọc Linh sinh trƣởng mạnh nhất ở điều kiện nuôi cấy
dƣới ánh đèn LED phối hợp theo tỉ lệ 60 đỏ:40 xanh. Và đồng thời qua kết quả thí
nghiệm 4 chúng tôi nhận thấy mẫu phôi sâm Ngọc Linh thích hợp sinh trƣởng trong

iii


khoảng nền nhiệt từ 190C – 230C tuy nhiên trong đề tài này nhiệt độ tốt nhất là
230C.



3.1 Địa điểm và thời gian tiến hành .......................................................................19
3.2 Vật liệu thí nghiệm ..........................................................................................19
3.2.1 Vật liệu ......................................................................................................19
3.2.2 Trang thiết bị và dụng cụ ...........................................................................20
3.2.3 Hóa chất .....................................................................................................20
3.3 Phƣơng pháp thí nghiệm ..................................................................................20
3.4 Bố trí thí nghiệm ..............................................................................................21
3.4.1 Thí nghiệm 1: ảnh hƣởng của BA lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi
sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro. .............................................................21
3.4.2 Thí nghiệm 2: ảnh hƣởng của NAA và BA lên khả năng nhân nhanh sinh
khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro. .............................................22
3.4.3 Thí nghiệm 3: ảnh hƣởng của ánh sáng lên khả năng nhân nhanh sinh khối
phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro. .....................................................23
3.4.4 Thí nghiệm 4: ảnh hƣởng của nhiệt độ lên sự nhân nhanh sinh khối phôi
sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro. .............................................................25
3.4.5 Thí nghiệm 5: ảnh hƣởng của nồng độ chitosan lên sự nhân nhanh phôi
sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro. .............................................................26
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................28
4.1 Kết quả thí nghiệm 1: ảnh hƣởng của BA lên khả năng nhân nhanh sinh khối
phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro ..........................................................28
4.2 Kết quả thí nghiệm 2: ảnh hƣởng của NAA và BA lên khả năng nhân nhanh
sinh khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro ..........................................31
4.3 Kết quả thí nghiệm 3: ảnh hƣởng của ánh sáng lên khả năng nhân nhanh sinh
khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro..................................................35
4.4 Kết quả thí nghiệm 4: ảnh hƣởng của nhiệt độ lên khả năng nhân nhanh sinh
khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro..................................................39
vi



: Murashige và Skoog (1962)

2i – P

: 2 – isopentenyladenine

Tp. Hồ Chí Minh

: Thành phố Hồ Chí Minh

KHCN

: Khoa học công nghệ

Cty TNHH

: công ty trách nhiệm hƣu hạn

viii


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ BA lên khả năng
nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh ................................................. 21
Bảng 3.2: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ BA kết hợp với
NAA lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh .................. 23
Bảng 3.3: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của ánh sáng lên khả năng nhân
nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh .......................................................... 24
Bảng 3.4: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ lên khả năng nhân



DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 2.1: Hình ảnh cây sâm Ngọc Linh........................................................................ 6
Hình 2.2: Các bộ phận của cây sâm Ngọc Linh ............................................................ 8
Hình 2.3: Axit 2,4 dicloro - phenoxiaxetic(2,4D) ......................................................... 14
Hình 2.4: Naphthalene acetic acid (NAA) .................................................................... 14
Hình 2.5: Zeatin ............................................................................................................ 14
Hình 2.6: Benzyladenine ............................................................................................... 14
Hình 2.7: GA3 ............................................................................................................... 15
Hình 3.1: Phôi sâm Ngọc Linh 2 tháng tuổi tại Trung Tâm Công Nghệ sinh học
thành phố Hồ Chí Minh ............................................................................... 19
Hình 4.1: Ảnh hƣởng của BA lên sự nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh ở
giai đoạn 4 tuần tuổi và 10 tuần ................................................................... 29
Hình 4.2: Sự thay đổi số chồi giữa các nghiệm thức thí nghiệm 1 ............................... 30
Hình 4.3: Hình ảnh số lƣợng chồi ở 4 nghiệm thức thí nghiệm 2 ................................ 32
Hình 4.4: Ảnh hƣởng của BA và NAA lên sự nhân nhanh sinh khối phôi sâm
Ngọc Linh ở giai đoạn 4 tuần tuổi và 10 tuần tuổi ...................................... 33
Hình 4.5: Ảnh hƣởng của ánh sáng lên sự nhân nhanh sinh khối phôi samm Ngọc
Linh ở giai đoạn 4 tuần tuổi và 10 tuần tuổi ................................................ 37
Hình 4.6: Sự khởi tạo lại phôi non xung quanh phôi già (thái hóa) trong thí
nghiệm ánh sang .......................................................................................... 38

xi


Hình 4.7: Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên sự nhân nhanh phôi sâm Ngọc Linh ở giai
đoạn 4 tuần tuổi và 10 tuần tuổi .................................................................... 41
Hình 4.8: Màu sắc phôi sâm Ngọc Linh của các nghiệm thức thí nghiệm ..................... 42

nguồn mẫu In vitro lớn cho các nghiên cứu sau này và cung cấp nguồn cây giống
cho Trung tâm Công nghệ Sinh học TP.HCM và thị trƣờng trong nƣớc.

1


1.2 Mục tiêu nghiên cứu
Tìm ra nồng độ chất điều hòa sinh trƣởng thực vật bổ sung và các điều kiện
môi trƣờng thích hợp (nhiệt độ, ánh sáng) cho quá trình nhân nhanh sinh khối phôi
sâm Ngọc Linh nhằm tạo ra số lƣợng lớn mẫu sâm Ngọc Linh In vitro.
1.3 Nội dung nghiên cứu
Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của BA lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi
sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro.
Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của NAA và BA lên khả năng nhân nhanh sinh
khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro.
Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của ánh sáng lên khả năng nhân nhanh sinh khối
phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro.
Thí nghiệm 4: Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên khả năng nhân nhanh sinh khối
phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro.
Thí nghiệm 5: Ảnh hƣởng của Oligochitosan lên khả năng nhân nhanh sinh
khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro.
1.4 Ý nghĩa đề tài
Thông qua đề tài nghiên cứu, có thể tìm đƣợc điều kiện nuôi cấy thích hợp
nhất cho sự nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh. Tạo điều kiện thuận lợi cho
các nghiên cứu về sâm Ngọc Linh sau này. Đồng thời góp phần nghiên cứu để sản
xuất cây giống sâm Ngọc Linh ở quy mô công nghiệp, làm nguồn nguyên liệu để
nhân sinh khối, đáp ứng nhu cầu trong nƣớc và nƣớc ngoài.
Giúp cho sinh viên hiểu và có nhiều kiến thức hơn về sâm Ngọc Linh. Tìm
hiểu và nắm rõ kiến thức về phƣơng pháp nghiên cứu khoa học, thu thập, xử lý và
phân tích số liệu. Biết cách trình bày một nghiên cứu khoa học.

Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các tế bào thực vật đã đƣợc biến đổi gen.



Tạo ra các cây trong điều kiện vô trùng, để có thể vận chuyển mà hạn chế tối
đa khả năng phát tán bệnh, sâu bệnh hoặc các nhân tố gây bệnh.



Có thể tạo ra các cây từ hạt mà nếu không có nuôi cấy mô thì thƣờng có tỷ lệ
nảy mầm thấp hoặc sinh trƣởng yếu, ví dụ: hoa lan hoặc cây nắp ấm.



Làm sạch các cây bị nhiễm virus nhất định hoặc các nhân tố lây nhiễm khác
và nhân nhanh các cây này nhƣ là nguồn nguyên liệu sạch phục vụ đồng
ruộng và nông nghiệp.
Nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa trên thực tế là rất nhiều các tế bào thực vật

có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh (còn gọi là totipotency – khả năng biệt
hóa của tế bào đơn lẻ thành những tế bào chuyên biệt với số lƣợng không giới hạn).
Các tế bào đơn lẻ, các tế bào thực vật không có thành tế bào (protoplast), các mảnh
3


lá, rễ hoặc thân, thƣờng có thể đƣợc sử dụng để tạo ra các tế bào mới trên môi
trƣờng nuôi cấy bổ sung các chất dinh dƣỡng và hormone thực vật. (Dƣơng Công
Kiên, 2003)

Nguồn ảnh: https://hoc247.net

phong cảnh và các lĩnh vực liên quan đến hoa, là thứ mà sử dụng nuôi cấy
mô phân sinh và chồi để tạo ra số lƣợng lớn các cá thể giống hệt nhau.



Bảo tồn các giống cây hiếm hoặc đang bị đe dọa.



Các nhà nhân giống có thể ƣu tiên sử dụng nuôi cây mô để sàng lọc các tế
bào hơn là sàng lọc cây trồng để tìm các tính trạng tốt, ví dụ kháng/chống
chịu thuốc diệt cỏ.



Sinh trƣởng quy mô lớn các tế bào thực vật trong môi trƣờng lỏng trong các
bioreactors để tạo ra các hợp chất có giá trị, giống nhƣ sinh tổng hợp các hợp
chất thứ cấp có nguồn gốc thực vật và protein tái tổ hợp, đƣợc sử dụng nhƣ
là dƣợc phẩm sinh học.



Lai xa các loài thực vật bằng cách bởi dung hợp protoplast và tái sinh các
phép lai mới.



Nghiên cứu nhanh cơ sở phân tử của các cơ chế sinh lý, sinh hóa và sinh sản
ở thực vật, ví dụ nhƣ chọn lọc in vitro các cây chống chịu với các điều kiện
bất lợi và các nghiên cứu quá trình ra hoa in vitro.

Có thể tạo ra các loài lai vô trùng giống hệt nhau

2.2 Tổng quan về c y s m Ngọc Linh

Hình 2.1. hình ảnh cây sâm Ngọc Linh
(Nguồn: nhansamlinhchi.net.vn)
2.2.1 Lịch sử phát hiện
Năm 1973, đoàn Điều tra dƣợc liệu Ban Dân Y khu 5 do dƣợc sỹ Đào Kim
Long và Nguyễn Châu Giang hƣớng dẫn đã phát hiện đƣợc một loài Panax mọc
thành quần thể ở độ cao 1800m tại vùng Ngọc Lây, Huyện Đắc Tô, Tỉnh KonTum
và đặt tên là “sâm đốt trúc“ với tên khoa học sơ bộ xác định là Panax articulates L.
, họ Nhân sâm (Araliaceae)

6


Trải qua hơn 30 năm sâm K5 còn gọi là sâm Ngọc Linh hay sâm Việt Nam,
một loài sâm đặc hữu của nƣớc ta đã đƣợc thế giớ biết đến với tên khoa học là
Panax vietnamenis Ha et Grushv. (Hà Thị Dụng và Grushvisky, 1985)
2.2.2 Nơi ph n bố của sâm Ngọc Linh
Cây sâm đƣợc phát hiện ở độ cao từ 1200 m trở lên,có tài liệu cho biết cao
độ tìm thấy sâm Ngọc Linh là khoảng 1500m (Cam Lu – Trƣơng Hiệu, 2003), đạt
mật độ cao nhất ở khoảng từ 1700 - 2000m dƣới tán rừng già, và cho tới nay chỉ có
hai tỉnh KonTum và Quảng Nam là có cây sâm này.
Sâm mọc tập trung dƣới chân núi Ngọc Linh, một ngọn núi cao 2578m với
lớp đất vàng đỏ trên đá Granit dày trên 50 cm, có độ mùn cao, tơi xốp và rừng
nguyên sinh còn rộng, nên đƣợc gọi là sâm Ngọc Linh
Những nghiên cứu thực địa mới nhất cho thấy sâm còn mọc cả ở núi Ngọc
Lum Heo thuộc Xã Phƣớc Lộc, Huyện Phƣớc Sơn, Tỉnh Quảng Nam, đỉnh núi
Ngọc Am thuộc Quảng Nam, Đắc Glây thuộc KonTum, núi Langbian ở Lạc Dƣơng


Hình 2.2. Các bộ phận của cây sâm Ngọc Linh
(Nguồn agi.gov.vn)

8


b) Đặc điểm sinh lí:
Mọc dƣới tán rừng ẩm, nhiều mùn, thích hợp với nhiệt độ ban ngày từ 20°C 25°C, ban đêm 15°C - 18°C, sâm Ngọc Linh có thể sống rất lâu, thậm chí trên 100
năm (Võ Tuấn, 2014, báo Lao Động), sinh trƣởng khá chậm. Bộ phận dùng làm
thuốc chủ yếu là thân rễ, củ và ngoài ra cũng có thể dùng lá và rễ con. Vào đầu
tháng 1 hàng năm, sâm xuất hiện chồi mới sau mùa ngủ đông, thân khí sinh lớn dần
lên thành cây sâm trƣởng thành có 1 tán hoa. Từ tháng 4 đến tháng 6, cây nở hoa và
kết quả. Tháng 7 bắt đầu có quả chín và kéo dài đến tháng 9. Cuối tháng 10, phần
thân khí sinh tàn lụi dần, lá rụng, để lại một vết sẹo ở đầu củ sâm và cây bắt đầu giai
đoạn ngủ đông hết tháng 12. Chính căn cứ vào vết sẹo trên đầu củ mỗi mùa đông
đến mà ngƣời ta có thể nhận biết cây sâm bao nhiêu tuổi, phải ít nhất 3 năm tuổi tức
trên củ có một sẹo (sau 3 năm đầu sâm chỉ rụng một lá) mới có thể khai thác,
khuyến cáo là trên 5 năm tuổi. Mùa đông cũng là mùa thu hoạch tốt nhất phần thân
rễ của sâm (Cam Lu – Trƣơng Hiệu, 2003).
d)Dƣợc tính
Theo tiến sĩ Nguyễn Bá Hoạt cán bộ Viện Dƣợc liệu thì về mặt hoá học, thân
rễ và rễ củ sâm Ngọc Linh hiện nay (2007) đã phân lập đƣợc 52 saponin trong đó 26
sanopin thƣờng thấy ở sâm Triều Tiên, sâm Mỹ, sâm Nhật. Trong lá và cọng đã
phân lập đƣợc 19 saponin pammaran, trong đó có 8 saponin có cấu trúc mới. Đã xác
định đƣợc trong sâm Ngọc Linh 17 axít amin, 20 chất khoáng vi lƣợng và hàm
lƣợng tinh dầu là 0,1% ( Võ Tuấn, 2014, báo Lao Động)
2.2.4 Tình hình nghiên cứu sâm ngọc linh
Hiện tại cả nƣớc cả nƣớc có 4 địa điểm nghiên cứu và sản xuất sâm Ngọc
Linh chính đó là KonTum, Quảng Nam, Đà Lạt và Trung Tâm Công Nghệ Sinh

thực phẩm chức năng, mỹ phẩm và y dƣợc; và điều kiện nuôi không chịu sự chi
phối của môi trƣờng bên ngoài. (Nguyễn Hữu Hổ, 2014)
Nghiên cứu tạo và nuôi nhân mô sẹo có khả năng sinh phôi soma từ mô sẹo
lá trong môi trƣờng lỏng; tạo mô phôi soma từ mô sẹo có khả năng sinh phôi, sự
phát sinh hình thái chồi/rễ của mô phôi soma trong nuôi cấy và nuôi nhân phôi

10


soma sâm Ngọc Linh trong môi trƣờng lỏng tạo kết quả tiền đề cho nghiên cứu
nhân sinh khối quy mô lớn hai loại mô có khả năng sản sinh hàm lƣợng hợp chất
thứ cấp cao do chúng đã mang ít nhiều trạng thái biệt hóa. (Nguyễn Hữu Hổ, 2014)
Tại Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học thành phố Hồ Chí Minh nhóm nghiên
cứu Hà Thị Loan đã nghiên cứu thành công đề tài “nghiên cứu tạo rễ tóc sâm ngọc
linh Panax vietnamensis bằng phương pháp chuyển gen rol nhờ vi khuẩn
agrobacterium rhizogenes”. Vì sâm Ngọc Linh có hàm lƣợng saponin trong thân rễ
cao hơn so với những loài sâm cùng chi Panax. Biến nạp gen nhằm thay đổi thông
tin di truyền giúp cải thiện tạo đƣợc những hoạt chất sinh học có giá trị, đặc biệt là
dùng vi khuẩn đất Agrobacterium rhizogenes chứa gen rol cảm ứng tạo rễ tóc. (Tạp
chí sinh học, 2014)
GS.TS Dƣơng Tấn Nhựt tạo mô sẹo sâm Ngọc Linh bằng cách lấy mảnh lá
(0,5 x 0,5 cm) đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng tạo mô sẹo MS có 2 mg/l 2,4-D. Mô
sẹo đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng MS + 1 mg/l 2,4-D + 1 mg/l NAA + 0,2 mg/l
kinetin + 10% nƣớc dừa để tạo mô sẹo có khả năng sinh phôi và môi trƣờng MS½ +
0,2 mg/l 2,4-D + 10% nƣớc dừa để tạo mô phôi. Mô sẹo có khả năng sinh phôi tăng
nhanh sinh khối qua nuôi cấy trong môi trƣờng lỏng MS + 0,5 mg/l 2,4-D + 0,5
mg/l NAA. Mô phôi có khả năng tăng sinh nhanh trong môi trƣờng lỏng MS½ + 0,2
mg/l NAA + 0,2 mg/l BA. Tùy môi trƣờng nuôi cấy ban đầu và ở các giai đoạn tiếp
theo, mô phôi phát triển theo hƣớng tạo chồi hoặc rễ tạo quần thể chồi hoặc rễ.
(Dƣơng Tấn Nhựt, 2012)