TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
======

ĐÀO THỊ PHƯƠNG THẢO

NGHIÊN CỨU SỰ HẤP THỤ THUỐC BERBERINE
HYDROCHLORIDE CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE TẠO RA
TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY
TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC VO GẠO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

HÀ NỘI, 2019


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
======

ĐÀO THỊ PHƯƠNG THẢO

NGHIÊN CỨU SỰ HẤP THỤ THUỐC BERBERINE
HYDROCHLORIDE CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE TẠO RA
TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY
TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC VO GẠO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật


berberine

hydrochloride

của

vật

liệu

cellulose

tạo

ra

từ

Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo” do
chính tôi thực hiện và dưới sự hướng dẫn trực tiếp của TS. Nguyễn Xuân
Thành. Tất cả các số liệu trong khóa luận thu được đều được thu thập từ thực
nghiệm, qua xử lý thống kê, không có số liệu bịa đặt. Tất cả những trích dẫn,
nguồn tài liệu trong khóa luận được lấy từ những công bố chính thức và có
ghi chú rõ ràng trong phần tài liệu tham khảo. Các số liệu và kết quả nghiên
cứu trong khóa luận này là trung thực, chưa từng công bố dưới bất kì hình
thức nào trước đây và không trùng lặp với công trình nghiên cứu của tác giả
khác.
Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019
Sinh viên


Vòng/phút

c.s

cộng sự

ĐHSP

Đại học Sư phạm


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU............................................................................................................ 1
1. Lý do chọn đề tài............................................................................................ 1
2. Mục đích của nghiên cứu................................................................................2
3. Nội dung nghiên cứu...................................................................................... 3
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn........................................................................3
NỘI DUNG.........................................................................................................4
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................ 4
1.1. Giới thiệu tổng quan về đối tượng, lĩnh vực nghiên cứu............................ 4
1.1.1. Cellulose vi khuẩn (CVK).........................................................................4
1.1.2. Thuốc berberine hydrochloride................................................................5
1.2. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước................................8
1.2.1. Tình hình nghiên cứu màng Cellulose vi khuẩn.......................................8
1.2.2. Tình hình nghiên cứu về thuốc berberine hydrochloride...................... 10
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......12
2.1. Vật liệu nghiên cứu....................................................................................12
2.1.1. Hóa chất và dung môi được sử dụng trong nghiên cứu........................ 12
2.1.2. Thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu................................................ 12

Bảng 3.4. Lượng thuốc hấp thụ berberine hydrochloride qua màng CVK
ở TH2: 1,5h (n = 3).................................................................................. 24
Bảng 3.5. Lượng thuốc hấp thụ berberine hydrochloride qua màng CVK
ở TH3: 2h (n = 3)..................................................................................... 25


DANH MỤC HÌNH
Hình 3.1. Màng cellulose vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường nước vo
gạo.....................................................................................................................18
Hình 3.2. Màng CVK tinh khiết.......................................................................19
Hình 3.3. Thí nghiệm kiểm tra độ tinh sạch của màng....................................20
Hình 3.4. Màng CVK tinh khiết d = 1,5cm..................................................... 20
Hình 3.5. Màng CVK đang hấp thụ thuốc....................................................... 21
Hình 3.6. Phương trình đường chuẩn của thuốc berberine hydrochloride...... 22
Hình 3.7. Hiệu suất hấp thụ thuốc berberine hydrochloride............................26


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Thuốc berberine hydrochloride (BH) là 1 loại thuốc phổ biến, quen
thuộc đối với mọi gia đình. Berberine hydrochloride là loại hoạt chất được
chiết xuất từ cây hoàng đằng (còn có tên vàng đắng, hoàng liên, tên khoa học
là Coptis teeta),… chứa chủ yếu ở trong thân và rễ cây với tỷ lệ 1,5-3%.
Berberine hydrochloride có tác dụng như chất kháng khuẩn tự nhiên
trong việc điều trị các bệnh như tiêu chảy do vi khuẩn gây ra, ký sinh trùng
đường ruột, viêm đường tiêu hóa do vi khuẩn tả, amip đường ruột. Berberine
hydrochloride còn được bào chế thành thuốc nhỏ mắt điều trị các bệnh viêm
kết mạc, đau mắt đỏ do kích thích bên ngoài (gió, nắng, lạnh, bụi, khói...) và
điều trị bệnh mắt hột. Ngoài ra, BH còn có tác dụng tốt trong việc điều trị một
số bệnh mãn tính như tiểu đường, viêm khớp, hạ lipid, choresterol máu, đặc

Nhờ những đặc tính ưu việt nêu trên mà CVK có thể giúp thuốc tăng
hiệu quả, rút ngắn thời gian chữa bệnh, tăng khả năng phân phối thuốc có
kiểm soát, tăng thời gian tồn tại của thuốc trong đường ruột. Từ đó chúng
giúp tăng cường khả dụng sinh học qua đường uống hoặc qua da. Với mục
đích nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc của màng CVK để khắc phục những
tác dụng phụ của thuốc, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu khả năng hấp
thụ thuốc berberine hydrochloride của vật liệu cellulose tạo ra từ
Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo”.
2. Mục đích của nghiên cứu
Thiết kế hệ thống nạp thuốc berberine hydrochloride vào màng CVK
trong một số trường hợp khác nhau về độ dày màng, nhiệt độ.

2


Khảo sát khả năng hấp thụ thuốc berberine hydrochloride của vật liệu
cellulose tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong môi trường nước
vo gạo.
3. Nội dung nghiên cứu
- Tạo màng cellulose từ Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong môi
trường nước vo gạo.
- Xử lý vật liệu CVK trước khi cho hấp thụ thuốc, xác định lượng CVK
tạo thành, thử độ tinh khiết của vật liệu CVK.
- Nạp thuốc berberine hydrochloride vào vật liệu CVK trong một số
trường hợp khác nhau về độ dày màng (0,3cm và 0,5cm), thời gian hấp thụ
thuốc (1h; 1,5h; 2h), từ đó so sánh lượng thuốc hấp thụ trong mỗi trường hợp.
- Đánh giá khả năng hấp thụ thuốc berberine hydrochloride vào vật liệu
CVK.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
*Ý nghĩa khoa học:


Azotobacter, Escherichia, Gluconacetobacter, Pseudomonas, Salmonella,
Sarcina và Zoogloea.
Hiện nay, họ Acetobacteriaceae có 10 chi, trong đó Gluconacetobacter
là chi duy nhất có khả năng tổng hợp cellulose [24].
Cellulose vi khuẩn là sản phẩm của một số loài vi khuẩn. CVK cấu tạo
bởi những chuỗi polyme β-1,4glucopyranose không phân nhánh. Các nghiên
cứu sinh học phân tử đã chỉ ra cấu trúc hóa học cơ bản của CVK giống
cellulose của thực vật, tuy nhiên chúng khác nhau về cấu trúc cao phân tử và
các đặc tính [4].
Ưu điểm của màng CVK: độ tinh khiết cao, độ bền dai cơ học lớn, khả
năng thấm hút nước cao, có thể bị thủy phân bởi enzyme,...
CVK có độ bền cơ học, hóa học cao và có khả năng cản vi khuẩn. Với
tính chất này màng CVK đã được chế tạo làm màng lọc cản khuẩn. Khả năng
hút nước của CVK lớn hơn rất nhiều so với cellulose thực vật (so sánh với sợi
bông, cao hơn gần 200 lần).
Cellulose vi khuẩn có cấu trúc siêu mịn, đường kính sợi rất nhỏ bằng
1/100 đường kính của sợi cellulose thực vật. So sánh đường kính của sợi
CVK với đường kính của các sợi nhân tạo khác cho thấy kích thước của sợi
cellulose vi khuẩn còn nhỏ hơn cả kích thước của sợi tổng hợp hóa học nhỏ
nhất. Điều này tạo điều kiện cho việc hấp thụ các chất của màng CVK .
4


Vì những đặc tính ưu việt trên, hiện nay việc nghiên cứu màng CVK trên
thế giới và Việt Nam đang rất được coi trọng. CVK được xem như là nguồn
nguyên liệu mới có tiềm năng ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực khác nhau
như công nghiệp thực phẩm, công nghệ sinh học, công nghệ sản xuất pin,…
Đặc biệt trong lĩnh vực y học, màng CVK đã được nghiên cứu ứng dụng làm
màng trị bỏng, mặt nạ dưỡng da, mạch máu nhân tạo ... và được chú trọng

b, Tác dụng dược lý và ứng dụng
Berberine hydrochloride có tác dụng kháng khuẩn được dùng để điều
trị trong các bệnh rối loạn đường tiêu hóa do vi khuẩn gây nên. Berberine
hydrochloride còn ứng dụng trong bào chế thành thuốc nhỏ mắt điều trị viêm
kết mạc, đau mắt đỏ do kích thích bên ngoài (gió, nắng, lạnh, bụi, khói...) và
điều trị bệnh đau mắt hột. Các nghiên cứu cho thấy BH có tác dụng tốt trong
việc điều trị một số bệnh mãn tính như tiểu đường, viêm khớp, hạ lipid,
choresterol máu, đặc biệt là bệnh viêm đại tràng [2].
Các nghiên cứu gần đây đã xác định BH có tác dụng chống lại nhiều
loại vi khuẩn gram dương (nhuộm theo phương pháp nhuộm gram bắt màu
tím), gram âm (nhuộm gram bắt màu đỏ), các vi khuẩn kháng acid và có khả
năng chống lại một số nấm men gây bệnh. Đặc biệt, BH dùng điều trị các
6


bệnh nhiễm khuẩn đường ruột sẽ không làm ảnh hưởng tới sự phát triển của
hệ vi khuẩn có ích ở đường ruột. Khi dùng một số loại kháng sinh đường ruột
phối hợp với BH sẽ hạn chế được tác dụng phụ gây ra bởi các thuốc kháng
sinh đối với hệ vi sinh vật đường ruột.
Berberine hydrochloride có tác dụng bài tiết ion trong lòng ruột, ức
chế co cơ, giảm cholesterol và trygycerid, chống tiểu đường, ức chế cơn nhịp
nhanh thất, giảm viêm cho người bị viêm khớp, tăng tiểu cầu của bệnh nhân
xuất huyết, giảm tiểu cầu tiên phát và thứ phát, kích thích sự bài tiết mật và
thải trừ bilirubin [18].
Ngoài ra, berberine hydrochloride với liều nhỏ có tác dụng kích thích
tim, làm giãn động mạch vành, với liều lượng lớn ức chế hô hấp làm tê liệt
trung khu hô hấp trong khi tim vẫn đập. Cùng với đó là tác dụng hạ nhiệt, gây
tê, lợi mật, kháng lợi niệu, đối với đường huyết lúc đầu có tác dụng tăng cao
và sau đó thì hạ.[2].
Tuyệt vời hơn nữa là tác dụng chống ung thư của BH. Nó có khả năng

- Tác giả Brown (1989), dùng màng CVK làm môi trường phân tách
cho quá trình xử lý nước, dùng làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng
lượng cho tế bào[10].
- Brown (1989), Jonas và Farad, 1998, dùng màng như là một chất để
biến đổi độ nhớt, để làm ra các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất
trong sinh học, thực phẩm [10].
- Các tác giả Hamlyn và cs (1997), Cienchanska (2004), Legeza và cs
(2004), Wan và Milon (2005), Czaja và cs (2006) sử dụng màng đắp lên các
vết thương hở, vết bỏng đã thu được kết quả tốt [24].
8


- Các tác giả Jonas và Farad (1998) [20], Czafa và cộng sự (2006) đã
dùng màng CVK làm da nhân tạo, làm mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ.
- Amin et al. [17] đã báo cáo việc sử dụng màng CVK làm màng bọc
cho paracetamol bằng cách sử dụng kĩ thuật phun phủ.
*Ở Việt Nam
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng CVK đã và đang
được quan tâm và chú trọng gần đây, bước đầu đã đạt được những kết quả
nhất định.
- Từ năm 2000 nhóm nghiên cứu các tác giả Nguyễn Văn Thanh và
cộng sự đã có một số công trình nghiên cứu về màng CVK thu được là cơ sở
để chế tạo màng sinh học dùng trong trị bỏng ở Việt Nam [4].
- Năm 2006, Nguyễn Văn Thanh và cs [4] đã tiến hành nuôi cấy, tinh
chế và thu màng CVK từ A. xylium đạt hiệu quả cao.
- Năm 2012, Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Trần Như
Quỳnh [8] đã công bố công trình nghiên cứu “Nghiên cứu vi khuẩn
Acetobacter xylinum tạo màng Bacterial cellulose ứng dụng trong điều trị
bỏng”, kết quả cho thấy màng CVK tạo bởi A. xylinum BNH2 tổng hợp có sợi
cellulose nhỏ, dai, độ bền kéo, độ thấu khí cao, độ hút nước tốt có triển vọng

- W. Chen và cộng sự đã nghiên cứu biện pháp nâng cao hiệu quả của
chitosan và chitosan hydrochloride trên hấp thụ đường ruột của berberine ở
chuột [26].
 Ở Việt Nam:
Đã có một số công trình nghiên cứu về thuốc berberine
hydrochloride ở Việt Nam như:
- Nguyễn Thị Thùy, Vũ Bình Dương, Nguyễn Trang Điệp, Hoàng Văn
Lương đã có công trình nghiên cứu bào chế viên nén Berberine giải phóng tại
đích đại tràng [15].
10


- Phạm Viết Trang, Nguyễn Liêm đã có nghiên cứu góp phần nghiên
cứu cải tiến quy trình chiết suất berberine từ cây vàng đắng [16].
- Đinh Thị Liên, Vũ Thanh Thảo, Trần Cát Đông, Trần Thành Đạo đã
khảo sát tác động kháng Staphylococcus aureus của phối hợp berberin và
kháng sinh β-lactam [6].
- Nguyễn Hoài Nam, Võ Phùng Nguyên, Trần Hùng đã nghiên cứu tác
động của berberin và palmatin trên trí nhớ hình ảnh và không gian của chuột
nhắt [9].
- Hồ Cảnh Hậu, Hoàng Văn Thêm, Nguyễn Thị Lan Hương, Nguyễn
Văn Thuận, Nguyễn Cẩm Vân, Nguyễn Tuấn Quang đã nghiên cứu định
lượng berberin trong “viên nén đại tràng 105” bằng phương pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao [2].
- Cao Bá Cường, Nguyễn Xuân Thành đã nghiên cứu khả năng hấp
thụ thuốc berberin của một số màng bacterial cellulose lên men từ vi khuẩn
Acetobacter xylinum [14].
- Nguyễn Liêm – chiết xuất berberin bằng áp lực nóng [3].
- Phạm Viết Trang, Nguyễn Liêm – góp phần nghiên cứu cải tiến quy
trình sản xuất berberin từ cây vàng đắng [3].


Nhật Bản

Viện NCKH&ƯD
Trường ĐHSP Hà Nội 2

Shimadru - Nhật Bản

Viện NCKH&ƯD
Trường ĐHSP Hà Nội 2

Sartorius - Thụy Sỹ

Viện NCKH&ƯD
Trường ĐHSP Hà Nội 2

Haraeus

Viện NCKH&ƯD
Trường ĐHSP Hà Nội 2

Binder - Đức

Viện NCKH&ƯD
Trường ĐHSP Hà Nội 2

12


Dụng cụ:

0,3g

Amoni sulfat

0,5g

Nước vo gạo

1000ml

Dịch giống

10%

Bước 2: Hấp khử trùng môi trường ở 113oC trong 15 phút sau đó môi
trường được khử trùng bằng tia UV trong 15 phút rồi để nguội môi trường.
13


Bước 3: Thêm dịch giống vào môi trường với lượng tối thiểu bằng 10%
thể tích môi trường, lắc đều tay cho giống phân bố đều trong dung dịch.. Đo
pH của môi trường và hiệu chỉnh = 4-6, pH thấp sẽ tránh bị nhiễm những vi
khuẩn khác .
Bước 4: Dùng gạc vô trùng bịt miệng bình, ủ tĩnh trong 6-14 ngày ở
26o
Bước 5: Thu màng CVK thô có độ dày 0,3cm – 0,7cm từ dịch nuôi cấy
tĩnh gluconacetobacter xylinum. Màng thô được tạo thành có tính chất dai,
nhẵn; màng có màu vàng ngà. Sau khi thu được màng CVK thô tiếp tục xử lí
màng thô để thu được màng CVK tinh khiết.
* Tạo màng CVK tinh khiết

Chuẩn bị 6 bình dung dịch thuốc berberine hydrochloride ở các nồng
độ (mg/ml) khác nhau là: 5%; 10%; 20%; 30%; 40%; 50%.
Sử dụng máy đo quang phổ UV-Vis để đo cường độ quang phổ của các
dung dịch đã pha ở bước sóng 345nm.
Dựa vào số liệu thu được xây dựng đồ thị đường chuẩn và lập phương
trình đường chuẩn berberine hydrochloride.
Lặp lại thí nghiệm 3 lần rồi lấy kết quả trung bình.
Xây dựng kết quả trung bình giá trị OD 345nm của các nồng độ thuốc
khác nhau dưới dạng bảng bằng phần mềm Excel và dưới dạng đồ thị đường
chuẩn.
2.2.3. Phương pháp xác định lượng thuốc được hấp thụ vào màng CVK
Tiến hành cắt các màng CVK có đường kính 1,5cm với độ dày (0.3cm
và 0.5cm) sao cho tương đối đều nhau.
15


Trong các môi trường ta lấy 2 mẫu màng CVK đã loại bỏ nước vào 6
bình có chứa 100ml dung dịch berberine hydrochloride 10%.
Bảng 2.3. Các trường hợp hấp thụ thuốc berberine hydrochloride
Trường hợp

Đường kính

Độ dày

màng CVK

màng CVK

D=1,5cm

D=1,5cm
TH3
TH4
D=1,5cm
TH5
TH6
Sau thời gian đã lên kế hoạch (1h; 1,5h; 2h) tiến hành rút mẫu ra rồi đo
quang phổ bằng máy UV-2450 để xác định lượng thuốc còn lại trong dung
dịch tại thời điểm lấy mẫu, từ đó xác định được lượng thuốc hấp thụ vào các
màng CVK theo công thức (1):
mhấp thụ = mtrước - msau

(1)

Trong đó :
mtrước: khối lượng thuốc trước khi hấp thụ vào màng CVK (mg);
16