TIÊU CHUẨN QUỐC GIA
TCVN 5273:2010
BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN BỆNH DỊCH TẢ LỢN
Animal disease - Diagnostic procedure for classical swine fever disease
Lời nói đầu
TCVN 5273:2010 thay thế TCVN 5273:1990;
TCVN 5273:2010 do Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đề nghị, Tổng cục
đo lường chất lượng thẩm định, Bộ khoa học và Công nghệ công bố.
BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN BỆNH DỊCH TẢ LỢN
Animal disease - Diagnostic procedure for classical swine fever disease
CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao
tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên
quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an
toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử
dụng tiêu chuẩn.
1. Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh dịch tả lợn.
2. Thuật ngữ và định nghĩa
Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau:
Bệnh dịch tả lợn (diagnostic procedure for classical swine fever disease)
Bệnh truyền nhiễm gây ra bởi một loại virus cấu trúc ARN thuộc giống Pestivirus, họ Flaviridae. Virus
dịch tả lợn chỉ có một serotyp duy nhất. Bệnh chỉ xảy ra ở loài lợn các mức độ khác nhau tùy thuộc
vào độc lực virus, tuổi động vật mẫn cảm và thời gian nhiễm bệnh. Lợn có thể bị mắc bệnh ở mọi lứa
tuổi.
3. Thuốc thử và vật liệu thử
Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hai lần đã khử ion hoặc nước có
độ tinh khiết tương đương không có Rnase, trừ khi có quy định khác.
- Axeton đậm đặc.
- Metanol
- Natri clorua (NaCI).
- Natri phosphat (Na2HPO4).

- Máy khuấy từ.
- Kính hiển vi đảo ngược (dùng soi tế bào).
- Máy đọc ELISA.
- Máy Realtime RT-PCR.
- Hệ thống chiết tách.
- Bộ đồ mổ tiểu gia súc.
- Ống nghiệm vô trùng, dung tích 10 ml.
- Giá đựng ống nghiệm.
- Ống effendorf chắt huyết thanh.
- Ống effendorf, dung tích 0,2 ml.
- Pipet khắc độ 1 ml, 5 ml, 10 ml.
- Bơm tiêm loại 5 ml và kim tiêm 22G.
- Lọ đựng bệnh phẩm, dung tích 20 ml.
- Bộ cối chày sứ.
- Panh, kéo cắt tổ chức bệnh phẩm.
- Đèn cồn hoặc đèn ga.
- Hộp nhuộm tiêu bản.
- Hộp giữ ẩm cho lam kính.
- Bình nón, dung tích 1 lít.
- Giấy nhôm bao gói.
- Bộ micropipet và đầu hút.
- Khay chứa các dung dịch làm ELISA.
- Bông cồn.
- Ống Leighton.
- Lọ nuôi tế bào loại T25, T75.
- Đĩa nuôi tế bào loại 6 giếng.
- Lam kính.
- Giấy dán nhãn.
5. Cách tiến hành
5.1. Chẩn đoán lâm sàng

- Thể mãn tính
Nếu thể cấp tính kéo dài con vật chuyển sang thể mãn tính. Con vật gầy còm lúc đi táo lúc ỉa chảy, ho
khó thở, da lưng sườn có những vết đỏ có khi loét ra từng mảng.
Bệnh tiến triển từ 1 tháng đến 2 tháng lợn chết do kiệt sức hoặc có thể khỏi nhưng gầy còm khó vỗ
béo. Những con khỏi bệnh có thể miễn dịch nhưng nó là nguồn gieo rắc virus.
5.1.3. Giải phẫu bệnh học
- Thể quá cấp tính
Bệnh tích không rõ, chỉ thấy niêm mạc viêm đỏ, thận xuất huyết, vùng vỏ hạch lâm ba sưng đỏ.
- Thể cấp tính
Có nhiều điểm xuất huyết ở niêm mạc, niêm mạc miệng lở viêm xuất huyết, có khi có mụn loét nông
hay sâu, phủ chất bựa màu vàng trắng. Niêm mạc dạ dày sưng màu đỏ gạch, niêm mạc ruột nhất là
van hồi manh tràng có những nốt loét, hạch lâm ba sưng tụ máu có màu đỏ sẫm.
Lách không sưng hoặc ít sưng nhưng có hiện tượng nhồi huyết, xuất huyết ở viền lách.
Thận xuất huyết ở lớp vỏ. Phổi viêm tụ máu có nhiều vùng bị gan hóa, hoại tử cứng lại.
Màng phổi có những chỗ chấm đỏ xuất huyết.
- Thể mãn tính
Ruột viêm có mụn loét tròn. Có khi thấy thành ruột già dày cứng lên, niêm mạc trở nên sần sùi. Phổi
dính vào lồng ngực bằng tổ chức liên kết chứa những cục hoại tử có vỏ liên kết cứng.
5.2. Chẩn đoán phòng thí nghiệm
5.2.1. Lấy mẫu
- Bệnh phẩm: Hạch amidan, hạch lympho, lách, thận, van hồi manh tràng, máu (huyết thanh). Mẫu
bệnh phẩm được lấy ngay sau khi mổ khám.
- Bảo quản mẫu bệnh phẩm ở nhiệt độ 2 °C đến 8 °C và gửi ngay đến phòng thí nghiệm trong 24h,
nếu quá thời gian đó, bệnh phẩm phải được bảo quản ở nhiệt độ đông băng. Huyết thanh hoặc huyết
tương bảo quản ở nhiệt độ từ 4 °C đến 8 °C tối đa trong 7 ngày. Lưu mẫu bệnh phẩm ở nhiệt độ -20
°C đến -80 °C.
5.2.2. Phát hiện kháng nguyên


5.2.2.1. Xử lý bệnh phẩm

Để tiêu bản khô tự nhiên
Nếu không có máy cắt lạnh thì dùng phương pháp in tổ chức: dùng dao sắc mỏng cắt dứt khoát một
nhát trên miếng tổ chức (amiđan, lách...) dùng panh nhọn gắp miếng tổ chức thấm trên giấy lọc cho
đến hết máu, ấn nhẹ mặt cắt tổ chức lên phiến kính, dùng bút đánh dấu, để khô tự nhiên.
5.2.3.2. Chuẩn bị mẫu thử trên môi trường tế bào
- Bệnh phẩm là gan, nghiền trong chày cối, xử lý bằng dung dịch kháng sinh, pha với môi trường tế
bào thành dịch huyền phù 10-1 ly tâm 2000 r/min trong 15 min lấy nước nổi.
- Cấy mẫu bệnh phẩm lên tế bào thận lợn đã chuẩn bị sẵn trong ống nghiệm laighton có lá kính, mỗi
mẫu bệnh phẩm cấy 2 ống đến 4 ống.
Sau khi cấy bệnh phẩm 24h đến 48 h, lấy lá kính ra, để khô tự nhiên và chờ tiến hành các bước sau.
CHÚ Ý: Khi cấy bệnh phẩm lên tế bào cần có 2 ống đối chứng tế bào khỏe, 2 ống đối chứng nhiễm
virus dịch tả lợn. Đánh dấu các ống tế bào.
2.2.3.3. Cố định tiêu bản
Các tiêu bản đã được chuẩn bị ở 5.2.3.1 sau khi đã đánh dấu đem cố định bằng axeton.
Các lam kính đã chuẩn bị ở trên đặt vào cốc nhuộm, đổ axeton vào. Các lá kính chuẩn bị ở 5.2.3.2 thì
để nguyên trong ống Leighton đổ bỏ môi trường đi, cho axeton vào cố định, để ở -20 °C trong một giờ
hoặc ở nhiệt độ phòng trong 30 min. Sau đó nhấc tiêu bản ra để khô tự nhiên. Axeton được đổ vào
bình sạch tái sử dụng cho việc khác.
5.2.3.4. Nhuộm mẫu thử
Dùng chất gắn kết đã pha loãng ở nồng độ sử dụng nhỏ lên các phiến kính hoặc lá kính đã gắn bệnh
phẩm sao cho thuốc nhuộm phủ kín tổ chức. Đặt các phiến kính, lá kính này vào khay ấm (giữ cho bề
mặt luôn ướt trong suốt quá trình nhuộm) để vào tủ ấm 37 °C trong 30 min.


Rửa bỏ chất gắn kết
Sau khi lấy ở tủ ấm ra, đổ bỏ chất gắn kết đi, dùng bình có vòi bơm nhẹ dung dịch đệm (PBS) pH =
7,2 vào tiêu bản cho sạch chất gắn kết, đặt tiêu bản vào cốc có rãnh, đổ ngập PBS vào ngâm rửa 2
lần đến 3 lần, mỗi lần thay PBS vào ngâm 5 min. Sau lần cuối cùng tráng lại bằng Nước cất hai lần.
Đặt nghiêng tiêu bản trên giấy lọc hoặc thấm nhẹ cho khô
Nhỏ một giọt dung dịch đệm glyxerin lên phiến kính tiêu bản rồi đậy lá kính lên hoặc nhỏ 1 giọt dung


Không

Không có virus dịch tả lợn

5.2.4. Phương pháp miễn dịch huỳnh quang gián tiếp
5.2.4.1. Chuẩn bị mẫu, xem 5.2.3.1.
5.2.4.2. Cố định tiêu bản, xem 5.2.3.3.
5.2.4.3. Gắn kháng huyết thanh dịch tả lợn lên tiêu bản
Nhỏ từ 0,1 ml đến 0,2 ml kháng thể dịch tả lợn lên mỗi tiêu bản đặt trong khay ấm để ở nhiệt độ 37 °C
trong 30 min (tiêu bản luôn luôn ướt trong suốt quá trình ủ).
Đổ bỏ huyết thanh, dùng bình có vòi bơm nhẹ dung dịch đệm (PBS) lên phiến kính tiêu bản trong cốc
dung dịch đệm 10 min, thay PBS nhiều lần và liên tục lắc nhẹ phiến kính.
Lấy ra để tiêu bản khô, nhỏ chất gắn kết globulin thỏ kháng lợn lên các tiêu bản, đặt vào khay ẩm ở
37 °C trong 30 min.
Sau đó thực hiện các bước như 5.2.3.4.
5.2.4.4. Đọc kết quả
- Tiêu bản kháng nguyên dương tính gắn với chất gắn kết: Kết quả (+)
- Tiêu bản tổ chức khỏe gắn chất gắn kết: kết quả (-)
- Tiêu bản bệnh phẩm cần kiểm tra nhỏ globulin miễn dịch không gắn FITC sau đó nhỏ tiếp chất gắn
kết: kết quả đọc huỳnh quang giảm nhiều
- Đọc kết quả theo Bảng 1.
5.2.5. Phương pháp tiêm truyền qua thỏ
5.2.5.1. Chuẩn bị mẫu
Chọn 6 thỏ mạnh khỏe từ 1,8 kg/con đến 2 kg/con. Chia thỏ làm 2 lô:
- Lô 1: tiêm dịch huyết phù bệnh phẩm nghi dịch tả lợn (máu của lợn bệnh đã khử fibrin hoặc hạch
lách lợn bệnh pha loãng 10-1 đã xử lý kháng sinh) 1 ml vào tĩnh mạch tai 3 thỏ. Theo dõi nhiệt độ ngày
2 lần trong 7 ngày (thỏ phải không sốt).
- Lô 2: sau 7 ngày lấy thêm 3 thỏ mạnh khỏe lô 2 cùng với 3 thỏ lô 1 được tiêm thử thách bằng vắc


PHỤ LỤC A
(Quy định)
Chuẩn bị dung dịch để chẩn đoán bệnh dịch tả lợn
A.1. Dung dịch Glutamin/kháng sinh đậm đặc 100 lần (100x)
- Dung dịch A:

Glutamin

2,92 g

Nước cất hai lần

50 ml

Hòa tan các thành phần trên rồi lọc qua lưới lọc cỡ lỗ 0,45 m.
- Dung dịch B: Penicillin

1.000.000 U

Steptomycin

1g

Mycostatin

500.000 U

Polymixin

150.000 U

A.4. Pha dung dịch Trypsin 5 % (10x)
Trypsin 1:250

5g

Nước cất hai lần

100 ml.

Khuấy bằng que khuấy từ, để qua đêm ở 4 °C. Lọc qua màng lọc cỡ lỗ 0,45 m. Bảo quản ở âm 20
°C.
A.5. Dung dịch muối đệm phosphat (PBS) pH 7,2
NaCl

8,5 g

Na2HPO4

1,07 g

NaH2PO4

0,39 g

Nước cất hai lần

1 000 ml

Hòa tan các thành phần trên. Chỉnh pH đến 7,2 bằng NaOH 1 N và HCl 1 N, hấp vô trùng 121 °C
trong 30 min.

Qiagen RT-PCR kit
Nguyên liệu

Invitrogen SS3 qRT-PCR kit
Lượng

Nguyên liệu

l

Lượng
l

DW

10,5

DW

5,5

Hỗn hợp đệm phản ứng 5x

5,0

Dung dịch đệm phản ứng 2x

1,5

MgCI2 (25 mM)

Đặt ống PCR (hoặc ống Smart) vào máy real-time PCR;
Chọn chương trình chạy;
Chọn màu đọc (tùy theo probe);
Lựa chọn các giếng cần chạy;
Chạy phản ứng:
Qiagen one-step RT-PCR Kit

Invitrogen SS3 qRT-PCR Kit

RT

PCR

RT

PCR

50 °C-30 min,
95 °C-15 min

40 x (95 °C-10s + 60 °C-50s)

50 °C-15 min,
95 °C-2 min

40 x (95 °C-10 s + 6 0°C-50 s)

B.2. Đọc kết quả
- Mẫu được coi là dương tính khi có Ct


TCAACTCCATGTGCCATGTAC

None

None

Probe

PHỤ LỤC C
(Quy định)
Phản ứng trung hòa kháng thể dịch tả lợn trên môi trường tế bào
C.1. Chuẩn bị
Pha loãng huyết thanh cần chẩn đoán với môi trường MEM có chứa 5 % huyết thanh thai bê (không
có kháng thể bệnh dịch tả lợn vì kháng thể này có thể trung hòa với virus dịch tả lợn).
Cho một lượng không đổi virus dịch tả lợn (100 TCID50) vào tất cả các giếng (trừ giếng đối chứng).
Cho tế bào PK15 hoặc CPK hoặc SK6 vào tất cả các giếng.
Ủ đĩa 2 ngày đến 3 ngày ở 37 °C. Kháng nguyên virus được phát hiện bằng phương pháp nhuộm
miễn dịch.
Chuẩn bị nguyên liệu:
- Kháng thể 1: Pig polyclonal antibody pha loãng 1/200 trong dung dịch PBS pH = 7,2.
- Kháng thể 2: Anti-pig IgG peroxidase conjugate (DAKO P0164) pha loãng 1/600 trong dung dịch
PBS pH = 7,2 .(nếu sử dụng chất gắn kết khác cần chuẩn độ lại).
C.2. Tiến hành phản ứng
C.2.1. Chuẩn bị virus cho phản ứng NPLA
Chuẩn bị tế bào PK15 hoặc CPK hoặc SK6 vào chai nuôi cấy với lượng 5 x 104 tế bào/ml trong 15 ml
môi trường (EMEM 5 % FCS). Ủ đĩa ở 37 °C/CO2 trong 24 h.
Nhiễm virus (100TCID50) vào chai.
Ủ đĩa ở 37 °C trong 3 ngày đến 4 ngày.
Lưu giữ trong tủ -80 °C.
Làm rã đông và thu lấy môi trường vào ống 15 ml.

- Quan sát đĩa bằng kính hiển vi soi ngược.
- Nguyên sinh chất của tế bào bắt phần đỏ đậm (màu của ACE), kết luận không có kháng thể.
- Nguyên sinh chất của tế bào không bắt màu (màu hồng), kết luận có kháng thể.
THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] TCVN 5273:1990 Bệnh dịch tả lợn.
[2] 10 TCN 716-2006 Qui trình chẩn đoán bệnh Dịch tả lợn. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn Cục Thú y 2006.
[3] O.I.E., 2009. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, Classical swine
fever, chapter 2.8.3
[4] Cẩm nang chẩn đoán tiêu chuẩn về các bệnh gia súc ở Việt Nam, in lần thứ nhất, Bệnh dịch tả lợn,
trang 104-105. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn - Viện Thú y, 2002.