ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC

NGUYỄN THỊ HƯƠNG TRANG

ĐỊNH LƯỢNG ACID CHLOROGENIC
TRONG DƯỢC LIỆU KÉ ĐẦU NGỰA
(Fructus Xanthii strumarii) THU HÁI TẠI
VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Hà Nội - 2020


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC

Người thực hiện: NGUYỄN THỊ HƯƠNG TRANG

ĐỊNH LƯỢNG ACID CHLOROGENIC
TRONG DƯỢC LIỆU KÉ ĐẦU NGỰA
(Fructus Xanthii strumarii) THU HÁI TẠI
VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
(NGÀNH DƯỢC HỌC)

Khóa: QH.2015.Y
Người hướng dẫn:


Nguyễn Thị Hương Trang


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT, CÁC KÝ HIỆU
Ký hiệu

Tên tiếng Anh hoặc tên khoa học

Tiếng Việt

ACN

Acetonitrile

Acetonitril

AOAC

Association of Official Analytical
Chemists

Hiệp hội các nhà Hóa phân
tích

CGA

Acid chlorogenic

Axit clorogenic


Methanol

Methanol extracts of fruits

Chiết xuất methanol quả của

of Xanthium strumarium

Xanthium strumarium

Methanol extracts of leaves

Chiết xuất methanol của lá cây
Xanthium strumarium

of Xanthium strumarium

of Xanthium strumarium

Chiết xuất methanol phần thân
cây Xanthium strumarium

RSD

Relative Standard Deviation

Độ lệch chuẩn tương đối

RP-HPLC-


Hình 3.1. Sắc ký đồ HPLC phân tích acid chlorogenic trong dược liệu Ké đầu ngựa..27
Hình 3.2. Sắc ký đồ đánh giá tính chọn lọc của phương pháp........................................28
Hình 3.3. Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ CGA và diện tích pic....30


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Cấu trúc của các hợp chất sesquiterpenoid phân lập từ Xanthium
strumarium L ...............................................................................................................4
Bảng 1.2. Cấu trúc các dẫn xuất của axit caffeoylquinic được phân lập từ Xanthium
strumarium L. ..............................................................................................................7
Bảng 1.3. Cấu trúc của các hợp chất steroid và glycosid đã được phân lập từ
Xanthium strumarium L. .............................................................................................9
Bảng 1.4. Một số phương pháp xác định acid chlorogenic ......................................17
Bảng 2.1. Danh sách các mẫu dược liệu Ké đầu ngựa thu thập ...............................20
Bảng 3.1. Các thông số đánh giá đối với acid chlorogenic ......................................27
Bảng 3.2. Kết quả đánh giá tính thích hợp hệ thống ................................................29
Bảng 3.3. Quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích của pic CGA ...................29
Bảng 3.4. Kết quả đánh giá độ lặp lại .......................................................................31
Bảng 3.5. Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp ............................................32
Bảng 3.6. Hàm lượng acid chlorogenic trong mẫu dược liệu Ké đầu ngựa thu hái tại
Việt Nam ...................................................................................................................32


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN.....................................................................................2
1.1. Tổng quan về cây Ké đầu ngựa (Xanthium strumarium L.) ..............................2
1.1.1. Vị trí phân loại ............................................................................................2
1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố .....................................................................2
1.1.3. Bộ phận dùng ..............................................................................................3

3.2.6. Độ đúng ......................................................................................................31
3.3. Áp dụng phương pháp đánh giá hàm lượng acid chlorogenic trong các mẫu
dược liệu Ké đầu ngựa ..............................................................................................32
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ......................................................................................34
4.1. Về thu thập mẫu dược liệu ...............................................................................34
4.2. Về xây dựng phương pháp định lượng ............................................................34
4.3. Về thẩm định phương pháp định lượng ...........................................................35
4.4. Về kết quả áp dụng phương pháp HPLC định lượng acid chlorogenic trong
dược liệu Ké đầu ngựa thu hái tại Việt Nam.............................................................35
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ....................................................................................37
TÀI LIỆU THAM KHẢO


ĐẶT VẤN ĐỀ
Cùng với sự tiến bộ của nền cách mạng khoa học – kỹ thuật, con người dần
có xu hướng “trở về với thiên nhiên”, nền Y học cổ truyền ngày càng được quan
tâm, nghiên cứu và phát triển. Trong đó, việc tập trung tìm kiếm, phân lập các hoạt
chất chữa bệnh từ các loài dược liệu tự nhiên đã mang lại giá trị to lớn và có ý nghĩa
vô cùng thiết thực cho công cuộc chăm sóc sức khỏe con người.
Ké đầu ngựa có tên khoa học Xanthium strumarium L., thuộc họ Cúc
Asteraceae, là một trong những vị thuốc quý được sử dụng rộng rãi trong nền Y học
truyền thống Việt Nam và Trung Quốc với nhiều công dụng như tiêu độc, sát trùng,
tán phong, trừ thấp. Ké đầu ngựa thường được dùng để chữa phong hàn đau đầu, tay
chân đau co rút, phong tê thấp, đau khớp, bướu cổ, mày đay, lở ngứa, mụn nhọt [3].
Bên cạnh đó, đây còn là loại dược liệu có nhiều tác dụng dược lý quan trọng như ức
chế khối u, kháng viêm, kháng khuẩn, chống oxy hóa và chống đái tháo đường.
Trong Ké đầu ngựa có chứa các nhóm chất mang hoạt tính sinh học, trong đó
phải kể đến acid chlorogenic – một hợp chất hóa học thuộc nhóm axit phenolic, có
công dụng chống oxy hóa, chống đột biến gen, ngăn chặn sự phát triển tế bào ung
thư, chống vi rút và kháng khuẩn. Acid chlorogenic là hoạt chất được yêu cầu định

Ké đầu ngựa có tên khoa học là Xanthium strumarium L., thuộc họ Cúc
Asteraceae, hay còn gọi là Thương nhĩ (tên Trung Quốc), Phát ma (tên Thổ). Ở
Trung Quốc, gọi quả ké là Thương nhĩ tử (Fructus Xanthii strumarii) [4].
Vị trí phân loại của Xanthium strumarium L.:
Giới: Thực vật (Plants)
Ngành: Ngọc lan (Magnoliaphyta)
Lớp: Ngọc lan (Magnoliopsida)
Bộ: Cúc (Asterales)
Họ: Cúc (Asteraceae)
Chi: Xanthium L.
Loài: Xanthium strumarium L. [65]
1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố
Cây thảo, sống hàng năm, cao khoảng 50 - 80 cm, ít phân cành. Thân hình
trụ, cứng, có khía, màu lục, đôi khi có điểm những chấm màu nâu tím, có lông
cứng. Lá mọc so le, dài 4 - 10 cm, rộng 4 - 12 cm, chia làm 3 - 5 thùy, mép khía
răng không đều, có lông ngắn và cứng ở cả hai mặt, gân chính 3, cuống lá dài 10
cm, có lông cứng [3].
Cụm hoa mọc ở đầu cành hoặc kẽ lá, màu lục nhạt, gồm hai loại đầu, cùng
gốc, nhưng đầu trên nhỏ mang hoa lưỡng tính, đầu khác mang hoa cái. Lá bắc xếp
thành hai hàng, có lông. Hoa lưỡng tính hình ống, không có mào lông, tràng có 5
thùy, nhị 5, hoa cái không có tràng và mào lông. Quả bế đôi, hình trứng, có hai sừng
nhọn ở đầu và phủ dày gai móc, dài 12 - 15 mm, rộng 7 mm [3].
Chi Xanthium L. chỉ có một loài Ké đầu ngựa ở Việt Nam. Cây có nguồn gốc
ở châu Mỹ, sau lan ra khắp các vùng cận nhiệt đới và nhiệt đới châu Á, châu Phi và
cả ở châu Âu. Ở Việt Nam, Ké đầu ngựa có ở hầu hết các tỉnh miền núi, trung du và
đồng bằng, nhất là các tỉnh phía Bắc, từ Nghệ An trở ra [3].

2



STT

Tên chất

1

Sibirolid A

2

Sibirolid B

3

4

Cấu trúc hóa học

TLTK

Norxanthantolid A

Norxanthantolid B
[46]

5

Norxanthantolid C

6

12

2-hydroxytomentosin1β,5β-epoxid

13

Xanthinin

14

Xanthumin

15

Xanthanol

16

Xanthatin

17

Xanthinosin

18

19

[36, 59]


(22)

(23)

Hình 1.2. Hợp chất axit caffeic (22) và xanthiumnolic A (23)
Trong khoảng thời gian từ năm 1993 - 2016, 10 dẫn xuất của axit
caffeoylquinic (CQA) cũng được tìm thấy trong các bộ phận của X. strumarium,
bao gồm: Axit 1,3,5-tri-O-CQA (24), axit 3,5-di-O-CQA (25) [7], axit 3,5dimethyl-CQA (26), axit 1,5-di-O-CQA (27), axit 1,3-di-O-CQA (28) [20], axit 5O-CQA (29), axit 1,4-di-O-CQA (30), axit 4,5-di-O-CQA (31) [14], axit 4-O-CQA
methyl este (32), axit chlorogenic (21) [9].

6


Bảng 1.2. Cấu trúc các dẫn xuất của axit caffeoylquinic được phân lập từ
Xanthium strumarium L.

S
T
T

Hợp chất
Caffeoyl
R1

R2

R3

R4


H

Caffeoyl

H

Caffeoyl

H

H

Caffeoyl

H

Caffeoyl

CH3

Caffeoyl

H

H

Caffeoyl

H


H

H

Caffeoyl

H

Caffeoyl

H

H

Caffeoyl

H

H

H

Caffeoyl

Caffeoyl

H

H



(33)

(34)

(35)
(36)
Hình 1.3. Các hợp chất coumarin được phân lập từ Xanthium strumarium L.
Năm 2018, trong một nghiên cứu về nhóm chất lignan trong quả khô Ké đầu
ngựa (Fructus Xanthii strumarii) của H. Jiang và cộng sự đã phân lập được nhiều
hợp chất lignanoid khác, ví dụ như: (-)-1-O-β-D-glucopyranosyl-2-{2-methoxy-4[1-(E)-propen-3-ol]phenoxyl}-propane-3-ol
(37),
leptolepisol
dihydrodehydrodiconiferyl alcohol (39), chushizisin E (40) [24].

(37)

D

(38),

(39)

(38)
(40)
Hình 1.4. Các hợp chất liganolid được phân lập từ Xanthium strumarium L.
8


1.1.4.4.

TLTK

[26]
43

Daucosterol

44

Stigmast-4-en-β-ol-3-on

9


45

5α,8α-epidioxy-22Eergosta-6,22-dien-3β-ol

46

Carboxyatractylosid

[10]

3β-norpinan-2-on-3-O47

48

β-D-apiofuranosyl(1→6)-β-Dglucopyranosid
(6Z)-3-hydroxymethyl7-methylocta-1,6-dien3-ol-8-O-β-Dglucopyranosid

ung thư phổi, ung thư vú, ung thư gan, ung thư ruột kết và một số dòng tế bào ung
thư khác.
Năm 1995, Ahn và cộng sự báo cáo rằng xanthatin và 8-epi-xanthatin phân
lập được từ lá của X. strumarium có hoạt tính gây độc tế bào đáng kể đối với dòng
tế bào HCT-15 gây ung thư ruột kết với giá trị ED50 (Effective Dose) lần lượt là 1,1
và 0,1 μg/mL [60].
Năm 2013, một nghiên cứu về tác dụng ức chế glycogen synthase kinase 3β
(GSK3β) của xanthatin - một sesquiterpen lacton được phân lập từ X. strumarium
đã được tiến hành bởi Tao và những người cộng sự. Nghiên cứu cho thấy, xanthatin
ức chế sự tăng sinh của các tế bào ung thư phổi NSCLC (non-small cell lung cacer)
dòng tế bào A549, H1975, H1299, H1650 và HCC827 của con người. Các nghiên
cứu khác của Tao và cộng sự sau đó cũng phát hiện ra rằng xanthatin có khả năng
ức chế STAT3, GSK3β và β-catenin. Ngoài ra, xanthatin còn có thể kích hoạt phản
ứng phá hủy ADN qua trung gian Chk1 và làm mất ổn định gen Cdc25C thông qua
sự thoái hóa lysosomal trong các tế bào ung thư phổi [48, 49, 50].
Năm 2007, bằng phương pháp xét nghiệm CellTiter 96 in vitro, Ramı'rezErosa và các cộng sự phát hiện ra rằng xanthatin và xanthinosin, hai loại
sesquiterpen lacton có trong X. strumarium cho thấy hoạt động gây độc tế bào in
vitro với các dòng tế bào ung thư ở người, bao gồm tế bào ung thư đại tràng WiDr
ATCC, tế bào ung thư vú MDA-MB-231 và tế bào ung thư phổi NCl-417. Các chiết
xuất chloroform phần trên mặt đất của X. strumarium cho thấy độc tính cao nhất với
tất cả các dòng tế bào thử nghiệm, giá trị nồng độ ức chế 50% đối tượng thử IC50
thu được từ những thử nghiệm đa liều nằm trong khoảng 0,1 – 6,2 μg/mL [43].
Năm 2016, trong một nghiên cứu về các hợp chất gây độc tế bào từ phần trên
mặt đất của X. strumarium của Janet và cộng sự đã cho thấy hợp chất (-)
spathulenol có trong X. strumarium mang hoạt tính chống khối u với một số dòng tế
bào ung thư như CACO-2 (ung thư đại trực tràng), Hep-G2 (ung thư gan tế bào gan
nguyên phát), HeLa và A2780 (ung thư biểu mô buồng trứng) [12].

11


Tác dụng chống viêm và giảm đau

Vào năm 2005, Kim và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu đánh giá tác
dụng chống viêm từ chiết xuất methanol phần thân cây X. strumarium (MEXS)
trong cả in vitro và in vivo. Kết quả nghiên cứu cho thấy MEXS nồng độ 30, 60 và
90 mg/mL có khả năng ức chế sản xuất nitric oxit (NO), prostaglandin E2 (PGE2) và
yếu tố hoại tử u TNF-α. Ngoài ra, MEXS còn ức chế hoạt động gắn kết ADN của
yếu tố nhân kappa B (NF-kB), ngăn cản quá trình sao mã sớm bằng cách ngăn chặn
sự giảm dần các chất ức chế kappa B-α (IkB- α) [30].

12


Năm 2016, Hossen và cộng sự đã thực hiện các phương pháp phân tích miễn
dịch toàn diện, phân tích mARN để nghiên cứu hoạt động chống viêm của MEXS
và cho ra kết luận: Vai trò chống viêm mạnh mẽ của MEXS trong bệnh viêm gan và
một số bệnh lý viêm khác có thể là do cơ chế ức chế tín hiệu viêm của MAPK
(mitogen-activated protein kinase) và AP-1 (activator protein-1) [17].
Trong một nghiên cứu khác, Hossen và cộng sự cũng nhận thấy hoạt tính
chống viêm tiềm tàng của MEXS trên các đại thực bào được điều trị bằng LPS
(lipopolysaccharide) và mô hình chuột viêm dạ dày do HCl/Etanol gây ra bằng cách
ức chế sản xuất NO, PGE2 và ngăn chặn hoạt động của enzym PDK1
(phosphoinositide dependent kinase 1) [16].
1.1.5.4.

Tác dụng chống oxy hóa

Năm 2011, Huang và các cộng sự đánh giá hoạt tính chống oxy hóa từ chiết
xuất quả X. strumarium cho thấy khả năng loại gốc 2,2′-azino-bis (3ethylbenzothiazoline-6-sulphonic axit (ABTS) và 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl
(DPPH) ở nồng độ 0,05 mg/mL một cách đáng kể [19].

strumarium, được đặt tên là deacetylxanthumin. Đây là hoạt chất có thể ức chế sự
phát triển của sợi nấm và sự nảy mầm của loài Phytophthora drechsleri với giá trị
MIC là 12,5 μg/mL [29].
Ngoài ra, vào năm 2016, Parveen và các cộng sự đã thực hiện phân tách các
thành phần từ lá X. strumarium bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ và thu được
các hợp chất có khả năng chống nấm như: β-caryophyllen (17.53%), α-cadinol
(6.66%), spathulenol (6.09%), limonen (5.66%) và 1,3,5-trimethyl-2[2-nitroallyl]
benzen (3.29%). Các chất này cho thấy tác dụng ức chế tăng trưởng đáng chú ý với
một số chủng nấm như: A. Niger, Aspergillus flavus, F. oxysporum, Fusarium
solani, Alternaria alternata và Penicillium digitatum với giá trị nồng độ kiềm khuẩn
tối thiểu MIC và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu MBC là 8 μg/mL [41].
1.1.5.6.

Tác dụng dược lý khác

Ngoài những tác dụng dược lý nêu trên, X. strumarium còn có nhiều tác dụng
dược lý khác cũng đã được nghiên cứu rộng rãi. Năm 2000, Hsu và cộng sự đã tiến
hành đánh giá tác dụng hạ đường huyết của axit caffeic – một hợp chất phenolic có
trong quả X. strumarium. Kết quả cho thấy, sau khi tiêm tĩnh mạch axit caffeic liều
0,5 – 3,0 mg/kg vào hai mô hình chuột bị tiểu đường kháng streptozotocin và kháng
insulin thì xuất hiện sự giảm glucose huyết tương phụ thuộc vào liều do tăng sử
dụng glucose [18].
Năm 2015, một nghiên cứu khác cũng chứng minh được rằng thành phần hóa
học caffeoylxanthiazonosid (CYXD) được phân lập từ quả của X. strumarium cho
tác dụng bảo vệ chống nhiễm trùng trên mô hình chuột nhiễm trùng huyết in vitro
và in vivo bằng cách tiêm CYXD vào trong màng bụng chuột với các nồng độ lần
lượt là 10, 20 và 40 mg/kg/ngày [57].
Ngoài ra, X. strumarium còn có khả năng chống huyết khối trong sỏi tiết niệu
gây ra bởi ethylen glycol thông qua việc ức chế sự hình thành các tinh thể canxi
14

tự nhiên, đặc biệt là chiết xuất cà phê và trà xanh. Đây là một hợp chất hoá học
mang hoạt tính sinh học quan trọng, đóng vai trò như chất chống oxy hóa, kháng
khuẩn, chống viêm, quét gốc tự do cũng như bảo vệ một số cơ quan của cơ thể.
15


CGA có khả năng bảo vệ gan bằng cách bảo vệ cơ thể khỏi các tổn thương do hóa
chất hoặc lipopolysacarid gây ra [37].
Năm 2017, Tajik và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu tổng quan về tác
dụng tiềm năng của CGA đối với các dấu ấn sinh học của bệnh lý mãn tính trên
động vật và người in vivo. Nghiên cứu cho thấy CGA đóng vai trò quan trọng trong
việc điều hòa chuyển hóa chuyển hóa glucose và lipid cũng như các rối loạn liên
quan khác. CGA còn cho thấy tiềm năng trong việc chống tiểu đường, chống béo
phì và chống ung thư [47].
Tác dụng chống oxy hóa của CGA đã được nghiên cứu bởi Zhang và cộng sự
năm 2003, kết quả chứng minh rằng CGA có khả năng dọn gốc hydroxyl (·OH) phụ
thuộc vào liều với hằng số tốc độ dọn gốc tự do là 7,73 x 109 M−1 sec−1 [62]. Ngoài
ra, tác dụng bảo vệ của CGA trong tình trạng oxy hóa bệnh lý gây ra bởi paraquat
đã được kiểm chứng trên chuột. Hoạt động của hồng cầu, glutathion peroxidase và
catalase ở gan tăng lên khi sử dụng paraquat, trong khi đó CGA có tác dụng làm
giảm những phản ứng này [53].
Năm 2013, Ong và cộng sự đã thực hiện đánh giá sự ảnh hưởng của CGA
đến sự dung nạp glucose, độ nhạy insulin, quá trình chuyển hóa lipid và hấp thụ
glucse cơ xương trong mô hình chuột Leprdb/db . Nghiên cứu chỉ ra rằng CGA hoạt
hóa sự phosphoryl hóa AMPK gây tăng tổng hợp GLUT4, giảm sự hình thành
G6Pase, dẫn tới sự ức chế tổng hợp axit béo và tân tạo đường, đồng thời tăng vận
chuyển glucose ở cơ [38].
Một nghiên cứu khác cũng nhận định rằng CGA có khả năng kích thích bài
tiết insulin từ dòng tế bào tiết insulin INS-1E và tăng hấp thu glucose trong tế bào
cơ L6 [52]. CGA trong chiết xuất hạt cà phê còn được chứng minh mang lại tác

Điều kiện sắc ký
+ Cột: Agilent SB-C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 μm)
+ Cột bảo vệ: C18 (5 μm)
+ Pha động: Axit phosphoric 0,05% : ACN
(0,01 phút – tỷ lệ 94 : 6 tt/tt, 50 phút – tỷ lệ 65 : 35 tt/tt)
+ Nhiệt độ cột: 35°C
+ Tốc độ dòng: 0,9 ml/phút
+ Detector DAD: 200 – 370 nm

TLTK

[32]

+ Kết quả: Thời gian lưu pic CGA khoảng 15,5 phút
+ Cột sắc ký: Inertsil ODS-3 C18 (4,6 mm x 250 mm, 5 μm)
+ Cột bảo vệ: ReproSil-Pur ODS-3 C18 (4 mm x 10 mm)
+ Pha động: Nước chứa 0,2% axit phosphoric, pH 1,46 (dung

2

Định lượng CGA trong
một số dược liệu Thái

RP-HPLCDAD

môi A) và methanol (dung môi B)
+ Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút
+ Thể tích tiêm: 5 μl
+ Nhiệt độ cột: 30°C
+ Bước sóng phát hiện: 325 nm