Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên Trang 1

I.

Tổng quan tài liệu ................................................................................................................. 2

1.

Giới thiệu về hợp chất thứ cấp ......................................................................................... 2

2.

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật .................................................................................... 2

3.

Sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong tế bào thực vật .................................................. 3

4.

Một số nghiên cứu về hợp chất thứ cấp ........................................................................... 5

II.

Thu nhận hợp chất shikonin từ cây Lithospermum erythrorhizon .................................... 7

1.



2.4.

Tăng cường sản xuất Shikonin từ Lithospermum erythrorhizon nhờ tách chiết in
situ (tại chỗ) và cố định Calcium Alginate ............................................................................ 18

2.4.1.

Giới thiệu về phương pháp .................................................................................. 18

2.4.2.

Nguyên liệu và phương pháp. .............................................................................. 19

2.4.3.

Sự cố định và cảm ứng tạo Shikonin trong nuôi cấy tế bào thực vật .............. 19

2.4.4.

Phương pháp phân tích ........................................................................................ 19

2.4.5.

Kết quả và thảo luận ............................................................................................. 20
Nhóm thực hành :
Nguyễn Thị Thanh Trúc mssv 60802410

cây canh ki na,rễ cây và độc dược....Các hoạt tính sinh học của nó có thể tác động
lên hệ thần kinh,hệ cơ,mạch máu hay bộ máy hô hấp của con người.
Với liều lượng lớn alkaloid thường độc nhưng liều lượng nhỏ chúng thường làm
dùng thuốc chữa bệnh.
Các tinh dầu :
Chứa hỗn hợp terpenoid,được sử dụng như chất mùi ,chất thơm và dung
môi.Chúng không tan trong nước.
Các glycoside:
Bao gồm các hợp chât phenol và flavonoid,saponin,và các cyanogenic
glycoside,một số dùng làm thuốc nhuộm,chất mùi thực phẩm và dược phẩm.

2. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật
Kỹ thuật này là tiềm năng để thu được các hợp chất có giá trị mà không thể sản
xuất chúng từ các tế bào vi sinh vật hoặc tổng hợp bằng con đường hóa học.
Những năm gần đây, sự phát triển của các hợp chất thứ cấp quan trọng trong
thương mại là kết quả được mong đợi nhất trong lĩnh vực nghiên cứu này. Ưu
thế về mặt nguyên lý của kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật là có thể cung cấp liên
Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên Trang 3

tục nguồn nguyên liệu để tách chiết một tỷ lệ lớn lượng hoạt chất từ tế bào
thực vật nuôi cấy .
Một trong những nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến việc sản xuất các hợp chất
thứ cấp từ tế bào thực vật là sự phân hóa hình thái. Nhiều hợp chất thứ cấp được
sản xuất trong suốt quá trình phân hóa tế bào, vì thế chúng được tìm thấy trong
các mô có khả năng phân hóa cao như rễ, lá và hoa. Do sự phân hóa hình thái và
sự trưởng thành không xuất hiện trong nuôi cấy tế bào nên các chất thứ cấp có
khuynh hướng ngưng tạo thành trong quá trình nuôi cấy. Tuy nhiên, các tế bào

hữu ích để nghiên cứu và sản xuất hợp chất thứ cấp thực vật.
Mục tiêu của kỹ thuật nuôi cấy tế bào :cải thiện hiệu suất các sản phẩm có hoạt tính
Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên Trang 4

sinh học Ưu điểm :có thể cung cấp sản phẩm một cách liên tục và đáng tin cậy dựa trên
những lý do sau:
F Tổng hợp các hợp chất thứ cấp có giá trị diễn ra dưới sự điều khiển các
yếu tố môi trường nuôi cấy, độc lập với khí hậu và điều kiện đất trồng;
F Phủ định ảnh hưởng sinh học đến các sản phẩm là hợp chất thứ cấp trong
tự nhiên (vi sinh vật và côn trùng)
F Có thể chọn lọc các giống cây trồng cho nhiều loại hợp chất thứ cấp khác
nhau
F Với việc tự động hóa điều khiển sự sinh trưởng của tế bào và điều hòa quá
trình chuyển hóa, chi phí có thể giảm và lượng sản phẩm tăng lên. Bên
cạnh đó, những kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy nuôi cấy tế bào
huyền phù của thực vật cũng được sử dụng để sản xuất các sản phẩm
protein tái tổ hợp (Fisher và cs 1999).
Phương pháp làm tăng sản lượng các hợp chất tự nhiên trong nuôi cấy tế bào
F Chọn lựa thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp
F Chọn lựa các dòng tế bào năng suất cao,
F Bổ sung tiền chất nuôi cấy và các chất kích kháng bảo vệ thực vật
(Mulbagal and Tsay 2004).
Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy.
Các sản phẩm tích lũy có trong tế bào có thể cao hơn khi ta tối ưu các điều kiện

lũy valnillin, hoặc bổ sung leucine dẫn đến việc tăng các monoterpen dễ bay hơi
trong nuôi ấy Perilla frutiscens (Mulbagal and Tsay 2004).
Sự kích kháng bảo vệ thực vật (elicitation).
Thực vật sản xuất các hợp chất thứ cấp trong tự nhiên như một bộ máy bảo vệ
chống lại các yếu tố gây bệnh. Chất kích kháng bảo vệ thực vật (elicitor) báo hiệu
việc hình thành các hợp chất thứ cấp. Sử dụng các elicitor của bộ
máy bảo vệ cây, tức sự kích kháng bảo vệ thực vật, là phương thức để thu được
các sản phẩm hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học một cách hiệu quả nhất. Sử
dụng các elicitor sinh học và phi sinh học (được phân loại dựa trên nguồn gốc
của chúng) để kích thích hình thành các hợp chất thứ cấp trong quá trình nuôi cấy
tế bào, có thể giúp rút ngắn thời gian và đạt hiệu suất cao (DiCosmo và Tallevi,
1985). 4. Một số nghiên cứu về hợp chất thứ cấp
@ Ngay từ năm 1971, Wani và các cộng sự đã tìm ra một diterpene amide mới có
khả năng chống ung thư gọi là “taxol” chiết từ cây thông đỏ Pacific (Taxus
brevifolia). Đến năm 1983, taxol được Cục quản lý Dược phẩm và Thực phẩm
Hoa Kỳ (FDA) đồng ý đưa vào thử nghiệm ở giai đoạn I điều trị cho ung thư
buồng trứng. Sau đó, FDA đã cho phép sử dụng taxol trong điều trị các trường
hợp ung thư buồng trứng và ung thư vú. Ngoài ra, taxol cũng có ác dụng đối với
các bệnh nhân có khối u ác tính, ung thư phổi và các dạng u bướu khác

@ Neto và cs (1994) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các chất dinh dưỡng và một số
yếu tố khác lên sự tích lũy taxol trong nuôi cấy tế bào T. cuspidata. Srinivasan
và cs (1995) nghiên cứu quá trình sản xuất taxol bằng nuôi cấy tế bào của T.
baccata. Lee và cs (1995) đã nghiên cứu ản xuất taxol bằng nuôi cấy tế bào
huyền phù của cây T. mairei, một loài được tìm thấy tại Đài Loan ở độ cao
2000 m so với mực nước biển. Các dòng tế bào thu được từ callus có nguồn gốc
thân và lá, và một trong những dòng này sau khi được bổ sung các tiền

diosgenin là 3%. Lượng diosgenin thu được trong trường hợp này đạt tới 3,2%
khối lượng khô. Sản xuất diosgenin từ cây D. doryophora bằng nuôi cấy tế bào
huyền phù hiện nay đã được ứng dụng trên quy mô công nghiệp. Gentiana davidii
var. formosana là thảo mộc bản địa sống lâu năm ở Đài Loan. Từ xưa nó đã được
sử dụng như một loại thuốc thô sơ trong y học cổ truyền Trung Quốc nhằm ngăn
chặn béo phì và lão hóa, bảo vệ phổi khỏi các chất độc (Zheng và cs
1997). Secoiridoid glycoside là hợp chất chính với đặc tính y học ở trong rễ của
chi Gentiana (Skrzypczak và cs 1993). Chueh và cs (2000) nghiên cứu tối ưu hóa
điều kiện nuôi cấy tế bào huyền phù của G. davidii var. formosa để sản xuất
gentipicroside và swertiamarin, hai dược chất quan trọng. Tế bào huyền phù
sinh trưởng tối ưu khi nuôi cấy callus trong môi trường bổ sung 1,2 mg/L
kinetin và 3% saccharose, pH 4,2-5,2, tốc độ lắc 80-100 vòng/phút. Sự tích lũy
cao nhất 2 hợp chất swertiamarin và gentipicroside trong tế bào được xác định
lần lượt sau 12 và 24 ngày nuôi cấy.
Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên Trang 7

@ Miyasaka và cs (1989) đã nghiên cứu sản xuất cryptotanshinone từ nuôi cấy callus
cây Salvia miltiorrhiza. Salvia là một chi quan trọng của họ Lamiaceae và một vài
loài của Salvia mọc hoang dại trên khắp thế giới dùng làm thuốc dân gian. Hiệu
quả của BA đối với việc hình thành cryptotanshinone trong nuôi cấy callus
S.miltiorrhiza đã được khảo sát. Callus sơ cấp được tạo ra từ nuôi cấy mảnh lá
ở trong tối trên môi trường bổ sung 1,0 mg/L 2,4-D. Callus sau đó phát triển
nhanh hơn trên môi trường có 1,0 mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L BA. Kết quả phân tích
HPLC cho thấy callus chứa một lượng nhỏ cryptotanshinone (0,26 mg/g khối
lượng khô). Loại bỏ 2,4-D khỏi môi trường nuôi cấy cho kết quả là lượng
cryptotanshinone trong callus tăng lên. Nồng độ cao nhất của cryptotanshione thu
được trong callus nuôi cấy trên môi trường có 0,2 mg/L BA trong 6 ngày là 4,59

Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên Trang 8

Lithospermum erythrorhizon. Cây này trồng 5-7 năm, chiết rễ lấy được 1-2% chất
khô, giá 1 kg là 4.500 USD. Nhu cầu tiêu thụ shikonin cao. Ở Nhật Bản phải nhập
thêm của Trung Quốc, Triều Tiên.
Một đoạn rễ đã được sử dụng trong nhiều thế kỷ để làm bài thuốc nhân gian và
ngày nay được sử dụng làm thuốc mỡ chữa bỏng.Nó có công thức cấu tạo như
sau: Chuỗi phản ứng tổng hợp một dẫn xuất có hoạt tính sinh học cao từ shikonin

Bình thường shikonin tích lũy không nhiều trong rễ. Tuy nhiên, các nhà
khoa học Nhật đã tạo được dòng tế bào rễ cây Lithospermum có khả năng
tích lũy đến 15% shikonin và đã hoàn chỉnh công nghệ nuôi cấy tế bào sản
xuất shikonin. Công nghệ này cho phép trong một chu kỳ nuôi cấy thu
hoạchtới 5 kg hoạt chất và giúp giảm rất nhiều giá thành của shikonin.
Sản phẩm công nghiệp đầu tiên từ nuôi cấy tế bào là shikonin được tập đoàn

loại nuôi cấy này tỏ ra dễ điều khiển hơn.
Công ty Escagenetics (California, Mỹ) cũng đã thông báo thành công trong việc
sản xuất taxol bằng nuôi cấy rễ lông. Taxol là chất tách chiết từ vỏ và lá kim của
cây thủy tùng (Taxus brerifolia) đang được dùng thử có kết quả trong điều trị
nhiều loại ung thư. Việc cung cấp taxol gặp khó khăn vì bản thân cây thủy tùng
khan hiếm và hàm lượng taxol trong chúng rất thấp. Escagenetics đã có thể sản
xuất taxol với nồng độ cao hơn nồng độ tự nhiên thấy trong vỏ và lá cây thủy
tùng.
Hiện nay, hãng Phyton Catalytic (New York, Mỹ) đã mua bản quyền sản xuất
toxol hoặc chất đồng đẳng của taxol ở qui mô pilot. Giá bán taxol hiện nay được
xác định là 200.000 - 300.000 USD/kg. Theo Escagenetics việc sản xuất vanillin
bằng nuôi cấy tế bào công nghiệp đã là bệ phóng tốt để họ đi tới nuôi cấy tế bào
taxol. Thông qua mối quan tâm về sản xuất taxol hiểu biết về quá trình sinh tổng
hợp dược chất được mở rộng. Tới nay mới có 10 trong số các dược chất có nguồn
gốc thực vật đang được sử dụng rộng rãi (khoảng 300.000 loài) được tổng hợp
nhân tạo trong phòng thí nghiệm, số còn lại đều được chiết trực tiếp từ cây cỏ.
Thế nhưng mới đây Văn phòng thương mại và bản quyền Mỹ đã cấp quyền tác
giả cho ĐH Quốc gia Florida về qui trình công nghệ bán tổng hợp thuốc chống
ung thư. Công nghệ này kết hợp một chất gọi là baccatin III và một chuỗi tổng
hợp để thu được một chất có cấu trúc giống chất taxol tự nhiên. Baccatin III được
tách chiết từ thủy tùng nước Anh, họ hàng với thủy tùng Địa Trung Hải. Công ty
dược Bristol-Myers Squibb, nơi cung cấp taxol tự nhiên chính vừa ký hợp đồng
bản quyền với ĐH Quốc gia Florida để đưa công nghệ sản xuất taxol vào sản
xuất.
Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên Trang 10

Srinivasan và cs. (1997) đã nuôi cấy dịch huyền phù tế bào của 2 loài thuỷ tùng là

,
-2
4
SO
,
-
42
POH
, K
+
, Ca
2+
và Mg
2+
) đến sản lượng sinh khối và sự tích lũy hyoscyamine.
Nồng độ
-
3
NO
và K
+
cao cho sinh khối cao nhất, còn sản lượng hyoscyanine cao
nhất khi
-2
4
SO
và K
+
cao.