BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC
*****000*****
KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT-PCR XÁC ĐỊNH Macrobrachium
rosenbergii NODAVIRUS (MrNV) VÀ EXTRA SMALL VIRUS
(XSV) TRÊN TƠM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbergii) Ngành học: CƠNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khố: 2001-2005
Sinh viên thực hiện: PHẠM DUY LÃM Giỏo viờn hng dn: Sinh viờn thc hin:
TS. NGUYN VN HO PHM DUY LM
Th.S. NGễ XUN TUYN
Thnh Ph H Chớ Minh
8/2005 iii
LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trường Đại Học Nông Lâm đã
tận tình dạy sỗ, truyền đạt kiến thức cho em trong suốt thời gian em học tại
trường.
Với lòng biết ơn sâu sắc em xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Văn
Hảo, người đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và giải đáp những vấn đề khó
khăn và tạo điều kiện tốt nhất để hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Em xin cảm ơn Anh Ngô Xuân Tuyến, chò Trì Thanh Thảo, anh Cao
Thành Trung, anh Chu Quang Trọng đã nhiệt tình hướng dẫn, trợ giúp em về
nguyên vật liệu, dụng cụ trong suốt thời gian em thực hiện đề tài này.
Em xin cảm ơn anh chò làm việc tại Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc
Cảnh Báo Môi Trường và Phòng Ngừa Dòch Bệnh Thuỷ Sản Viện Nghiên
Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II, phòng lab DNA TRung Tâm Chẩn Đoán
YKhoa Hoà Hảo, các anh chò ở Trại Thực Nghiệm Thủ Đức, đã quan tâm
giúp đỡ, tạo điều kiện cho em hoàn thành đề tài này.
Bước đầu làm quen với công tác nghiên cứu khoa học, bản khoá luận này
Những kết quả thử nghiệm qui trình Single - Step PCR mà chúng tôi đạt đƣợc
có kết quả nhƣ sau:
Xác định đƣợc sự hiện diện đồng thời MrNV và XSV trong mẫu tôm thịt
bệnh trắng đuôi đƣợc cung cấp từ Ấn Độ bằng qui trình Single - Step RT - PCR
Khảo sát đƣợc hai qui trình tách chiết bằng AquaPure RNA Isolation Kit và
Trizol trên mẫu tôm thịt bệnh trắng đuôi Ấn Độ bằng qui trình Single - StepRT - PCR.
Khảo sát đƣợc nồng độ mồi của hai virus cho phản ứng Single - Step RT-
PCR là 20 mol cho MrNV và 20 mol cho XSV.
Khảo sát đƣợc nhiệt độ lai tối ƣu của hai virus cho phản ứng Single - Step
PCR là 55
0
C.
Ứng dụng qui trình khảo sát đƣợc trên 50 mẫu tôm càng xanh thu từ thực
địa, kết quả phát hiện đƣợc 6 mẫu tôm mẹ, 1 mẫu tôm postlarvae có sự hiện diện đồng
thời của MrNV và XSV trong mẫu tôm bệnh trắng đuôi. v
ABSTRACT
Freshwater prawn (Macrobrachium rosenbergii) plays an economically
important role in aquaculture. However, The recent report of new disease in freshwater
prawn hatcheries, this disease is responsible for mortalities in hatchery - reared
Freshwater Prawn which losses aquaculture industry in India. The disease was
reported in Guadeloupe and Martinique (India) subsequently in the five provinces of
China. The clinical sign of disease is whitish appearance of the tail and has given rise
to the name “White tail disease”. Lately, scientists have been detected a nodavirus -
like particles from freshwater prawn suffering from White tail disease (WTD), named
Macrobrachium rosenbergii nodavirus. Subsequently a second virus - like particle,
Tóm tắt ............................................................................................................................. v
Mục lục ............................................................................................................................ vi
Danh mục các hình và các bảng ....................................................................................... ix
Danh mục các từ viết tắt .................................................................................................. x
PHẦN 1. LỜI MỞ ĐẦU .................................................................................................. 1
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................ 3
2.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT GIỐNG TÔM CÀNG
XANH TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM .......................................... 3
2.1.1. Tình hình nghiên cứu sản xuất giống tôm càng xanh trên thế giới ........... 3
2.1.2. Tình hình nghiên cứu sản xuất giống tôm càng xanh ở Việt Nam ............ 3
2.2. MỘT SỐ BỆNH TRÊN ẤU TRÙNG TÔM CÀNG XANH ............................... 5
2.2.1. Bệnh hoại tử cơ ......................................................................................... 5
2.2.2. Bệnh giữa chu kỳ ấu trùng ........................................................................ 5
2.2.3. Bệnh hoại tử do vi khuẩn .......................................................................... 5
2.2.4. Bệnh phát sáng .......................................................................................... 5
2.2.5. Bệnh lột xác dính vỏ ................................................................................. 6
2.2.6. Bệnh do Protozoa ...................................................................................... 6
2.2.7. Bệnh virus ................................................................................................. 6
2.2.8. Bệnh trắng đuôi ........................................................................................ 6
2.3. NHỮNG PHƢƠNG PHÁP DÙNG TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH TRẮNG ĐUÔI
DO VIRUS GÂY RA TRÊN TÔM CÀNG ........................................................................ 10
2.3.1. Phƣơng pháp mô học ................................................................................ 10
2.3.2. Phƣơng pháp lai Dot-lot............................................................................ 10
2.3.3. Phƣơng pháp lai tại chỗ (in situ hybridization) ........................................ 11
2.3.4. Phƣơng pháp Sandwich - ELISA (A sandwich enzyme linked
immunosorbent assay) ................................................................................................. 12
2.3.5. Phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) ................................... 12
2.3.6. Phƣơng pháp RT - PCR (Reverse Transcription Polymerase Reaction) ............... 15 viii
PHẦN 4. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM QUI TRÌNH SINGLE - STEP RT - PCR PHÁT
HIỆN MrNV, XSV TỪ MẪU TÔM BỆNH ĐƢỢC CUNG CẤP TỪ ẤN ĐỘ. .................. 26
4.2. KẾT QUẢ KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN CỦA QUI TRÌNH SINGLE -
STEP RT - PCR ..................................................................................................................... 27
4.2.1. Kết quả so sánh hai qui trình tách chiết. .............................................. 27
4.2.2. Kết quả khảo sát nồng độ mồi .............................................................. 30
4.2.3. Kết quả khảo sát nhiệt độ lai của mồi .................................................. 30
4.3. KẾT QUẢ ỨNG DỤNG QUI TRÌNH KHẢO SÁT ĐƢỢC KIỂM TRA MỘT SỐ
MẪU TÔM CÀNG XANH THU THỰC ĐỊA ....................................................................................... 32
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận ............................................................................................................... 36
5.2. Tồn tại ................................................................................................................. 36
5.3. Đề xuất ................................................................................................................ 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt .................................................................................................................. 38
Tiếng nƣớc ngoài ........................................................................................................ 39
Bảng 3.3: Thành phần hai Mix sử dụng Single - Step RT - PCR ............................ 22
Bảng 3.4: Bảng khảo sát nhiệt độ lai của các mồi .................................................... 25
Bảng 3.5: Các loại mẫu tôm càng xanh thu ở các giai đoạn khác nhau ..................... 25
Bảng 4.1: Kết quả điện di các sản phẩm RT - PCR đƣợc tách chiết bộ Kit và Trizol .................. 28
Bảng 4.2: Kết quả biểu hiện tín hiệu của sản phẩm của hai dãy nhiệt độ .................. 31
Bảng 4.3: Kết quả thực hiện phản ứng RT - PCR trên 50 mẫu tôm càng xanh ........ 35 x
Danh mục các từ viết tắt
DNA: Deoxyribonucleic acid
ss-DNA: Single strand - Deoxyribonucleic acid
RNA: Ribonucleic acid
mRNA: Messenger ribonucleic acid
cDNA: Complementary deoxyribonucleic acid
Bp: Base pair (cặp base)
dATP: 2’-deoxyadenosine-5’-triophosphate
dCTP: 2’-deoxycytosine-5’-triophosphate
dGTP: 2’-deoxyguanine-5’-triophosphate
dTTP: 2’-deoxythymine-5’-triophosphate
UV: Ultra Violet- tia cực tím
TE: Tris-EDTA.
DIG: Digoxigenin
DEPC: Diethyl Prycacbonat
Bộ Thủy Sản năm 1999, ĐBSCL có 6000 ha diện tích nuôi tôm càng xanh với tổng
sản lƣợng trên 2500 tấn và đến 2002 sản lƣợng tôm càng xanh đã tăng nhanh đáng kể
với tổng sản lƣợng lên đến 10.000 tấn (Bộ Thủy Sản, 2003). Tuy nhiên, trở ngại lớn
nhất hiện nay đối với nghề nuôi tôm càng xanh ở nƣớc ta nói chung và ĐBSCL nói
riêng là vấn đề con giống. Từ lâu, ngƣời nuôi vẫn quen sử dụng nguồn giống tự nhiên
đƣợc thu gom từ sông rạch, vì thế nguồn giống ngày càng khan hiếm, chất lƣợng
không đảm bảo. Do đó, đã có nhiều công nghệ sản xuất giống tôm càng xanh đƣợc đẩy
mạnh nhƣ: công nghệ sản xuất giống tôm càng xanh trong ao đất ở vùng nhiễm mặn,
sản xuất giống nƣớc xanh và nƣớc xanh cải tiến ở vùng nội đồng, sản xuất tôm càng
xanh toàn đực bằng con cái giả thông qua kỹ thuật vi phẫu.
Sau những thành công của các công nghệ sản xuất giống, nối tiếp là hàng loạt
những trang trại sản xuất giống nuôi thâm canh ra đời, sự khai khác tối đa nguồn nƣớc
tự nhiên, sự đáp ứng không đủ về mặt năng lực chuyên môn, nghiêm trọng hơn là áp
dụng mô hình nuôi bừa bãi dẫn đến sự giảm thiểu về môi trƣờng, phá vỡ môi trƣờng
sinh thái làm phát triển nhanh chóng sự lây lan dịch bệnh. Trong số những tác nhân
gây bệnh tìm thấy trên tôm nuôi, virus là một tác nhân quan trọng nhất gây nên sự
bùng nổ dịch bệnh (Lightner, 1993).
Một trong những virus đƣợc ghi nhận gần đây xuất hiện đầu tiên ở Ấn Độ
(Arcier và cộng sự, 1999) gây thiệt hại nghiêm trọng trên các đàn postlarvae ở các trại
sản xuất giống (Bonami và cộng sự, 2005), tỷ lệ chết lên đến 100% (Vijayan và cộng
sự, 2003). Bệnh do hai loại virus là Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) 2
(Vijayan và cộng sự, 2003) và Extra small virus (XSV)(Qian và cộng sự, 2003) gây
bệnh trắng đuôi (White tail disease).
Ở Việt Nam chƣa tìm thấy một công bố nghiên cứu nào về hai loại virus trên
nhiễm trên tôm càng xanh. Chính vì vậy đƣợc sự đồng ý của Bộ Môn Công Nghệ Sinh
Học và Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II, chúng tôi tiến hành đề tài “ Ứng
dụng kỹ thuật RT - PCR xác định Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) và
Đài Loan 14.000 tấn (1991), Thái Lan 10.000 tấn. Đến năm 2002 Trung Quốc chiếm
58% về sản lƣợng tôm càng xanh của thế giới.
Vì tôm càng xanh mang lại lợi nhuận cao, dễ nuôi, ít bị bệnh hơn so với các
loại tôm nuôi khác nên từ lâu đã có nhiều công trình nghiên cứu về nuôi và ngày càng
hoàn thiện về quy trình kỹ thuật nuôi (Nguyễn Thị Thanh Thủy, 2000). Sau thành công
của Ling (1969) về sinh sản nhân tạo tôm càng xanh ở Malaysia. Năm1972, Fujimura
và Okamoto đã cải tiến thành công phƣơng pháp sản xuất tôm càng xanh đại trà. Năm
1974, cũng Fujimura đƣa ra qui trình nƣớc xanh. Sau đó hàng loạt các tác giả khác đã
cố công nghiên cứu việc sinh sản nhân tạo và phát triển nuôi chúng nhƣ Adisukressno
(1980), Liao (1980), Malecha (1980), Sandifer (1977), Smith (1879) (Trần Thanh
Phục, 2001). Hiện nay, trên thế giới có ba qui trình sản xuất giống tôm càng xanh đã
đƣợc phổ biến là qui trình nƣớc trong hở (clear open water system), qui trình nƣớc
trong kín (clear closed water system), và qui trình nƣớc xanh (green water system)
(Nguyễn Việt Thắng, 1993).
2.1.2. Tình hình nghiên cứu sản xuất giống tôm càng xanh ở Việt Nam
Ở Việt Nam tôm càng xanh cũng đƣợc nghiên cứu từ năm 1974, sau năm 1980
tiếp tục đƣợc nghiên cứu tại Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II. Đến năm
1982, Trung Tâm Nghiên Cứu Sản Xuất Tôm Vũng Tàu (Viện Nghiên Cứu Nuôi
Trồng Thủy Sản II) đã cho tôm càng xanh sinh sản nhân tạo thành công (Phạm Văn
Tình, 2000).
Từ 1987-1992, Trung Tâm Nghiên Cứu Sản Xuất Tôm Vũng Tàu đã sản xuất
tổng cộng đƣợc 2.1 triệu postlarvae (Trần Thanh Phục, 2001). 4
Ngoài ra còn nhiều tác giả: Trần Đức Can (1987), Phan Hữu Đức (1988),
Nguyễn Quang Ly (1988), Nguyễn Việt Thắng (1995), Phạm Văn Tình (1999)... đã
nghiên cứu về đặc điểm sinh học, vùng phân bố, mùa vụ sinh sản của tôm càng xanh,
cũng nhƣ kỹ thuật sản xuất giống và nuôi tôm càng xanh thƣơng phẩm ở các thủy vực
Từ 1999 - 2003, số lƣợng trại sản xuất giống cũng nhƣ sản lƣợng tôm giống sản
xuất ở ĐBSCL không ngừng gia tăng theo thời gian, năm 2003 có 97 trại giống tăng
95 trại so với năm 1999 và tổng sản lƣợng tôm giống sản xuất đƣợc trong năm 2003 là
76.5 triệu con (Đại Học Cần Thơ, 2003; trích từ Bộ Thủy Sản, 2004).
2.2. MỘT SỐ BỆNH XẢY RA TRÊN ẤU TRÙNG TÔM CÀNG XANH
2.2.1. Bệnh hoại tử cơ cá thể (Idiopathic Muscle Necrosis-IMN)
Bệnh hoại tử cơ đó là nguyên nhân gây tử vong hàng loạt cho tôm ấu trùng
trong trại giống. Nash và cộng sự (1987) đã báo cáo rằng bệnh hoại tử cơ là nguyên
nhân gây tử vong nhanh chóng đến 60% số hậu ấu trùng 28 ngày tuổi trong hệ thống
ƣơng tôm thâm canh ở Thái Lan. Bệnh này biểu hiện với nhiều điểm trắng lan rộng
trên cơ (Akiyama và cộng sự, 1982; Nash và cộng sự, 1987; Brock, 1988).
2.2.2. Bệnh giữa chu kỳ ấu trùng (Larvae Mid Cycle Disease-MCD)
Bệnh này thƣờng xảy ra trong các giai đoạn ấu trùng từ IV-XI. Anderson và
cộng sự (1990) đã báo cáo hiện tƣợng tử vong hàng loạt ấu trùng tôm càng xanh ở
Malaysia khoảng 16 ngày sau khi nở. Bệnh này tƣơng tự nhƣ bệnh hoại tử do vi
khuẩn. Ấu trùng bỏ ăn và những cá thể bệnh sẽ bị các con khỏe ăn thịt. Ấu trùng
nhiễm bệnh thƣờng có màu xám xanh lơ, bơi lội yếu ớt và thƣờng bơi theo hình xoắn
ốc. Nguyên nhân gây bệnh vẫn chƣa xác định đƣợc nhƣng có lẽ do nhiễm tự nhiên.
Nguyên nhân có thể là vi khuẩn Enterobacter aerogenes (vi khuẩn sinh bọt khí trong
đƣờng ruột) (Johnson, 1978; Brock, 1988).
2.2.3. Bệnh hoại tử do vi khuẩn
Triệu chứng cấp tính của bệnh này là ấu trùng chuyển sang màu xanh lơ
nhạt, dạ dày rổng, ấu trùng chìm xuống đáy bể và có những chấm nâu trên râu và các
phụ bộ mới hình thành. Các quan sát cho thấy có sự nhiễm phức hợp vi khuẩn dạng sợi
Leucothix spp, trực khuẩn và cầu khuẩn trên các tơ lông, mang, và các phụ bộ. Ấu
trùng càng nhỏ thì bệnh càng nghiêm trọng. Theo tạp chí Aquacop (1977) cho biết
bệnh này ảnh hƣởng đến ấu trùng tôm càng xanh (giai đoạn IV-V) ở Tahiti dẫn đến tử
2.2.7. Bệnh virus
Anderson và cộng sự (1990) đã báo cáo một loại Parvo - like virus ở hậu ấu
trùng tôm càng xanh trong các trại giống ở Malaysia. Đây là loại virus đƣợc báo cáo
đầu tiên trên tôm càng xanh. Hậu ấu trùng bị nhiễm virus với triệu chứng nhƣ sự mờ
đục ở các mô, gây hoại tử cơ.
7
2.2.8. Bệnh trắng đuôi
Bệnh trắng đuôi (White tail disease ) gây ảnh hƣởng nghiêm trọng đến đàn ấu
trùng. Tác nhân gây bệnh chính là phức hợp hai loại virus Macrobrachium rosenbergii
nodavirus (MrNV) và Extra small virus (XSV).
Sự mở rộng và tăng cƣờng nuôi trồng thủy sản nhiều và nhiều bệnh mới sẽ
xuất hiện. Những báo cáo gần đây về bệnh trắng đuôi (White tail disease) xuất hiện
trong những bể ƣơng tôm càng xanh và những trang trại vừa gây thiệt hại cho ngành
công nghiệp nuôi trồng thủy sản ở Ấn độ. Thông tin này đƣợc đƣa ra từ hội nghị
“Freshwater Prawn 2003 International Symposium” ở Cochin (Ấn Độ) (Sahul
Hameed, 2003).
Bệnh đƣợc ghi nhận đầu tiên ở Guadeoupe năm 1997 (Arcier và cộng
sự,1999) sau đó ở Martinique (Ấn Độ), Đài Loan (Tung và cộng sự, 1999) và 5 tỉnh
khác thuộc Trung Quốc (Qian và cộng sự, 2003).
Trong những bể ƣơng tôm càng xanh bị nhiễm bệnh, dấu hiệu chủ yếu của
đàn hậu ấu trùng (postlarvae) là lờ đờ, biếng ăn và mờ đục ở vùng cơ đuôi. Trong
những trƣờng hợp bệnh nặng sự mờ đục khắp cơ thể và dẫn đến thoái hoá phần phụ bộ
đuôi. Khoảng 2 - 3 ngày, tỷ lệ chết lên đến 100%. Tôm bệnh có dấu hiệu hơi trắng ở
đuôi nên đƣợc gọi là “bệnh trắng đuôi ” (Sahul Hameed, 2003; Salin và Nair, 2003;
Vijayan và cộng sự, 2003).
Khi làm thí nghiệm cảm nhiễm virus gây bệnh trắng đuôi vào tôm
postlarvae và tôm trƣởng thành, các nhà khoa học nhận thấy dấu hiệu bệnh và tỷ lệ
MrNV có dạng lập thể 20 mặt (icosaherdral), trần không có vỏ bọc, thƣờng định
vị trong tế bào chất của tế bào chủ, phát triển trong tất cả các bộ phận của tôm càng
xanh bị bệnh ngoại trừ gan và tụy tạng, MrNV có kích thƣớc lớn hơn XSV và có
đƣờng kính 20 - 30 nm đƣợc quan sát trong kính hiển vi điện tử (Acier và cộng
sự,1999). MrNV có vật liệu di truyền là hai sợi đơn RNA (RNA -1 và RNA - 2), với
kích thƣớc tƣơng ứng là 2,9 kb và 1,3 kb, và tham gia cấu trúc capsid với một chuỗi
polypeptide có kích thƣớc 43 kDa. Dựa vào đặc tính và kết quả giải trình tự đoạn
RNA1 của MrNV, Bonami và cộng sự (2005) đề nghị MrNV là thành viên của họ
Nodaviridae, nhƣng khác biệt với hai loài Alphanodavirus và Betanodavirus.
9
alpha-nodaviruses
FHV BoV
NoV
o
V
BBV 10
sinh mầm bệnh. Theo Widada và Bonami (2004) giả thuyết rằng XSV không có gen
mã hoá cho RNA polymerase. Vậy yếu tố nào cung cấp và cần cho XSV cộng hƣởng.
Hay XSV cộng hƣởng và làm giảm mức độ nghiêm trọng của bệnh. Sự cộng hƣởng
này ít thấy trong những virus. Những virus cộng hƣởng (dependovirus) này vừa đƣợc
biết trong khoảng thời gian gần đây (Van Regenmortel và cộng sự, 2000), và chúng
phụ thuộc vào hiệu quả sự sao chép của những virus giúp đỡ (helper virus) nhƣ
adenovirus hoặc herpes virus. Những virus giúp đỡ này có đƣờng kính 20 nm, có vật
liệu di truyền là ss - DNA (4,7 kb), chứa một gen DNA polymerase. Một nhóm virus
khác là thể satellite virus, nhóm virus này thì sống sót khi thiếu một gen polymerase
cần cho sự sao chép của chúng (Van Regenmortel và cộng sự, 2000). Điều này cho
thấy là XSV sử dụng enzym RNA polymerase của MrNV nhƣng XSV sẽ mã hoá một
chức năng cần thiết cho sự phát triển của MrNV hay làm phát sinh thêm mầm bệnh
của MrNV thì không biết đƣợc (Widada và Bonami, 2004). Nhƣng XSV thiếu một
enzym sao chép thì XSV thật sự là một satellite virus (Widada và Bonami, 2004).
XSV liên quan gần phân nhóm 2 (tobacoo nercrosis satellite virus - like) hơn là phân
chất của enzyme alkaline phosphatase để thực hiện phản ứng tạo màu ngay trên màng
lai. Phản ứng dƣơng tính (tạo màu) chỉ xảy ra khi có RNA của MrNV trên màng lai
(Widada và cộng sự, 2003).
2.3.3. Phƣơng pháp lai tại chỗ (in situ hybridization)
Mẫu tôm càng xanh đƣợc cố định Davidson và đƣa vào trong paraffin. Mẫu
tôm đƣợc cắt khoảng 7 m và đƣợc đặt trên lam kính và đƣợc làm khô trong tủ sấy ở
(60
0
C). Lát cắt qua nhiều bƣớc xử lý, cho lai với mẫu dò DNA đƣợc đánh dấu
digoxigenin có gắn Alkaline phosphatase (AP), Anti - Digoxigenin sẽ kết hợp với
Digoxigenin theo nguyên tắc phản ứng kháng nguyên - kháng thể. Sau bƣớc này
những phân tử lai đặc hiệu giữa DNA/RNA của mẫu đính trên lame và mẫu dò đƣợc
gắn thêm Anti - DIG kết hợp với enzyme Alkaline phosphatase. Sau bƣớc rửa Anti -
DIG thừa và nhuộm màu, quan sát dƣới kính hiển vi thấy những tế bào kết tủa màu tím
đen, màu này cho biết sự hiện diện tƣơng ứng RNA của MrNV, mẫu âm tính có màu
vàng cam sau quá trình lai. Việc kết tủa đã đƣợc quan sát trong tế bào chất, vài phản
ứng dƣơng thì cũng đƣợc quan sát xung quanh vùng cơ hoại tử. Không có dấu hiệu của
virus đƣợc quan sát trong mang, gan, tụy tạng hoặc biểu mô ống tiêu hoá và biểu bì cơ
(Widada và cộng sự, 2003). 12
13
Phƣơng pháp PCR do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 cho phép làm
tăng bội DNA cần đƣợc nghiên cứu. PCR đƣợc thực hiện in vitro theo con đƣờng
enzyme (Bùi Trang Việt, 2002).
Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ
mạch khuôn đều cần hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn DNA
ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase
sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Phƣơng pháp PCR đã đƣợc hình thành dựa
vào cấu trúc đặc tính đó của các DNA polymerase. Thực vậy, nếu ta cung cấp hai mồi
chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA, ta sẽ chỉ tổng hợp đoạn
DNA nằm giữa hai mồi. Điều đó có nghĩa là để khuếch đại một trình tự DNA xác
định, ta phải có thông tin tối thiểu về trình tự đó đủ để tạo các mồi bổ sung chuyên
biệt, các mồi này gồm mồi xuôi (sens primer), mồi ngƣợc (antisnes primer).
2.3.5.2. Phản ứng PCR
Phản ứng PCR là một chuỗi những chu kỳ nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm ba bƣớc:
Bƣớc 1: giai đoạn biến tính (denaturation), trong một dung dịch phản ứng bao
gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA đƣợc biến tính cao hơn Tm
của phân tử; thƣờng là 94 - 95
0
C trong 30 - 60 giây. Mạch đôi DNA tách thành mạch
đơn.
Bƣớc 2: giai đoạn lai (anealation) nhiệt độ đƣợc hạ thấp hơn Tm của các mồi,
cho phép các mồi bắt cặp với mạch khuôn. Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động
trong khoảng 40 - 70
0
C, tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 - 60 giây.
Bƣớc 3: giai đoạn tổng hợp (elongation), nhiệt độ đƣợc tăng lên 72
phép khuếch đại bản mẫu là RNA thông qua sự hình thành cDNA.
Nồng độ enzyme tối ƣu trong khoảng 1 -> 5 đơn vị trên một phản ứng.
Mồi và nhiệt độ lai:
Mồi là chỉ tiêu quan trọng để đạt đƣợc sự khuếch đại đặc trƣng, chuyên biệt
và có đặc hiệu cao. Việc chọn mồi phải tuân theo một số nguyên tắc:
Trình tự của mồi đƣợc chọn sao cho không thể có sự bắt cặp bổ sung giữa
mồi “xuôi” và mồi “ngƣợc”, cũng không có những cấu trúc kẹp tóc do sự bắt cặp khác
nhau của một mồi.
Nhiệt độ nóng chảy của mồi “xuôi” và mồi “ngƣợc”, không cách nhau quá
xa. Thành phần nucleotide của các mồi cân bằng, tránh các cặp G - C lặp lại quá nhiều lần.
Các mồi chọn cần phải đặc trƣng cho trình tự DNA cần khuếch đại,
không trùng với trình tự lặp lại trên gen.
Trình tự nằm giữa mồi “xuôi” và mồi “ngƣợc” không quá lớn, phản ứng
PCR sẽ tối ƣu trên những trình tự nhỏ hơn 1kb.
2.3.5.4. Các thành phần khác của phản ứng PCR
Bốn loại nucleotide thƣờng đƣợc sử dụng ở nồng độ 20 - 200 M/mỗi
nucleotide. Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại “ký sinh”. Sự mất cân bằng trong
các thành phần trong thành phần các nucleotide lại làm tăng các lỗi sao chép của
polymerase. 15
Mg
2+
là cofactor cho hầu hết các DNA polymerase, đặc biệt là các DNA
polymerase chịu nhiệt. Nồng độ Mg
2+
ảnh hƣởng mạnh tới quá trình chạy PCR. Nồng
độ Mg
biến tạo thành các DNA, sau đó dùng cùng loại men cắt giới hạn, DNA bình thƣờng
phân biệt với DNA đột biến qua sự sai biệt trọng lƣợng phân tử (Bùi Trang Việt, 2002).
Do Taq polymerase sử dụng trong bƣớc PCR không hoạt động trên RNA nên
trƣớc hết cần chuyển RNA thành cDNA nhờ enzym phiên mã ngƣợc (reverse
transcriptase). Sau đó cDNA sẽ đƣợc nhân bản nhờ Taq polymerase (Walker, 2000).
Dấu hiệu xác định bệnh là sản phẩm nhân bản một đoạn gene đặc hiệu của virus. Sự
hiện diện của sản phẩm đƣợc nhận biết qua điện di trên gel agarose.
Copyright: Tài liệu đại học ©