BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
*************
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU LÊN MEN ACID ACETIC
BẰNG DỊCH ÉP TRÁI ĐIỀU
Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2001 – 2005
Sinh viên thực hiện: BÙI HOÀNG VĂN
Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2005
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
*************
NGHIÊN CỨU LÊN MEN ACID ACETIC
BẰNG DỊCH ÉP TRÁI ĐIỀU
Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:
TS.TRỊNH VĂN DŨNG BÙI HOÀNG VĂN
Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2005
LỜI CẢM TẠ
Chúng tôi xin chân thành cảm tạ:
- Ban Giám hiệu trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ
nhiệm Bộ Môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt
kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường.
- TS. Trònh Văn Dũng – giảng viên Trường Đại học Bách Khoa TP.Hồ Chí
Minh đã hết lòng hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp.
- Thầy Nguyễn Só Xuân Ân, cùng tất cả thầy cô trong phòng thí nghiệm Bộ
Môn Máy và Thiết bò – Trường Đại học Bách Khoa TP.Hồ Chí Minh đã hết

- Phương pháp lên men nhanh có thời gian lên men ngắn hơn nhiều so với
phương pháp chậm.
- Lưu lượng lỏng thích hợp nhất cho quá trình lên men giấm theo phương pháp
lên men nhanh là 80 ml/phút.
ii
- Khả năng dùng thân tre làm vật liệu bám cho vi khuẩn giấm .
MỤC LỤC
TRANG
Lời cảm ơn.................................................................................................................i
Tóm tắt.....................................................................................................................ii
Mục lục ...................................................................................................................iii
Danh sách các bảng................................................................................................vii
Danh sách các hình và sơ đồ.................................................................................viii
Danh sách các phụ lục...........................................................................................viii
1. MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề........................................................................................................1
1.2 Mục đích, yêu cầu............................................................................................2
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Tính chất và ứng dụng của acid acetic.............................................................3
2.1.1 Tính chất hóa lý của acid acetic.................................................................3
2.1.1.1 Tính chất vật lý.....................................................................................3
2.1.1.2 Tính chất hóa học..................................................................................3
2.1.2 Ứng dụng của acid acetic............................................................................5
2.1.2.1 Ứng dụng trong ngành cao su................................................................5
2.1.2.2 Ứng dụng trong ngành công nghiệp khác.............................................5
2.1 Các phương pháp sản xuất acid acetic.............................................................6
2.2.1 Sản xuất acid acetic bằng phương pháp hóa học........................................6
2.2.2 Sản xuất acid acetic bằng phương pháp hóa gỗ..........................................7
2.2.3 Sản xuất acid acetic bằng phương pháp vi sinh..........................................8
2.2.4 Sản xuất acid acetic bằng phương pháp hỗn hợp........................................9

2.4.3 Sự hình thành và phát triển của màng sinh học trên chất mang trong
iv
Fermenter sử dụng màng sinh học cố đònh để lên men acid acetic.............26
2.4.3.1 Trạng thái vi khuẩn acid acetic trong fermenter.................................26
2.4.3.2 Cấu tạo màng vi khuẩn acid acetic.....................................................27
2.4.3.3 Sự phát triển của màng vi khuẩn acid acetic......................................27
2.4.3.4 Bề dày màng vi khuẩn acid acetic......................................................28
2.5 Khái quát về nguồn nguyên liệu điều............................................................29
2.5.1 Cây điều – đặc điểm thực vật học của cây điều.......................................29
2.5.1.1 Nguồn gốc và tên gọi..........................................................................29
2.5.1.2 Đặc điểm thực vật học........................................................................30
2.5.1.3 Thành phần hóa học của quả điều......................................................31
2.5.1.4 Tình hình ở Việt Nam.........................................................................32
2.5.2 Hợp chất polyphenol – tanin.....................................................................33
3.5.2.1 Một số tính chất cơ bản của tanin.......................................................33
3.5.2.2 Các phương pháp tách tanin ra khỏi dòch quả điều.............................34
3 – VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và đòa điểm thực hiện....................................................................38
3.2 Vật liệu..........................................................................................................38
3.2.1 Thiết bò.....................................................................................................38
3.2.1.1 Thiết bò chính......................................................................................38
3.2.1.2 Các thiết bò phụ...................................................................................39
3.2.1.3 Các hóa chất và dụng cụ thí nghiệm khác..........................................39
3.2.2 Nguyên liệu..............................................................................................40
3.2.2.1 Giống vi khuẩn giấm...........................................................................40
3.2.2.2 Thành phần môi trường cấy giống......................................................40
3.2.2.3 Nguyên liệu trái điều..........................................................................41
3.2.2.4 Gelatin................................................................................................42
3.2.2.5 Phương pháp xử lý nguyên liệu trái điều............................................42
3.3 Phương pháp thí nghiệm.................................................................................42

5 – KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ...............................................................................64
6 – TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................66
DANH SÁCH CÁC BẢNG
TRANG
Bảng 2.1: Thành phần hóa học của quả điều.........................................................31
Bảng 2.2: Lượng vitamin C và muối khoáng trong một số loại quả.......................32
Bảng 3.1: Thành phần của môi trường cấy giống...................................................41
Bảng 4.1: Kết quả xử lý gelatin trong dòch quả điều bằng gelatin.........................50
Bảng 4.2: Kết quả lên men acid acetic các dòch nước điều có hàm lượng tanin còn
sót khác nhau..........................................................................................................52
Bảng 4.3: Nồng độ acid acetic (%) ở các dòch lên men có độ Brix khác nhau.......54
Bảng 4.4: Độ Brix trước và sau khi lên men...........................................................54
Bảng 4.5: Nồng độ acid acetic (%) theo phương pháp lên men nhanh và độ tích lũy
acid acetic theo thời gian........................................................................................56
Bảng 4.6: Nồng độ acid acetic (%) thu được theo phương pháp nhanh và phương
pháp chậm..............................................................................................................58
Bảng 4.7: Nồng độ acid acetic (%) theo phương pháp nhanh với các lưu lượng lỏng
khác nhau................................................................................................................60
Bảng 4.8: Kết quả kiểm tra đònh tính các tính chất của chất mang chế tạo từ tre. .63
vii
DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ
HÌNH TRANG
Hình 2.1: Thiết bò lên men nhanh bằng phương pháp trống quay........................23
Hình 2.2: Thiết bò lên men nhanh bằng phương pháp nhúng...............................23
Hình 2.3: Thiết bò lên men nhanh bằng phương pháp cố đònh..............................24
Hình 2.4: Biểu diễn màng sinh học bám trên các vật rắn trơ...............................27
Hình 3.1: Vật liệu mang vi khuẩn acid acetic làm từ thân tre..............................39
Hình 3.2: Nguyên liệu trái điều...........................................................................41
Hình 3.3: Sơ đồ xử lý nguyên liệu trái điều.........................................................42
Hình 3.4: Tháp lên men trước và sau khi cấy giống vi khuẩn acid acetic............43

nông nghiệp có khí hậu nhiệt đới nên các nguyên liệu này rất dồi dào, đặc biệt là
quả điều. Điều được trồng chủ yếu để lấy hạt, nhưng hạt chỉ chiếm 15% khối lượng
cả trái điều còn phần trái chiếm tỷ lệ lớn (85%) nhưng không được sử dụng một
cách có hiệu quả. Nước ép quả điều có hàm lượng đường, khoáng vi lượng, đa
lượng, các vitamin cao rất thích hợp cho các quá trình lên men vi sinh, vì thế có thể
dùng để sản xuất acid acetic rất thích hợp. Tuy nhiên, nước điều chứa hàm lượng
tanin cao (0,2 – 0,4%) ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật, gây vò chát
mạnh cho sản phẩm, cho nên cần phải loại bỏ ra khỏi dòch ép trái điều.
Nhằm mục đích nâng cao hiệu quả sản xuất, tận dụng nguồn nguyên liệu dồi
dào trong nước (nước ép trái điều) và tìm kiếm vật liệu ở trong nước làm chất
mang vi khuẩn giấm để thay thế cho gỗ sồi trong phương pháp lên men nhanh,
được sự đồng ý của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Nông Lâm
TP.Hồ Chí Minh và sự hướng dẫn tận tình của TS. Trònh Văn Dũng – giảng viên
Trường Đại Học Bách Khoa TP.Hồ Chí Minh, chúng tôi tiến hành đề tài “nghiên
cứu lên men acid acetic bằng dòch ép trái điều”
11.2 Mục đích yêu cầu
- Khảo sát phương pháp xử lý nguyên liệu: tách tanin ra khỏi dòch ép trái điều bằng
gelatin nhằm tìm ra hàm lượng gelatin thích hợp, có hiệu quả trong xử lý nguyên
liệu cho quá trình lên men giấm.
- Khảo sát lên men giấm từ nước ép trái điều theo phương pháp lên men chậm và
lên men nhanh.
- Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men giấm theo phương pháp
chậm và lên men nhanh.
- Khảo sát khả năng thay thế của thân tre làm chất mang vi khuẩn acid acetic.
2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Tính chất và ứng dụng của acid acetic

chất của nó, tính chất này không có ở các acid cùng dãy đồng đẳng với nó.
- Acid acetic có tác dụng phân hủy da, gây bỏng, ăn mòn nhiều kim loại và hợp
kim, hòa tan tốt nhiều chất vô cơ. Trong dung dòch acid acetic tồn tại các dạng
(CH
3
COOH)
2
, (CH
3
COOH)
3
, sự tồn tại các phân tử kép như trên là do các liên kết
hydro giữa các phân tử với nhau. Khi hòa tan trong nước thì tỷ trọng tăng do giảm
thể tích, sự giảm thể tích lớn nhất xảy ra khi cho1 mol acid tác dụng với 2 mol
nước, nhận được dung dòch chứa 62,5% acid có công thức CH
3
COOH.(H
2
O)
2
.
2.1.1.2 Tính chất hóa học
Các tính chất hóa học của acid acetic được qui đònh bởi sự có mặt của nhóm
cacboxyl trong phân tử. Acid acetic có khả năng trung hoà các bazơ, oxit bazơ, đẩy
acid cacbonic ra khỏi muối của nó:
CH
3
COOH  CH
3
COO

3
COO)
2
Ca + CO
2
 + H
2
O
Các kim loại tự do có thể thay thế hydro trong acid acetic:
CH
3
COOH + Na  CH
3
COONa + 1/2H
2

Acid acetic bền với các tác nhân oxi hóa mạnh như cromit, permanganat kali.
Tính chất được ứng dụng để tinh chế acid acetic ra khỏi các tạp chất hữu cơ. Hơi
acid có thể chòu nhiệt đến 400
o
C, khi đun nóng quá 420
o
C thì hơi này bò phân huỷ
thành aceton, cacbonic và nước:
CH
3
COOH  (CH
3
)
2

> 300
o
C)
Acid acetic tạo với các acid mạnh thành một hợp chất kép dạng [CH
3
COOH].X,
trong đó X là cation acid, và pha loãng thì phản ứng với acid nitric bốc khói tạo
thành diacetylnitric
CH
3
COOH + H
2
SO
4
[ CH
3
COOH].[SO
4
H
2
]
CH
3
COOH + SO
3
CH
2
SO
3
HCOOH

2
 2CH
3
CONH
2
+ H
2
O + CO
2
CH
3
COOH + H
2
NCN CH
3
CONHCONH
2
2.1.2 Ứng dụng của acid acetic
2.1.2 Ứng dụng trong ngành cao su
Trong ngành công nghiệp cao su, acid acetic là chất có vai trò quan trọng dùng
để đông tụ mủ cao su.
Để bảo vệ mủ nước không bò đông đặc trước khi về đến nhà máy chế biến,
người ta cho thêm vào mủ nước những chất chống đông, thường là dung dòch NH
3
.
Thời điểm cho amoniac vào mủ là lúc trút mủ vào xô, thùng,….Tuỳ theo chủng loại
yêu cầu sản xuất mà ta chọn cách đánh đông khác nhau.
Mủ được pha loãng với nước đến nồng độ cao su khô (DRC) khoảng 14%, pH =
7. Tuy nhiên, tùy theo hệ thống máy cán ép mà có thể thay đổi độ pH hoặc DRC
theo yêu cầu của từng tấm cao su cán ra.

H
2
hay C
2
H
5
OH, C
2
H
4
tiến hành tổng hợp có xúc tác sẽ thu được
acetaldehyt, oxy hóa acetaldehyt nhờ có xúc tác ở nhiệt độ và áp xuất cao sẽ thu
được acid acetic






+=
≡
2
2
1
22
2
O CH CH
OH + CH CH
 CH
3

gỗ,…. Từ giấm gỗ, tách được acid acetic bằng muối kim loại hay bằng một trong các
quá trình tách trực tiếp
- Sản xuất acid acetic từ bột gỗ:
Trong quá trình chưng cất gỗ cho bay hơi lên đi qua nước vôi ta thu được muối
của acid acetic (canxi acetat) ít tan, kết tủa cùng với các hợp chất khác gọi là bột
giấm gỗ. Phân huỷ bột giấm gỗ bằng H
2
SO
4
hay HCl sau đó lọc sạch và thu acid
acetic bằng cách chưng cất.
-Tách acid acetic trực tiếp từ nước ngưng tụ khi chưng gỗ
Để tách acid acetic từ bột giấm gỗ cần tiêu tốn nhiều vật liệu phụ, nhiên liệu và
năng lượng khá lớn nên tìm cách tách acid acetic trực tiếp từ nước ngưng khi chưng
gỗ như sau:
Sau khi ngưng tụ hơi chưng gỗ, để lắng và tách ra được hai lớp:
+ Lớp nhẹ ở trên là chất lỏng chứa lượng acid acetic không đáng kể
+ Lớp dưới chính là nhựa do acid acetic cùng với một số chất khác keo tụ lại,
đem gia công nó người ta thu được acid acetic và nhiều chất khác.
7
2.2.3 Sản xuất acid acetic bằng phương pháp vi sinh
Việc ứng dụng các quá trình có vi sinh vật tham gia để sản xuất rượu,bia,
muối dưa, làm tương,… đã được con người phát hiện và sử dụng từ xa xưa.
Đến cuối thế kỉ XVII, con người đã phát hiện ra vi sinh vật nhưng thực tế phải
sau những cống hiến của Louis Pasteur thì khoa học về vi sinh mới chính thức ra
đời.
Ngày nay, trong lónh vực khoa học kỹ thuật nói chung và kỹ thuật thực phẩm
nói riêng, ngành vi sinh vật đã và đang là cơ sở cho kỹ thuật sản xuất nhiều thực
phẩm, dược phẩm,…
Vi sinh vật có khả năng phát triển kỳ diệu và có khả năng xúc tác đặc hiệu các

acetic từ dung dòch lên men này.
2.2.5 Phân tích – lựa chọn phương pháp sản xuất acid acetic
Trong bốn phương pháp sản xuất acid acetic đã nêu trên, hiện nay trên thế
giới chiếm ưu thế nhất là phương pháp tổng hợp hóa học, nhất là ở các nước phát
triển vì phương pháp này có hiệu quả kinh tế cao do thiết bò tương đối gọn nhẹ,
năng suất cao, acid thu được có nồng độ cao và ít tạp chất.
Phương pháp hỗn hợp vẫn còn ở giai đoạn thăm dò chưa có qui trình nào được
sử dụng rộng rãi vì hiệu quả kinh tế không cao, hệ thống phức tạp, không cạnh
tranh được với acid acetic tổng hợp và hóa gỗ.
Phương pháp hóa gỗ vẫn còn được sử dụng ở những nước có nhiều gỗ và nói
chung trong khuôn khổ tổng hợp sử dụng gỗ, nhưng sản lượng của phương pháp này
chỉ chiếm 10% tổng sản lượng acid acetic sản xuất hàng năm trên thế giới.
9
Còn phương pháp sinh hóa hiện nay trên thế giới đang dùng để sản xuất giấm
ăn và giấm cho công nghiệp thực phẩm.
Ở Việt Nam, khi lựa chọn phương pháp sản xuất acid acetic phải chú ý nguồn
nguyên liệu, thiết bò và trình độ kỹ thuật cũng như nhu cầu sử dụng acid acetic và
khuynh hướng chung của tiến bộ khoa học kỹ thuật trên thế giới.
Ở các nước phát triển, acid acetic được dùng chủ yếu trong công nghiệp tổng
hợp hữu cơ vì vậy yêu cầu acid acetic phải có nồng độ cao, sạch, ít tạp chất. Ngoài
việc dùng làm giấm ăn, hiện nay acid acetic còn được dùng làm vật liệu phụ trong
công nghiệp sản xuất cao su thô, do đó nồng độ không cần cao lắm nhưng vấn đề
tạp chất đòi hỏi rất khắt khe.
Hiện nay, chưa thể đặt vấn đề sản xuất acid acetic bằng phương pháp tổng hợp
vì nước ta vẫn chưa có đủ điều kiện để đáp ứng được những yêu cầu của phương
pháp này. So với phương pháp tổng hợp, phương pháp hóa gỗ có đơn giản hơn về
mặt quá trình và thiết bò nhưng với yêu cầu khắt khe về mặt bảo vệ môi trường
hiện nay thì việc tiến hành phương pháp nàysẽ gặp nhiều khó khăn về mặt nguyên
liệu.
Trong khi đó công nghệ vi sinh hiện nay và trong tương lai phát triển mạnh mẽ,

thành NADPH
2
) được chuyển qua chuỗi hô hấp để thu nhận năng lượng, song cơ
chất không bò phân giải hoàn toàn nên được gọi là quá trình oxy hóa không hoàn
toàn.
2.3.2 Cơ chế phản ứng của quá trình lên men acid acetic
Lên men giấm là quá trình oxy hóa rượu etylic thành acid acetic nhờ có
enzym alcohol oxydase xúc tác trong điều kiện hiếu khí:
11
CH
3
CH
2
OH + O
2
= CH
3
COOH + H
2
O + 117KCal
Để chuyển hóa thành acid acetic, rượu và oxy phải thâm nhập vào tế bào vi
khuẩn, ở đây nhờ có enzym của vi khuẩn xúc tác, rượu được chuyển hóa thành acid
acetic theo một quá trình sau:
CH
3
CH
2
OH +
2
1

môi trường hết rượu, vi khuẩn giấm sẽ oxy hóa acid actic thành CO
2
và nước theo
phương trình sau:
CH
3
COOH + 2O
2
= 2CO
2
+ 2H
2
O
Đây chính là sự “quá oxy hóa” rất có hại cho quá trình lên men giấm. Vì vậy,
trong lên men phải có dư một lượng rượu khoảng 0,3 - 0,5% để đảm bảo không bao
giờ cho oxy hóa hết rượu.
2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến qúa trình lên men acid acetic
2.3.3.1 Ảnh hưởng của hàm lượng oxy (O
2
)
Theo cơ chế phản ứng, giấm hóa là phản ứng dehydro hóa. Trong đó, oxy
hóa đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men. Từ phản ứng trên ta thấy, để
oxy hóa hết 1 mol rượu thì cần có 1mol O
2
tự do, tức là để oxy hết 1 kg rượu thì
cần 2,3 m
3
không khí (tính theo 20,9% O
2
).

trường acid là một chất độc đối với nhiều vi sinh vật.
- Cho vào dòch lên men một lượng vi khuẩn cần thiết để bổ sung lượng giấm.
Lượng giấm đưa vào là tùy yêu cầu của phương pháp sản xuất.
Khi sản xuất giấm theo phương pháp nhanh, cần đưa vào dòch lên men một
lượng acid acetic sao cho thoả mãn hai mục đích trên, đồng thời phải có nồng độ
nhỏ hơn ngưỡng có tác dụng ức chế cho chính bản thân vi khuẩn, với nồng độ 8%
13
acid acetic thì vi khuẩn giấm hoạt động rất kém. Vì vậy hàm lượng acid acetic có
thể dao động trong khoảng 1 - 7%.
2.3.3.4 Hàm lượng rượu
Tuỳ từng loại vi sinh vật mà chúng có khả năng tồn tại trong nồng độ rượu
khác nhau, thường sử dụng nồng độ từ 2 - 10%V. Theo Ebner (1985) và Heirich
(1987) thì lượng rượu etylic sử dụng từ 2 - 10%V.
Để tránh hiện tượng oxy hóa tiếp tục acid acetic đến CO
2
và H
2
O cần có một
lượng rượu dư trong giấm từ 0,3 - 0,5%V. Lượng rượu sót trong giấm có tác dụng ức
chế sự tổng hợp enzym oxy hóa acid acetic và muối axetat (Dires, 1973).
2.3.3.5 Các chất dinh dưỡng
Trong cơ thể vi sinh vật có khoảng 40 hợp chất khoáng khác nhau có thể ở
dạng tự do hay liên kết hữu cơ cao phân tử, thông thường tổng hàm lượng khoáng
trong vi khuẩn chiếm khoảng 5 - 8% trọng lượng chất khô. Các chất khoáng chia
làm hai loại:
- Khoáng đa lượng: S, P, K, Na, Fe, Mg, Cu,…
- Khoáng vi lượng: Cl, Br, I, As, Pb, Zn, Mn,…
Do đó, để cho vi khuẩn giấm phát triển tốt, khi sản xuất giấm ngoài các chất:
nước, acid, rượu thì cần đưa vào môi trường lên men các muối tan có chứa các
nguyên tố khoáng cần thiết. Nếu sản xuất giấm từ rượu vang, bia, nước quả ép,…thì

15