TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
________________________
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP
TÊN ĐỀ TÀI:
NGHIÊN CỨU SO SÁNH SỰ PHÁT TRIỂN SINH KHỐI VÀ
HÀM LƯỢNG β-GLUCAN Ở MỘT SỐ CHỦNG NẤM HƯƠNG
NUÔI CẤY TRONG MÔI TRƯỜNG LỎNGHÀ NỘI – 2010
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này
là trung thực và chưa hề được sử dụng trong các công bố khoa học nào trước
đây.
Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận này
đã được cảm ơn và các thông tin được trích dẫn trong khóa luận này đã được ghi
rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày 24 tháng 5 năm 2010
Bùi Thị Kim Tuyền
i
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này ngoài sự cố gắng của bản thân tôi
đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ của cá nhân và tập thể. Trước hết tôi xin bày
tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Duy Lâm - Giám đốc Trung tâm Nghiên
cứu và Kiểm tra chất lượng nông sản thực phẩm – Viện Cơ điện nông nghiệp và
Công nghệ sau thu hoạch đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện và hoàn
thành khóa luận tốt nghiệp này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô Khoa Công nghệ thực phẩm trường
ĐH Nông nghiệp Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu để
PDR ................................................................................................................... 32
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Một số loại β-glucan..........................................................................6
Bảng 4.1. Đường kính (mm) hệ sợi của các chủng giống nấm Hương trên
môi trường PDA...............................................................................................30
iii
Bảng 4.2. Khối lượng sinh khối sợi nấm khô của các chủng nấm Hương nuôi
cấy trong môi trường lỏng PDR sau 22 ngày..................................................33
Bảng 4.3. Hàm lượng glucan của các chủng nấm Hương..............................36
iv
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 2.1. Liên kết β-1,3 glicozit và β-1,6 glicozit............................................7
Hình 2.2. Liên kết β-1,3; glicozit β-1,6 glicozit và β-1,3:β-1,6 glicozit của
phân tử β-glucan.................................................................................................7
Hình 2.3. Công thức cấu tạo Lentinan.............................................................12
Hình 2.4. Đường cong sinh trưởng của vi sinh vật.........................................18
Hình 4.1. Sự phát triển của 3 chủng nấm Hương sau 6 ngày nuôi cấy trên
môi trường thạch PDA (Từ trái qua phải là các chủng Ld, Lg, Lc)...............32
Hình 4.2. Sự phát triển của 3 chủng nấm Hương sau 9 ngày nuôi cấy trên
môi trường thạch PDA (Từ trái qua phải là các chủng Ld, Lg, Lc)...............32
Hình 4.4. Sự thay đổi đường kính hệ sợi nấm của các chủng nấm Hương....42
Hình 4.6. Sự phát triển sinh khối sợi nấm Hương sau 22 ngày nuôi cấy trong
môi trường lỏng PDR của các chủng nấm Ld (trên cùng), Lg (ở
giữa), Lc (hình dưới cùng)...............................................................................44
v
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU
1. APPIF (acute phase protein-inducing factor): là một dạng phân tử của
interleukin.
2. AZT (Azido-Thymidine): là một chất có tác dụng ngăn cản sự nhân lên
của virus bằng cách tác động vào quá trình ARN của virus HIV.
bổ dưỡng có lợi cho sức khỏe. Ngày nay các nhà khoa học càng khẳng định hơn
nữa giá trị dinh dưỡng và dược tính của loại thực phẩm vừa là rau vừa là thịt
này. Nấm ăn được gọi là loại thực phẩm vừa là rau vừa là thịt vì nó có rất ít chất
béo, cung cấp ít năng lượng nhưng lại rất giàu protein và axít amin. Trong các
loại nấm ăn thì phải kể đến nấm Hương (Lentiluna edodes). Nấm Hương rất
quen thuộc trong ẩm thực của cả phương Đông lẫn phương Tây. Hiện nay, nấm
Hương được xếp vào nguồn cung cấp thực phẩm chức năng. Nấm Hương đem
lại giá trị dinh dưỡng cao, có chứa tới gần 40 loại enzym và axit amin cần thiết
đối với cơ thể người. Nấm Hương chứa nhiều chất có hoạt tính sinh học cao (β-
glucan, Eritadinin, LEM) giúp tăng cường miễn dịch, hạ cholesterol và men gan
[3].
Do nấm Hương có giá trị dinh dưỡng cao lại chứa các hoạt chất sinh học
có lợi cho sức khỏe nên các nhà khoa học không ngừng nghiên cứu về nó. Theo
kết quả của nhiều nghiên cứu thì hệ sợi nấm Hương cũng chứa tương đối đầy đủ
về số lượng và chất lượng các hoạt chất sinh học và dinh dưỡng như ở trong thể
1
quả [21]. Việc nuôi cấy hệ sợi nấm cho phép rút ngắn thời gian, không đòi hỏi
điều kiện nhiệt độ khắt khe như nuôi trồng nấm thu thể quả. Mặt khác việc nuôi
cấy hệ sợi nấm Hương lại hoàn toàn có thể sử dụng phương pháp nuôi cấy trong
môi trường lỏng [9]. Hiện nay trên thế giới việc nghiên cứu sự phát triển của các
loại nấm ăn (nấm Hương, nấm Sò...) cũng như nấm dược liệu (nấm Linh Chi)
trong môi trường lỏng là rất phổ biến. Trong khi nước ta có nguồn gen nấm
Hương phong phú, có nhiều giống nấm địa phương, rất có điều kiện để phát
triển sản xuất sinh khối nhưng trong nuôi trồng nấm chưa có làm giống lỏng,
chưa sản xuất sinh khối. Phổ biến ở nước ta là kỹ thuật nuôi trồng nấm trên giá
thể rắn lấy thể quả. Do đó việc nghiên cứu nuôi cấy nấm trong môi trường lỏng
có ý nghĩa vô cùng lớn.
Bên cạnh đó khả năng nấm Hương cho sinh khối và hàm lượng hoạt chất
sinh học nhiều hay ít còn phụ thuộc rất nhiều vào chủng giống nấm. Dù với bất
kỳ mục đích nào như thu sinh khối sợi hay hoạt chất sinh học để sản xuất thực
phiến tương đối rộng và có khuynh hướng bám vào cuống nấm. Mặt trên tai nấm
màu nâu, mặt dưới có nhiều bản mỏng xếp lại. Thịt nấm màu trắng, cuống hình
trụ [1].
2.1.1.2. Đặc tính sinh học của nấm Hương
Chu trình sống của nấm Hương: đảm bào tử nảy mầm cho hệ sợi sơ cấp.
Hai sợi sơ cấp khác phải phối hợp cho hệ sợi thứ cấp. Hệ sợi thứ cấp phát triển
thành mạng hệ sợi. Trong điều kiện thuận lợi mạng hệ sợi sẽ kết hạch tạo tiền
3
quả thể (nụ nấm). Nụ nấm tiếp tục lớn dần cho tai nấm trưởng thành, các phiến
dưới mũ mang các đảm và sinh ra bào tử. Đảm bào tử được phóng thích và chu
trình lại tiếp tục.
Giai đoạn phát triển của hệ sợi nấm Hương: Chu trình bắt đầu tử bào tử
đảm nảy mầm cho hệ sợi nấm Hương, sợi nấm lúc đầu nhỏ khoảng 1,5 - 1,0 mm
đường kính, về sau lớn dần lên đến kích thước đường kính 1,0 - 2,0 mm. Sau
quá trình tiếp hợp giữa hai sợi nấm sơ cấp đơn nhân sẽ hình thành nên các sợi
nấm thứ cấp song nhân. Các sợi nấm tăng trưởng theo kiểu tạo ra các móc
(clamp) và để lại dấu vết giữa các tế bào. Khi gặp điều kiện bất lợi các sợi nấm
song nhân có thể tạo ra các bào tử màng dày (bào tử áo – chlamydospore) giúp
sợi nấm sống sót qua các trường hợp bất lợi này. Bào tử màng dày khi điều kiện
thuận lợi sẽ nảy mầm tạo ra những sợi nấm mới. Khi sợi nấm thứ cấp đã phát
triển dày đặc trên cơ chất sẽ bắt đầu quá trình phân hóa để tạo ra quả thể. Trước
khi ra quả thể thì hệ sợi nấm Hương này phát triển sinh khối đến mức tối đa
chuẩn bị cho quá trình ra quả thể.
2.1.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của nấm Hương
Nấm Hương ngoài sử dụng trực tiếp nguồn xenlulô còn cần thêm nitơ.
Đạm thích hợp cho nấm chủ yếu ở dạng hữu cơ như: pepton, axit amin, urê và
nhiều loại muối amôni. Nấm Hương không thể sử dụng đạm vô cơ như: nitrat
hay nitrit. Nồng độ thích hợp cho sự tăng trưởng của hệ sợi như là: Sulfat
ammon 0,03% hay Tartrat ammon 0,06% tùy thuộc vào nguồn đạm cung cấp.
Nhưng nếu nồng độ đạm cao hơn 0,02% như với sulfat ammon sẽ ức chế sự phát
các loại axít amin, có tới 9 loại axít amin không thay thế (Izôlơxin, Lơxin, Lixin,
Mêthiônin, Phênylalanin, Valin, Tyrozin, Trytophan, Alanin).
Hơn nữa trong nấm Hương và hệ sợi nấm Hương có tới 40 loại enzym,
một số enzym đáng chú ý như là enzym β (1-3) glucozidaza, kitinaza, lipoidaza,
ligninaza, pepsin, loxintinaza, pectinaza, saccaraza, transferaza, hemixenlulaza,
amylotransferaza, inulaza, glycozidaza, insulinaza, asparaginaza, peroxydaza,
lactaza, tyrozin oxydaza…[2, 21]. Theo Mizuno yếu tố tạo nên hương thơm, vị
5
ngon của nấm là monosodium glutamate, nucleotit, amino axit tự do, chuỗi
peptit, axit hữu cơ (axit malic, axít fumalic, axít glutaric, axít oxalic, axít lactic,
… ) và đường [16].
2.2. HOẠT CHẤT β-GLUCAN
2.2.1. Định nghĩa
β-glucan là một polysaccarit của D-glucose với các liên kết glicozit. β-
glucan là một nhóm các phân tử glucan khác nhau ở khối lượng phân tử, tính
hòa tan, độ nhớt và cấu hình trong không gian. β-glucan thường có trong thành
tế bào thực vật, hạt ngũ cốc, nấm men, nấm và vi khuẩn. Trong tự nhiên β-
glucan có nhiều trong nấm như là nấm Sò, nấm Hương... [14].
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng β-glucan với liên kết (1,3/1,6) có hoạt
tính sinh học cao hơn β-glucan với liên kết (1,4/1,6). Sự khác nhau giữa các mối
liên kết và cấu trúc hóa học β-glucan sẽ ảnh hưởng đến tính hòa tan, hoạt động
và hoạt tính sinh học của chúng. β-glucan càng phân nhánh mạnh hoạt tính sinh
học càng cao [14].
Bảng 2.1. Một số loại β-glucan
Tên Liên kết Glicozit Ghi chú
cellulose β-1, 4
curdlan β-1, 3
laminarin β-1, 3 và β-1, 6
chrysolaminarin β-1, 3
lentinan β-1, 6: β-1, 3 được tách chiết từ edodes Lentinula
lần/tuần hoặc 2mg 1 lần/tuần, đạt mức sống tương ứng là 19,5%, 10,4% và 6,5%
[7]. Kết quả tương tự cũng đạt được trong các ca ung thư ruột già.
8
2.2.2.2. Hoạt tính chống virus, vi khuẩn
β-glucan và các dẫn xuất của nó có tác dụng chống virus, vi khuẩn và ký
sinh trùng thông qua sự tăng cường các phản ứng miễn dịch bằng cách gia tăng
số lượng, kích thước, khả năng của đại thực bào, tăng cường hoạt động của
lymphocyte T và B, về thực chất cũng giống với cơ chế chống ung thư.
Gần đây các nhà nghiên cứu tại Trường Đại học Y ở Yamaguchi Nhật
Bản đã thông báo rằng Lentinan có hiệu ứng “ bảo vệ” (protective effect). Đó là
ức chế sự phá hủy tế bào bình thường do ảnh hưởng của virus HIV. Trên lâm
sàng đã cho thấy khi sử dụng Lentinan cùng với hợp chất AZT (azido-
Thymidine) có thể ngăn chặn virus HIV cao hơn chỉ sử dụng AZT đơn độc đồng
thời giảm độc tính của AZT, đặc biệt sulphat lentinan ức chế rất mạnh hoạt tính
của reverse transcriptase (enzym sao chép ngược của HIV) [21].
Lentinan còn có khả năng giúp những người bị lao phổi chống lại độc tố
của vi khuẩn lao. Nếu sử dụng Lentinan 1g/ngày, mỗi tuần 2 lần thì có thể ngăn
chặn hoàn toàn độc tố của vi khuẩn lao trong cơ thể [3, 20].
2.2.2.3. Hoạt tính kháng sinh
Vi sinh vật có thể gây bệnh theo hai cách sau: Một là chúng gây viêm
bằng cách phá hủy các mô xung quanh. Hai là vi khuẩn sinh ra các độc tố. Các
nhà khoa học đã khẳng định Lentinan kích hoạt việc tăng sản xuất các yếu tố
huyết thanh khác nhau liên quan đến miễn dịch và sự gây viêm.
Sudirman et al. (1996) đã kiểm tra khả nǎng kháng khuẩn của các chủng
nấm shiitake trồng ở Indonesia, chống Rigidoporus lignosus (vi nấm gây mục
trắng cây cao su), Bacillus subtilis,... [3].
Chihara [7] đã chứng minh khả năng của Lentinan trong kháng khuẩn,
kháng virus, kháng nấm bệnh và ký sinh trùng. Đặc biệt, Lentinan làm giảm
9
mạnh ảnh hưởng trong hóa trị liệu lao, chống bội nhiễm khuẩn ở các bệnh nhân
phẩm tiếp xúc trực tiếp với da [6].
Ứng dụng của β-glucan trong nuôi trồng thủy sản: Tôm sú là mặt hàng
xuất khẩu chủ lực của nhiều nước châu Á, trong đó có Việt Nam. Nhưng các
loại bệnh virus và vi khuẩn ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản lượng tôm và dẫn
đến ảnh hưởng tới kinh tế hộ nông dân nói riêng, kinh tế đất nước nói chung. Có
một số nghiên cứu sử dụng β-glucan như một chất kích thích hệ thống miễn dịch
tiềm năng trong nuôi trồng thủy sản [6].
Chang cheng-Fang và cs.(2000) đã nghiên cứu hiệu quả của β-1,3-glucan
lên sự sống sót của tôm sú lớn (Penaeus monodon). Tôm được bổ sung β-1,3-
glucan (2g/kg trọng lượng) trong 40 ngày. Kết quả nhận được cho thấy lượng
tôm sống sót trong lô có bổ sung β-1,3-glucan cao hơn hẳn (p<0,001) so với lô
đối chứng [6].
Kết quả thí nghiệm của Rostad Gunnar và cs.(1995) cho thấy khi bổ sung
β-glucan vào thức ăn hàng ngày của cá hồi Atlantic (Salmo salar) với hàm lượng
1g/kg thức ăn trong 12 tuần trước khi nhiễm nguồn bệnh, lượng cá sống sót tăng
lên rất nhiều [6].
2.2.4. β-glucan trong nấm Hương
Trong nấm Hương chứa một lượng β-glucan, tên là Lentinan. Lentinan là
một β-glucan có chứa các liên kết glicozit β-1,3: β-1,6. Lentinan là một
polysaccarit không chứa nitơ, trọng lượng phân tử xấp xỉ 500 000 Da [14].
Lentinan được chiết suất từ thể quả cũng như từ sinh khối sợi nấm.
11
Hình 2.3. Công thức cấu tạo Lentinan
β-D-glucopyranosyl-(1→6)-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)-[β-D-glucopyranosyl-
(1→6)]-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-β-D-glucopyranosyl-(1→3)β-D-
glucopyranosyl-(1→3)]-β-D-glucopyranose
Lentinan là hợp chất quan trọng của hệ sợi nấm Hương cũng như của thể
quả nấm. Lentinan tạo nên các tính chất dược lý của nấm Hương. Các nhà
nghiên cứu đã ghi nhận rằng Lentinan có khả năng tăng cường các phản ứng
miễn dịch, có tính chất chống ung thư mạnh, có tác dụng chống virus, tính
hồi hơn 80%, thời gian tách chiết ngắn nhưng yêu cầu về thiết bị hiện đại, chi
phí cao [17].
2.3. MỘT SỐ SẢN PHẨM THƯƠNG MẠI TỪ NẤM HƯƠNG
Ngoài sản phẩm nấm Hương tươi, hiện nay còn một số sản phẩm từ nấm
phổ biến như sau:
- Thể quả thu hái tự nhiên được sấy khô, hoặc nghiền thành bột mịn rồi
đóng viên con nhộng hay viên nén.
- Bột thể quả nấm nuôi trồng nhân tạo.
- Dịch chiết thu được do chiết nước nóng hay chiết bằng ethanol từ bột thể
quả, dịch chiết cô đặc.
- Các chế phẩm sấy khô và nghiền mịn từ giá thể hỗn hợp gồm hệ sợi
nấm, giống nấm và môi trường rắn ăn được (thường là hạt).
- Sinh khối hoặc dịch chiết từ sinh khối sợi nấm hoặc từ môi trường lên
men.
13
- Chế phẩm LEM (Lentinula Edodes Mycelium): chiết suất từ hệ sợi nấm
Hương lên men giá thể bã mía. LEM được tách chiết từ hệ sợi nấm, ở dạng bột.
Trong 1 kg bột chứa 6-7g LEM.
- Chế phẩm LAP là dung dịch hệ sợi nấm Hương + 4 lần thể tích ethanol.
LAP ≈ 0,3g LEM.
Các sản phẩm trên được thấy phổ biến ở các nước có ngành công nghiệp
nấm phát triển như Nhật Bản, Trung Quốc, Đài Loan, Mỹ [4, 5].
2.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT NẤM HƯƠNG
2.4.1. Tình hình ngoài nước
Nấm Hương được nuôi trồng nhân tạo tại Trung Quốc từ cách đây trên
1000 năm tức là từ thời Bắc Tống (960 - 1127). Đầu thế kỷ XX nấm Hương đã
được nuôi trồng nhân tạo ở quy mô công nghiệp tại Nhật, Pháp, Mỹ. Gần đây
Nhật Bản, Trung Quốc, Triều Tiên là những nước trồng nhiều nấm Hương nhất
trên thế giới. Tổng sản lượng hàng năm đạt trên 1 triệu tấn. Sản phẩm nấm được
sử dụng chủ yếu ở dạng tươi và sấy khô. Các nước này còn phát triển sản xuất
Hương cũng như hệ sợi nấm Hương đem lại nên gần đây các nhà khoa học trên
thế giới đang ngày càng chú ý đến việc nghiên cứu thu sinh khối sợi nấm, vì
điều kiện phát triển hệ sợi không yêu cầu khắt khe như nuôi lấy thể quả, thời
gian nuôi cấy lại rút ngắn. Đã có một số nghiên cứu trong và ngoài nước tận
dụng phế phụ phẩm nông nghiệp và công nghiệp chế biến để làm giá thể nuôi
cấy nấm trên môi trường rắn và lỏng. Điều này có ý nghĩa rất lớn vừa giảm thiểu
được ô nhiêm môi trường vừa tạo ra được thực phẩm.
15
2.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Từ lâu nấm Hương rất quen thuộc đối với người Việt Nam. Tuy nhiên
việc ươm trồng loại nấm này ở nước ta vẫn chưa được phát triển nên phần lớn
nấm được sử dụng ở dạng quả thể nấm khô nhập khẩu từ Trung Quốc. Có thể
tìm thấy nấm Hương dạng quả thể khô ở khắp các siêu thị ở nước ta, và có bán
trên thị trường do nhu cầu sử dụng rộng rãi của người dân.
Hiện nay có một số tỉnh trồng nấm Hương với quy mô nhỏ vì còn phù
thuộc vào điều kiện thời tiết, nó chỉ hợp với với nhiệt độ vào mùa đông ở miền
Bắc nước ta. Một số tỉnh triển khai trồng nầm như: Cao Bằng, Hà Giang, Lạng
Sơn, Lào Cai …
Các nghiên cứu liên quan đến công nghệ trồng nấm Hương từ trước đến
nay chủ yếu là dạng truyền thống tức là sử dụng giá thể rắn để trồng nấm thu
quả thể. Hiện nay chưa có một công bố kết quả nghiên cứu liên quan đến sản
xuất sinh khối sợi nấm. Các nghiên cứu về tách chiết hoạt chất nấm cũng không
nhiều, chủ yếu tập trung trên nấm dược liệu như nấm Linh Chi.
Năm 2000, Phòng Công nghệ sinh học và Kỹ thuật hạt nhân Đà Lạt
Trường Đại học Tây Nguyên đã công bố kết quả lên men dịch thể hệ sợi nấm
Hương. Kết quả cho thấy có thể thu sinh khối thuần khiết với hiệu suất cao sau
20-30 ngày nuôi cấy, tùy theo thể tích bình lên men và điểu kiện sục khí [3].
Nghiên cứu đã mở ra hướng phát triển về nuôi cấy nấm trong môi trường lỏng.
Gần đây các nghiên cứu liên quan đến hoạt chất sinh học, sản xuất thực
phẩm chức năng đang ngày càng được quan tâm nhiều hơn. Năm 2005 Nguyễn
Copyright: Tài liệu đại học ©