Link tải luận văn miễn phí cho ae Kết nối
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1 Đặt vấn đề 01
1.2 Mục đích .02
1.3 Yêu cầu 02
2. TỔNG QUAN
2.1 Đại cương về aflatoxin .03
2.1.1 Lịch sử phát hiện .03
2.1.2 Phân loại .04
2.1.3 Tính chất hoá lí .05
2.1.4 Tác động sinh học .05
2.1.4.1 Độc tính cấp 07
2.1.4.2 Độc tính mãn .08
2.1.5 Sự hiện diện trong thực phẩm .10
2.1.6 Giới hạn về hàm lượng trong thực phẩm và thức ăn gia súc .10
2.2 Các phương pháp phân tích aflatoxin 12
2.2.1 Phương pháp sinh học 12
2.2.2 Phương pháp phân tích hoá lí .12
2.2.2.1 Lấy mẫu .13
2.2.2.2 Chiết aflatoxin 13
2.2.2.3 Làm sạch mẫu .14
2.2.2.4 Cô đặc mẫu .14
2.2.2.5 Phát hiện và xác định hàm lượng .14
2.2.3 Phương pháp miễn dịch học .16
2.3 Sắc kí ái lực miễn dịch (IAC – ImmunoAffinity Chromatography) .17
3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH
3.1 Thời gian và địa điểm .20
3.1.1 Thời gian 20
3.1.2 Địa điểm .20
3.2 Vật liệu 20
3.2.1 Đối tượng nghiên cứu .20
3.2.2 Hóa chất .20
3.2.3 công cụ .20
3.2.4 Thiết bị 21
3.3 Phương pháp nghiên cứu 21
3.3.1 Các phương pháp phục vụ cho nghiên cứu 21
3.3.1.1 Quy trình tạo giá ái lực miễn dịch .21
3.3.1.2 Phương pháp quang phổ kế để xác định nồng độ AFG1.23
3.3.1.3 Quy trình chiết xuất, cô đặc và tinh chế AFG1 với cột IAC
3.3.1.4 Phương pháp dùng huỳnh quang kế đo lường lượng AFT
3.3.2 Xây dựng đường chuẩn cho AFG1 bằng huỳnh quang kế .26
3.3.3 Khảo sát các chỉ tiêu.27
3.3.3.1 Độ nhạy của cột .27
3.3.3.2 Độ lặp lại của cột 28
3.4 Phương pháp xử lí số liệu .28
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Cột IAC 2,5 do Viện Pasteur Tp. HCM sản xuất .29
4.2 Nồng độ dung dịch AFG1 chuẩn xác định bằng quang phổ kế .29
4.3 Đường chuẩn AFG1 dựa trên huỳnh quang kế 29
4.4 Độ nhạy của cột .30
4.5 Độ lặp lại của cột .31
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1 Kết luận .34
5.2 Đề nghị .34
6. TÀI LIỆU THAM KHẢO .35
Phần 1. MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Vi nấm (Fungi) và độc tố vi nấm (Mycotoxin) là vấn đề rất quan trọng trong công tác bảo quản nông sản, thực phẩm và trong y tế. Gần 400 độc tố vi nấm được phát hiện cho đến nay [18], trong đó, aflatoxin là độc tố được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất.
Aflatoxin là tên gọi một nhóm chất độc, sản phẩm của quá trình trao đổi chất của một số loài nấm mà chủ yếu là loài Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus…. Trong đó, phổ biến nhất và độc nhất là aflatoxin B1, G1, B2 và G2, có thể gây bệnh ở mức vi lượng.
Đối với động vật nuôi (gà, vịt, lợn…), aflatoxin gây bệnh nhiễm độc Aflatoxicosis, rất phổ biến, đặc biệt các nước nhiệt đới. Bệnh làm vật nuôi kém phát triển, sức sản xuất giảm, dễ mẫn cảm với các bệnh truyền nhiễm, bị ung thư và thậm chí bị chết. Do đó, hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi bị ảnh hưởng nghiêm trọng, chịu nhiều tổn thất lớn.
Đối với người, đáng chú ý là khả năng gây ung thư gan và dị tật thai do aflatoxin nhiễm từ sữa mẹ truyền cho con.
Aflatoxin có ảnh hưởng nghiêm trọng như vậy nhưng lại rất khó để loại bỏ vì aflatoxin hiện diện ở khắp nơi trong môi trường lại khó bị phân huỷ bởi nhiệt. Do vậy, việc nghiên cứu tìm ra các phương pháp phân tích tối ưu nhằm phát hiện aflatoxin trong thực phẩm và nguyên liệu thực phẩm là điều cần thiết.
Quy trình phân tích aflatoxin thường phải qua nhiều giai đoạn chiết xuất, làm sạch, cô đặc, cùng với việc định tính và định lượng aflatoxin bằng các phương pháp như: sắc kí cột, sắc kí lớp mỏng (TLC), sắc kí lỏng cao áp (HPLC) dễ bị sai số do phải qua nhiều thao tác, tăng thất thoát trong các công đoạn. Trước những khó khăn trên, sắc kí ái lực miễn dịch (immuno-affinity chromatography-IAC) ra đời, sử dụng trong công đoạn tinh sạch và cô đặc mẫu đồng thời, dựa trên nguyên lí gắn kết đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, tạo khả năng chọn lọc cao mà các phương pháp khác không có được; quy trình chiết và tinh chế aflatoxin của phương pháp IAC lại đơn giản đã đáp ứng được nhu cầu về độ tin cậy cao trong các kết quả phân tích.
Trong số các aflatoxin, aflatoxin B1 được chú ý nhiều nhất do sự hiện diện rộng khắp nhất cũng như do tính độc ngắn hạn và dài hạn của aflatoxin B1 cao hơn nhiều so với các aflatoxin khác.
Từ những cơ sở trên, viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh đã tiến hành thực hiện đề tài Sản xuất giá ái lực miễn dịch bắt aflatoxin B1. Giá (cột) sắc kí ái lực tạo nên đã cho hiệu quả cao trong phân tích định lượng aflatoxin B1.
Bên cạnh đó, aflatoxin G1 là độc tố vi nấm chỉ đứng sau aflatoxin B1 về độc tính, cũng có khả năng gây hại cao cho người và vật nuôi, hơn nữa cấu trúc hoá học lại khá tương đồng với aflatoxin B1 nên cũng là một đối tượng quan trọng cần tiến hành nghiên cứu.
Được sự phân công của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, sự hướng dẫn của PGS. TSKH Nguyễn Lê Trang - Viện Pasteur, Tp. Hồ Chí Minh và TS. Nguyễn Ngọc Hải, tui tiến hành đề tài “Đánh giá khả năng bắt aflatoxin G1 của cột ái lực miễn dịch do Viện Pasteur Tp.HCM sản xuất”.
1.2 Mục đích
Khảo sát khả năng bắt aflatoxin G1 của cột ái lực miễn dịch.
1.3 Yêu cầu
Xác định các đặc tính của cột ái lực miễn dịch trong việc bắt aflatoxin G1:
• Độ nhạy của cột
• Độ lặp lại của cột












Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Đại cương về aflatoxin
2.1.1 Lịch sử phát hiện
Năm 1960 ở Anh, một vụ dịch bệnh xảy ra làm chết 100.000 gà tây con, khi mổ xác thấy có xuất huyết hoại tử ở gan kèm tổn thương ở thận mà nguyên nhân không được biết rõ. Do đó, người ta gọi là bệnh “X” của gà tây.
Sau đó, những vụ tương tự cũng được quan sát thấy trên vịt con ở Áo, gà giò ở Tây Ban Nha, cá hồi ở Mỹ, trĩ con ở Uganda…Các nhà bác học đã nhanh chóng tìm ra mối liên hệ giữa các vụ ngộ độc đó với việc cho ăn khô dầu đậu phộng và họ cũng thấy rằng bệnh này không những xảy ra đối với gia cầm mà còn với cả gia súc, đặc biệt là heo, bê, cừu…
Với những cố gắng phát hiện nguồn độc tố trên các thực phẩm có liên quan, các nhà bác học đã quan sát và phân lập được loài vi nấm Aspergillus flavus trên các hạt đậu mốc và lúa mì mốc. Việc tinh chế các độc tố từ các loại hạt bị nhiễm nấm Aspergillus cho ra một loại hợp chất mà trong bản báo cáo của Forgacs và Carl xuất bản năm 1962, người ta gọi là aflatoxin (A: Aspergillus, fla: flavus và toxin có nghĩa là chất độc).
Đến nay, aflatoxin được biết là sản phẩm trao đổi chất thứ cấp qua con đường polyketide của một số loài nấm thuộc chủng Aspergillus flavus (khoảng 50% chủng), Aspergillus parasiticus (100% chủng) (Klick và Pitt, 1988)[4], Aspergillus nomius; ngoài ra còn có Penicillium spp, Rhizopus spp nhưng ít có vai trò gây bệnh trong thực tế. Ở A. flavus và A. parasiticus, con đường sinh tổng hợp aflatoxin liên quan ít nhất 16 phản ứng enzyme được mã hóa bởi 25 gen tập trung thành nhóm trong một vùng DNA 70 kilobase trên nhiễm sắc thể [19].

Việc khám phá ra aflatoxin đã kích thích các nhà khoa học nhiều ngành tập trung nghiên cứu về tất cả các mặt của aflatoxin và ảnh hưởng của nó tới sức khoẻ của con người và động vật.
2.1.2 Phân loại
Có thể nói Sargeant (1962) là người có công xác định các độc tố này. Chúng là các chất có cấu trúc hoá học rất gần nhau và có khung hoá học giống với dẫn xuất của cumarin nên gọi là flavacumarin. Phân tử aflatoxin gồm một gốc cumarin, 2 nhân furan và 1 vòng lacton [11].
Hiện người ta biết có đến 20 loại aflatoxin (Quinn, 1998)[4].
Các aflatoxin được sản xuất trong tự nhiên gồm 4 loại, kí hiệu AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 (được gọi tên do tính chất phát huỳnh quang dưới tia UV: B: Blue; G: Green). Aflatoxin nhóm B và nhóm G khác nhau ở chỗ nhóm B chỉ có 1 nhóm chức lacton trong khi nhóm G có 2 chức lacton.

Các loại aflatoxin khác là do sự chuyển hoá của các aflatoxin trên trong nấm và trong cơ thể động vật.
 AFB2 và AFG2 là dẫn xuất hydro hoá của AFB1 và AFG1.
 AFB2a và AFG2a là dẫn xuất hemiacetal của AFB1 và AFG1.
 AFM1 và AFM2 là dẫn xuất của AFB1 và AFB2 tìm thấy trong sữa, thận và gan động vật.
 Ngoài ra: AFGM1, AFGM2, AFM2a, AFGM2a, AFB3 (parasiticol), dihydroaflatoxin B3, Ro (aflatoxicol), dihydoaflatoxicol, AFP1, AFQ1…


2.1.3 Tính chất hóa lí
Aflatoxin dễ bị huỷ bởi những chất kiềm, nhưng tương đối bền với nhiệt. Ở nhiệt độ cao hơn 100oC chỉ khử được phần nào aflatoxin.
Aflatoxin ít tan trong nước, tan trong các dung môi phân cực như: chloroform, acetonitril, aceton, methanol…
Aflatoxin không tan trong những dung môi hòa tan chất béo như n-hexan, ether ethylic, ether dầu hoả…
Hầu hết các loại aflatoxin đều phát huỳnh quang ở khoảng bước sóng 440 nm khi kích thích bởi ánh sáng có độ dài sóng khoảng 365 nm [10].
Các đặc tính lí hóa được trình bày trong phụ lục 1.
2.1.4 Tác động sinh học
Aflatoxin là chất độc nguy hiểm đối với các loài gia súc, gia cầm và con người. Tuy nhiên, mức độ độc hoàn toàn khác nhau, phụ thuộc vào giống loài, lứa tuổi, giới tính, đường xâm nhập, trạng thái sức khoẻ của cơ thể, môi trường và hàm lượng chất độc ăn phải.


sd88vffxqCER4m4

---