Link tải luận văn miễn phí cho ae Kết Nối
PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1 Đặt Vấn Đề
Cách đây hai thập kỷ, nhiều nhà khoa học trên thế giới đã đúng khi nhận thấy việc
sử dụng DNA tái tổ hợp nhƣ là một công cụ hữu hiệu trong việc nâng cao năng suất
cây trồng và chất lƣợng lƣơng thực, thực phẩm đồng thời vẫn thúc đẩy đƣợc một nền
nông nghiệp bền vững. Tiếp theo những nhận định này là hàng loạt những đột phá
trong nghiên cứu khoa học về các phƣơng pháp chuyển gen, trong việc phát hiện và
bảo tồn những gen quý.
Tuy nhiên, việc nghiên cứu và phân tích ở mức phân tử DNA thƣờng gặp khó khăn
lớn về số lƣợng và độ tinh sạch của DNA trong mẫu thí nghiệm. Để giải quyết vấn đề
này, khi nghiên cứu trình tự của một đoạn DNA về sự hoạt đông của gen, sự biểu hiện
ra protein và cấu trúc của protein, ngƣời ta chú trọng tới việc phân lập và thu nhận
đoạn DNA quan tâm và tiến hành tạo ra bản sao với số lƣợng lớn để tiến hành nghiên
cứu. Mặc khác, bộ gen của sinh vật thì rất lớn và phức tạp mà trình tự gen chúng ta
quan tâm thƣờng chỉ có một hay hai bản sao trong mỗi tế bào. Vì vậy chúng ta không
thể sử dụng các phƣơng pháp sinh hoá thông thƣờng để phân lập gen mục tiêu trên bộ
gen.
Những vấn đề trên có thể đƣợc giải quyết khi ta sử dụng các cấu trúc DNA có khả
năng tự sao chép trong tế bào chủ để làm phƣơng tiện mang gen, biến nạp gen, tăng
bản sao của gen, biểu hiện gen hay các thao tác khác trên gen. Các cấu trúc DNA dùng
cho mục tiêu này gọi là vector. Việc biến nạp DNA tái tổ hợp vào một tế bào thích hợp
sẽ cho phép vector có khả năng tồn tại ổn định và sao chép độc lập với bộ gen của tế
bào. Tế bào có khả năng tiếp nhận vector tái tổ hợp gọi là tế bào chủ. Tế bào chủ
thƣờng đƣợc chọn lọc và cải tạo để tạo thành các chủng chủ có kiểu gen và các đặc
tính thuận lợi cho các thao tác trên gen. Chủng chủ mang vector tái tổ hợp gọi là dòng
tái tổ hợp. Dòng tái tổ hợp đƣợc phân lập để lƣu trữ DNA tái tổ hợp hay dùng cho các
thao tác trên gen. Toàn bộ quá trình trên gọi là tạo dòng DNA hay DNA cloning. Mục
đích của tạo dòng nhằm thu đƣợc số lƣợng lớn và tinh khiết các trình tự DNA hay thu
nhận một dòng tế bào có khả năng biểu hiện gen mục tiêu.
Xuất phát từ những khó khăn trong thực tế nghiên cứu và trên nền tảng kiến thức về
kĩ thuật di truyền đƣợc tiếp thu trong quá trình học tập, chúng tui tiến hành thực hiện
đề tài “ Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E.coly
DH5α” trong khoá luận tốt nghiệp của mình.
1.2 Mục tiêu của đề tài
Thiết lập quy trình chèn một đoạn DNA bất kỳ vào plasmid pBluescipt và chuyển
đƣợc plasmid tái tổ hợp này vào tế bào ký chủ Ecoly DH5α.
1.3 Nội dung thực hiện
1.3.1 Phần 1
Xây dựng đƣờng tƣơng quan tuyến tính giữa giá trị OD600nm và mật số tế bào vi
khuẩn dựa trên sự tƣơng quan của số tế bào theo thời gian nuôi cấy kết hợp với tƣơng
quan của giá trị OD600nm theo thời gian nuôi cấy.
Thiết lập quy trình chuẩn bị tế bào khả nạp sử dụng hóa chất.
Thiết lập phƣơng pháp biến nạp plasmid DNA chƣa tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn
E.coly DH5α bằng hóa chất và sốc nhiệt.
Phƣơng pháp tách chiết plasmid chƣa tái tổ hợp bằng SDS-kiềm thể biến nạp, kết
hợp với phản ứng cắt enzym giới hạn để kiểm tra.
1.3.2 Phần 2
Chuẩn bị đoạn DNA để chèn.
Cắt và tinh sạch vector.
Phản ứng sửa chữa sai sót trên đoạn DNA chèn, nhằm tạo ra đoạn DNA có đầu
bằng.
Phản ứng nối giữa vector và DNA chèn.
Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào.
Kiểm tra thể biến nạp trên môi trƣờng có chứa Ampicillyn, X-gal, IPTG
Kiểm tra lại kết quả biến nạp đoạn gen bằng phản ứng cắt, phản ứng PCR trên
plasmid tách chiết từ thể biến nạp. PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LYỆU
2.1 Hiện tƣợng biến nạp ở vi khuẩn
2.1.1 Hiện tƣợng biến nạp
Biến nạp là hiện tƣợng tiếp nhận DNA từ bên ngoài vào tế bào vi khuẩn. Hiện
tƣợng biến nạp đƣợc chứng minh lần đầu tiên trên vi khuẩn Streptococcus pneumoniae
do Fred Griffiths, năm 1928, sau đó đƣợc kiểm chứng lại bởi Avery và cộng sự năm
1944 (viện Rocketfeller). Chủng vi khuẩn mà Griffiths và Avery sử dụng có trạng thái
khả nạp tự nhiên, chúng có khả năng hấp thu DNA tự nhiên có sẵn ở môi trƣờng sống.
Nguồn DNA này có đƣợc từ các tế bào chết hay các tế bào bị phân hủy. Kết quả thu
đƣợc là vi khuẩn thể hiện một hay vài tính trạng mới, tính trạng này ổn định và có
khả năng di truyền.
Từ các nghiên cứu của Griffiths và Avery đã chỉ ra rằng tế bào vi khuẩn phải ở
trạng thái sinh lý đặc biệt mới có khả năng hấp thu DNA, đó là “trạng thái khả nạp”.
Trạng thái khả nạp xuất hiện tự nhiên ở một vài loài vi khuẩn khi mà nồng độ chất
dinh dƣỡng và oxy trong môi trƣờng sống của chúng giảm xuống thấp. Trong thực tế
nghiên cứu biến nạp phải tiến hành xử lý tế bào vi khuẩn để chúng có khả năng hấp
thu DNA.
2.1.2 Vai trò và ứng dụng của biến nạp gen
2.1.2.1 Vai trò
Hiện tƣợng biến nạp giúp các loài vi khuẩn có thêm các tính trạng mới dễ thích
nghi với môi trƣờng sống.
Đó là cơ sở của tiến hóa và đa dạng vi sinh vật.
2.1.2.2 Ứng dụng
Biến nạp DNA vào vi khuẩn còn là bƣớc đầu trong kỹ thuật DNA tái tổ hợp. Từ rất
lâu, vi sinh vật đã đƣợc xem và sử dụng nhƣ nhà máy sinh học (lyving factories) tạo ra
các sản phẩm sinh học phục vụ nhu cầu con ngƣời, ví dụ kháng sinh Penicillyn đƣợc
chiết xuất từ nấm Penicillyum và Streptomycin tạo ra từ vi khuẩn Streptomyces
griseus. Kỹ thuật tái tổ hợp cho phép chuyển một gen từ động vật, cây trồng vào vi
khuẩn và ở đó một lƣợng lớn sản phẩm mong muốn của gen sẽ đƣợc tạo ra, sau đó kết
hợp với các phƣơng pháp chiết xuất và tinh sạch để phục vụ cho mục đích của con
sERggG4XL3YGT8Z
