Download miễn phí Luận văn Tuyển chọn, nuôi cấy chủng aspergillus awamori sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase và đánh giá tính chất lý hóa của endo-β-1,4-glucanase



MỤC LỤC
MỞ ĐẦU . 1
CHưƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3
1.1 KHÁI NIỆM VỀ CELLULASE VÀ ENDO-β-1,4-GLUCANASE . 3
1.2 NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI ENDO-β-1,4-GLUCANASE . 4
1.2.1 Nguồn gốc . 4
1.2.2 Phân loại . 6
1.3 CẤU TRÚC CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE . 7
1.3.1 Cấu trúc bậc một . 7
1.3.2 Cấu trúc không gian . 9
1.3.3 Cấu trúc của trung tâm xúc tác và vùng liên kết cơ chất . 9
1.4 CƠ CHẾ XÚC TÁC CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE . 11
1.5 ỨNG DỤNG CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE . 12
1.5.1 Trong công nghiệp thực phẩm . 12
1.5.2 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc . 13
1.5.3 Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ. 15
1.5.4 Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy . 15
1.5.5 Trong công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa . 16
1.5.6 Trong công nghệ xử lý rác thải sản xuất phân bón vi sinh . 16
1.6 ẢNH HưỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRưỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG
SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE . 17
1.7 TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE . 20
1.8 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN Ở VIỆT NAM . 22
CHưƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP . 25
2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT . 25
2.1.1 Chủng nấm . 25
2.1.2 Thiết bị thí nghiệm . 25
2.1.3 Hóa chất . 26
2.1.4 Môi trường . 26
2.1.5 Dung dịch và đệm . 27
2.2 PHưƠNG PHÁP . 28
2.2.1 Nuôi cấy vi sinh vật . 28
2.2.2 Xác định hoạt tính endoglucanase . 28
2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố lên khả năng sinh tổng hợp
endoglucanase . 30
2.2.4 Tinh sạch enzyme . 32
2.2.5 Điện di SDS-PAGE . 33
2.2.6 Xác định tính chất lý hóa của endoglucanase . 34
2.2.7 Xác định hàm lượng protein tổng số . 35
2.2.8 Các phương pháp sinh học phân tử . 36
2.2.9 Xử lý số liệu . 41
CHưƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 42
3.1 TUYỂN CHỌN VÀ PHÂN LOẠI CHỦNG ASPERGILLUS AWAMORI
SINH TỔNG HỢP ENDOGLUCANASE CAO . 42
3.1.1 Tuyển chọn . 42
3.1.2 Phân loại chủng nấm sợi dựa vào phân đoạn gene 28S rRNA . 43
3.2 TỐI ưU CÁC ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP ENDOGLUCANASE . 45
3.2.1 Khả năng sinh tổng hợp endoglucanase theo thời gian . 45
3.2.2 Nhiệt độ nuôi cấy . 47
3.2.3 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng . 48
3.2.4 Ảnh hưởng của nguồn carbon và nồng độ nguồn carbon . 50
3.2.5 Ảnh hưởng của nguồn nitrogen và nồng độ nguồn nitrogen . 52
3.2.6 pH môi trường nuôi cấy ban đầu . 54
3.3 TINH SẠCH ENDOGLUCANASE . 55
3.3.1 Tinh sạch qua cột sắc ký lọc gel sephadex G-100 . 55
3.3.2 Tinh sạch qua cột sắc ký trao đổi ion DEAE . 56
3.4 NHỮNG TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDOGLUCANASE . 57
3.4.1 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất . 57
3.4.2 Nhiệt độ phản ứng tối ưu . 58
3.4.3 pH phản ứng tối ưu . 60
3.4.4 Độ bền nhiệt độ . 61
3.4.5 Độ bền pH . 63
3.4.6 Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ . 64
3.4.7 Ảnh hưởng của ion kim loại. 65
3.4.8 Ảnh hưởng của một số chất tẩy rửa . 67
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ . 69
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 71
PHỤ LỤC .


http://s1.liketly.com/flash/edoc/-images-nopreview.swf /tai-lieu/de-tai-ung-dung-tren-liketly-42814/
Để tải bản Đầy Đủ của tài liệu, xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.
Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí

Tóm tắt nội dung tài liệu:

ôi trƣờng MT1 theo Mandles (g/l): urea 0,3; (NH4)2SO4 1,4;
KH2PO4 2; CaCl2 0,3; MgSO4.7H2O 0,3; peptone 1; cao nấm men 10;
tween 80 1; CMC 10; các yếu tố vi lƣợng 0,1% (v/v) bao gồm các muối:
FeSO4 18 mM; MnSO4 6,6 mM; ZnSO4 4,8 mM, CoCl2 15 mM. pH 7,0
[36], [60].
Môi trƣờng LB (Luria-Bertani): 1% (w/v) peptone; 0,5% (w/v) cao nấm
men; 1% (w/v) NaCl; pH 7,0, khử trùng, với môi trƣờng đặc bổ sung
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
27
2% (w/v) agar. Đối với việc chọn chủng mang plasmid, môi trƣờng đƣợc
bổ sung 100 g/ml ampicillin.
3.1.5 Dung dịch và đệm
Bảng 2.3. Danh sách dung dịch và đệm sử dụng trong thí nghiệm
Dung dịch Thành phần, nồng độ
Dung dịch Bradford gốc 100 ml 95% ethanol; 350 mg serva blue G; 200 ml
88% phosphoric acid
Đệm Bradford thí nghiệm 425 ml H2O; 15 ml 95% ethanol; 30 ml 88%
phosphoric acid; 30 ml dung dịch bradford gốc
Đệm điện di protein (biến
tính)
25 mM Tris-HCl; 192 mM glycine; 0,1% SDS,
pH 8,4
Đệm KP (K2HPO4) 0,1 M K2HPO4, pH 6,5
Đệm tra mẫu protein (biến
tính) 5x
10% SDS; 0,05% brommophenol blue; 50%
glycerol; 10% 2 mecaptho ethanol pha trong đệm
0,312 M Tris-HCl, pH 6,8
Dung dịch DNS (1000 ml) 205,4 g KNaC4H4O6.4H2O; 4,15 g Na2S2O5; 5,3 g
DNS; 9,9 g NaOH; 3,8 ml phenol
Dung dịch I Đệm Tris HCl 50 mM, pH 8,0; 50 mM NaCl
Dung dịch II Đệm Tris HCl 50 mM, pH 8,0; 1000 mM NaCl
Dung dịch III Đệm 80 mM phosphate, pH 7,5
Dung dịch A Đệm 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8
Dung dịch APS 10% ammonium persulfate
Dung dịch B Đệm 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8
Dung dịch C 30% acrylamide; 0,8% bis-acrylamide
Dung dịch D 10% SDS; 25 mM EDTA
Dung dịch nhuộm gel
polyacrylamide
0,1% (w/v) coomassie brilliant blue; 30% (v/v)
methanol; 10% (v/v) acetic acid
Dung dịch rửa PAGE 30% (v/v) methanol; 10% (v/v) acetic acid
Dung dịch protease K 20 g/ml protease K
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
28
Dung dịch RNase 10 g/ml RNase
Dung dịch ampicillin gốc 100 mg/ml ampicillin
Dung dịch nhuộm gel
agarose
0,1 g/ml ethidium bromide
Đệm TE 100 mM Tris- HCl; 1 mM EDTA, pH 8,0
Đệm tra mẫu DNA 6x 0,09% (w/v) brommophenol blue; 0,09% (w/v)
xylene xyanol (FF); 60% (v/v) glycerol
Đệm TBE 10x 108 g Tris base; 55 g boric acid; 40 ml 0,5 M EDTA
pH 8,0
Đệm cell lysis 10 mM Tris, 100 mM EDTA, 2% (w/v) SDS, pH 8,0
3.2 PHƢƠNG PHÁP
3.2.1 Nuôi cấy vi sinh vật
Nuôi cấy hoạt hóa nấm sợi
Các chủng A. awamori lấy từ các ống giống đƣợc nuôi cấy trên
môi trƣờng Czapek lỏng ở điều kiện 30C, pH 6,5, lắc 200 vòng/phút trong
72 giờ.
Nuôi cấy nấm thu sinh khối enzyme
Các chủng A. awamori sau khi hoạt hóa đƣợc nuôi cấy chìm trong
môi trƣờng MT1 với 0,5% CMC làm cơ chất, ở 30°C, lắc 200 vòng/phút. Sau
96 giờ nuôi cấy, dịch canh trƣờng đƣợc ly tâm loại sinh khối tế bào, thu dịch
enzyme thô.
3.2.2 Xác định hoạt tính endoglucanase
Định tính hoạt tính endoglucanase
Hoạt tính endoglucanase đƣợc xác định tƣơng đối theo phƣơng pháp
khuếch tán enzyme trên đĩa thạch. Đĩa thạch chứa 0,5% cơ chất CMC trong
đệm 100 mM potassium phosphate pH 6,5, dày khoảng 0,5 cm đƣợc đục lỗ
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
29
đƣờng kính 0,5 cm. 50 µl dịch enzyme vào lỗ rồi ủ 12 giờ ở 4C cho enzyme
khuếch tán đều xung quanh. Sau đó ủ tiếp 8 giờ ở 37C, lấy ra nhuộm bằng
dung dich 1% lugol và đo đƣờng kính vòng phân giải cơ chất.
Hoạt tính tƣơng đối của enzyme tỷ lệ thuận với kích thƣớc đƣờng kính vòng
phân giải cơ chất: Dhalo = D - d (với D là đƣờng kính vòng ngoài và d là
đƣờng kính lỗ) [7].
Xác định hoạt độ endoglucanase
Hoạt độ endoglucanase đƣợc xác định chính xác dựa vào lƣợng
đƣờng khử tạo thành sau phản ứng bằng phƣơng pháp đo quang phổ
theo Miller (1959) [47].
Tiến hành
Ống thí nghiệm (lặp lại 3 lần): 0,1 ml dịch enzyme đƣợc hút vào ống
nghiệm, thêm 0,4 ml dung dịch 0,5% CMC trong đệm 100 mM potassium
phosphate, pH 6,5. Hỗn hợp đƣợc lắc đều và ủ ở 50°C trong 20 phút, sau đó
bổ sung ngay 1,25 ml dung dịch thuốc thử DNS và đun sôi cách thủy 5 phút.
Ống đối chứng: 0,1 ml dịch enzyme đƣợc hút vào ống nghiệm, thêm
1,25 ml dung dịch thuốc thử DNS ủ trong 5 phút, bổ sung tiếp 0,4 ml dung
dịch 0,5% CMC. Hỗn hợp đƣợc lắc đều và ủ ở 50°C trong 20 phút, sau đó lấy
ra và đun sôi cách thủy 5 phút.
Hỗn hợp sau phản ứng đƣợc đo độ hấp thụ quang phổ ở bƣớc sóng
540 nm. Kết quả đo độ hấp thụ quang phổ đƣợc đối chiếu với đồ thị chuẩn
nồng độ glucose để suy ra lƣợng đƣờng khử tƣơng đƣơng đƣợc giải phóng ra.
Dựng đƣờng chuẩn: Glucose đƣợc pha trong nƣớc cất với nồng độ
chuẩn khác nhau từ 0,04-0,18 mg/ml. 2 ml dung dịch glucose chuẩn đƣợc đo
độ hấp phụ ở bƣớc sóng 540 nm nhƣ trên. Sau đó, mối tƣơng quan giữa độ
hấp phụ và nồng độ glucose đƣợc xây dựng bằng phần mềm Microsoft Excel.
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
30
Kết quả cho thấy, đƣờng nồng độ chuẩn glucose tuyến tính trong dải
nồng độ 0,04-0,18 mg/ml (Hình 2.1).
Đƣờng chuẩn có phƣơng trình: y = 2,6411x - 0,0799. Trong đó:
y - độ hấp phụ ở bƣớc sóng 540 nm (OD540 nm); x - nồng độ glucose (mg/ml)
Đơn vị hoạt độ: một đơn vị hoạt độ quốc tế (IU) đƣợc định nghĩa là
lƣợng enzyme làm thủy phân cơ chất (CMC) thành đƣờng khử tƣơng đƣơng
1 mol glucose trong một phút ở điều kiện thí nghệm.
3.2.3 Khảo sát ảnh hƣởng của một số yếu tố lên khả năng sinh tổng hợp
endoglucanase
3.2.3.1 Thời gian nuôi cấy
Chủng A. awamori VTCC-F-099 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MT1
cơ bản cho sinh tổng hợp endoglucanase, dịch canh trƣờng đƣợc thu
sau những khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau: từ 24-240 giờ và xác định
hoạt tính endoglucanase.
R² = 0.997
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0 0.04 0.08 0.12 0.16 0.2
O
D
5
40
n
m
Glucose (mg/ml)
y = 2,6411x - 0,0799
Hình 2.1. Đƣờng chuẩn nồng độ glucose
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
31
3.2.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường
Để xác định nhiệt độ nuôi cấy tối ƣu, chủng nấm nghiên cứu đƣợc nuôi
trong môi trƣờng MT1 cơ bản cho sinh tổng hợp endoglucanase, lắc
200 vòng/phút ở 25C, 28C; 30C, 32C và 37C; pH 7,0. Dịch canh trƣờng
đƣợc thu sau 96 giờ nuôi cấy và xác định hoạt tính endoglucanase.
3.2.3.3 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng
Cơ chất với một nồng độ nhất định thƣờng đóng vai trò là chất cảm ứng
cho quá trình sinh tổng hợp loại enzyme tƣơng ứng. Để xác định khả năng
cảm ứng của cơ chất CMC đến khả năng sinh tổng hợp endoglucanase, chủng
A. awamori VTCC-F-099 đƣợc nuôi cấy chìm trong môi trƣờng MT1 cơ bản
pH 7,0, lắc 200 vòng/phút ở 30C, CMC đƣợc bổ sung vào môi trƣờng với
các nồng độ khác nhau từ 0,2-4%. Sau 96 giờ nuôi cấy, thu dịch nổi và
xác định hoạt tính endoglucanase.
3.2.3.4 Ảnh hưởng của nguồn carbon và nồng độ nguồn carbon
Chủng A. awamori VTCC-F-099 đƣợc nuôi cấy chìm trong môi trƣờng
MT1 cơ bản với 2% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng, nuôi lắc
200 vòng/phút ở 30C, pH 7,0 và nguồn cao nấm men đƣợc thay thế bằng các
nguồn carbon khác (vỏ cà phê, glucose, vỏ lạc, vỏ quýt, lõi ngô, bã mía,
saccharose, lactose, vỏ cám trấu, mùn cƣa, xơ dừa) với cùng nồng độ. Dịch
nổi canh trƣờng đƣợc thu sau 96 giờ để xác định hoạt tính endoglucanase
ngoại bào.
Sau khi chọn đƣợc lõi ngô là nguồn carbon th...

---