Download miễn phí Luận văn Nghiên cứu định lượng độc tố sinh học biển ASP trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ tandem LC-MS/MS
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU.1
Chương 1 - TỔNG QUAN.4
1.1. Hiện tượng thủy triều đỏ.4
1.2. Độc tốsinh học biển trong thủy sản.6
1.3. Đại cương vềaxít domoic (DA).8
1.3.1. Tính chất hóa lý. .8
1.3.2. Nguồn tích tụDA trong nhuyễn thể: .8
1.3.3. Độc tính của DA .9
1.4. Một sốphương pháp phân tích DA .9
1.4.1. Phương pháp sinh hóa trên chuột.10
1.4.2. Phương pháp sắc ký lỏng (LC-UV, LC-DAD, LC-FLD, LC-MS/MS).11
1.5. Ưu và nhược điểm của các phương pháp dẫn đến việc sửdụng phương
pháp LC-MS/MS trong phân tích DA .12
1.5.1. Phương pháp sinh hóa trên chuột.12
1.5.2. Phương pháp sắc ký lỏng .12
1.6. Đại cương vềsắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ[2], [5].12
1.6.1. Một số định nghĩa và phương trình cơbản .13
1.6.2. Những thành phần cơbản của hệthống LC-MS/MS (Waters) .15
1.6.3. Loại hợp chất phù hợp phân tích bằng sắc ký lỏng .23
1.6.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách của các chất trong cột.23
1.7. Kỹthuật chuẩn bịmẫu cho phân tích sắc ký.26
1.7.1. Chiết lỏng - lỏng: .27
1.7.2. Chiết pha rắn SPE: .27
Chương 2 – NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .29
2.1. Nội dung nghiên cứu của đềtài.29
2.2. Mô hình thực nghiệm .29
2.3. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất: .29
2.3.1. Thiết bị, dụng cụ: .29
2.3.2. Thuốc thử, hóa chất: .30
2.4. Thông tin vềmẫu nghiên cứu:.30
2.5. Xác định các thông sốtối ưu:.31
2.5.1. Xác định các thông sốtối ưu cho MS .31
2.5.2. Cột:.31
2.5.3. Pha động và chế độgradient: .32
2.5.4. Dung môi chiết:.32
2.5.5. Thiết lập bảng mẫu: .32
2.5.6. Tính toán : .33
2.5.7. Khảo sát khoảng tuyến tính: .33
2.5.8. Giới hạn phát hiện của phương pháp: .33
2.5.9. Độlặp lại của phương pháp: .34
2.5.10. Độthu hồi của phương pháp:.34
2.5.11. Thực nghiệm xác định DA trên mẫu nhuyễn thể.35
Chương 3- KẾT QUẢVÀ BÀN LUẬN.36
3.1. Xác định các thông sốtối ưu:.36
3.1.1. Xác định các thông sốtối ưu của MS/MS .36
3.1.2. Pha động và chương trình chạy gradient. .40
3.1.3. Dung môi chiết:.45
3.2. Khoảng tuyến tính: .47
3.3. Giới hạn phát hiện của phương pháp: .49
3.4. Độlặp lại và độthu hồi của phương pháp: .49
3.5. Thực nghiệm xác định DA trên nhuyễn thể. .51
3.6. Đánh giá độtin cậy của phương pháp:.52
3.7. Qui trình phân tích Axít domoic. .54
3.7.1. Phạm vi áp dụng: .54
3.7.2. Nguyên tắc: .54
3.7.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, dung dịch:.54
3.7.4. Chuẩn bịmẫu: .57
3.7.5. Tiến hành thửnghiệm: .58
3.7.6. Đảm bảo chất lượng .60
3.7.7. Tính toán kết quả: .60
KẾT LUẬN .61
TÀI LIỆU THAM KHẢO.62
PHỤLỤC 1: CÔNG THỨC CẤU TẠO ĐỘC TỐSINH HỌC BIỂN.1
PHỤLỤC 2: MỘT SỐSẮC KÝ ĐỒTIÊU BIỂU KHI TỐI ƯU .4
PHỤLỤC 3. ĐƯỜNG BIỂU DIỄN ĐỘTUYẾN TÍNH .13
PHỤLỤC 4. SẮC KÝ ĐỒCHẠY MẪU NHUYỄN THỂ2 MẢNH VỎ.19
PHỤLỤC 5. SẮC KÝ ĐỒPHÂN TÍCH MẪU NHUYỄN THỂ2 MẢNH VỎ
.BẰNG HPLC –UV .29
http://s1.liketly.com/flash/edoc/jh2i1fkjb33wa7b577g9lou48iyvfkz6-swf-2013-12-26-luan_van_nghien_cuu_dinh_luong_doc_to_sinh_hoc_bie.qskQrkqnzK.swf /tai-lieu/de-tai-ung-dung-tren-liketly-51731/Để tải bản Đầy Đủ của tài liệu, xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
Tóm tắt nội dung tài liệu:
ữu cơ và được làm
sạch bằng cách cho qua cột chiết pha rắn (nếu cần). Sau đó, dịch chiết được
làm sạch và được hòa tan trong dịch pha động tiêm vào hệ thống HPLC với
các đầu dò UV, PDA, FLD hay MS/MS. Đối với đầu dò huỳnh quang FLD,
sau khi qua cột phân tích DA được cho phản ứng với một chất phù hợp để tạo
thành hợp chất có tính chất huỳnh quang trước khi vào đầu dò.
Dựa vào ái lực của các cấu tử giữa pha tĩnh (pha đảo hay pha thuận)
thường là chất rắn và pha động (lỏng) mà mỗi cấu tử sẽ được rửa giải ra khỏi
cột theo thứ tự khác nhau. Cấu tử ra khỏi cột được đưa vào đầu dò UV,
PDA/DAD (Photo Diot Array detecter) hay đầu dò khối phổ MS/MS. Đối
với đầu dò UV hay DAD bên cạnh việc phát hiện bởi tín hiệu bị dung môi
chứa cấu tử rửa giải hấp thụ ở một bước sóng nhất định để định lượng. Đối
12
với đầu dò khối phổ cấu tử ra khỏi cột được đưa vào đầu dò MS và ở đây cấu
tử được ion hóa, phân mảnh và được phát hiện dựa vào thông số m/z. Trên cơ
sở này nên đầu dò MS có thể định danh và định lượng một cách rõ ràng,
khẳng định về một hợp chất nào đó.
1.5. Ưu và nhược điểm của các phương pháp dẫn đến việc sử dụng
phương pháp LC-MS/MS trong phân tích DA
1.5.1. Phương pháp sinh hóa trên chuột
Phương pháp sinh hóa trên chuột có ưu điểm là thực hiện nhanh, đơn
giản, dễ làm, có thể thực hiện với số lượng mẫu lớn, đầu tư ban đầu ít (về
nhân lực, thiết bị, hóa chất, dụng cụ), đối với phân tích độc tố thì phương
pháp sinh hóa trên chuột đang được chọn là một trong các phương pháp kiểm
khẳng định. Tuy nhiên đối với các loại độc tố có nhiều đồng phân thì không
thể phân biệt được hàm lượng của từng loại độc tố (ví dụ DSP, PSP có nhiều
hợp chất cùng nhóm). Ngoài ra, tại một số nước luật pháp không cho phép
làm các thử nghiệm trên động vật.
1.5.2. Phương pháp sắc ký lỏng
Phương pháp sắc ký lỏng có ưu điểm là một phương pháp khá nhạy và
có tính chọn lọc rất cao, có thể định lượng và khẳng định ngay mà chi phí
phân tích ở mức trung bình. Tuy nhiên phương pháp lại khó có thể phát triển
để phân tích thêm các nhóm chất độc tố sinh học biển khác như DSP, PSP với
mức giới hạn cho phép thấp (ppb).
Với những tồn tại của các phương pháp trên đới với DA thì việc cần có
một phương pháp khác như phương pháp LC-MS/MS riêng cho DA và có thể
phát triển để định lượng DSP, PSP cùng với việc dễ dàng áp dụng cho hầu hết
các phòng kiểm nghiệm về an toàn thực phẩm và đáp ứng đủ yêu cầu đề ra
của các tiêu chuẩn quốc tế cũng như yêu cầu trong nước là vô cùng cần thiết.
1.6. Đại cương về sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ [2], [5]
13
Sắc ký lỏng là một trong những kỹ thuật phân tích công cụ liên quan
đến quá trình tách các chất khác nhau trong cùng một mẫu ra khỏi nhau. Kỹ
thuật này cho phép người phân tích nhận danh và định lượng từng cấu tử
trong mẫu thông qua các dung dịch chuẩn và phổ đồ tương ứng của chúng.
1.6.1. Một số định nghĩa và phương trình cơ bản
1.6.1.1. Chiều rộng pic
Chiều rộng pic được đo bằng cách mở rộng hai bên pic xuống đường
nền và đo chiều rộng ở đường nền. Tuy nhiên, người ta thường đo tại bán
chiều cao picvì thực hiện dễ dàng và có độ tin cậy cao hơn.
1.6.1.2. Thời gian lưu (tr) và thời gian lưu hiệu chỉnh (tr’)
Thời gian lưu là tổng thời gian hợp chất trong pha động và pha tĩnh, có
đơn vị đo thường dùng là phút. Tại một nhiệt độ cột và tốc độ dòng cố định,
mỗi hợp chất tốn cùng một thời gian trong pha động. Thời gian trong pha
động được xác định bằng cách tiêm một hợp chất không bị lưu lại vào hệ
thống HPLC và đo thời gian lưu của nó. Thời gian lưu này được gọi là thời
gian chết của cột và biểu thị là tm hay to.
Bởi vì mỗi hợp chất tiêu tốn cùng thời gian trong pha động, sự khác
nhau trong thời gian lưu là do bởi sự khác nhau thời gian tiêu tốn trong pha
tĩnh. Nếu lấy thời gian lưu của một hợp chất trừ thời gian chết của cột (tm) ta
sẽ có được thời gian tiêu tốn thật sự của một hợp chất trong pha tĩnh, giá trị
này được gọi là thời gian lưu hiệu chỉnh (tr’) và được tính bởi:
tr’ = tr - tm (0.1)
Trong đó:
tr : thời gian lưu
tm : thời gian của pic không bị giữ lại hay thời gian chết của cột
1.6.1.3. Tỷ số phân bố
Tỷ số phân bố k hay hệ số chứa (k’) cho biết thời gian một hợp chất
nằm trong pha tĩnh bao lâu so với hợp chất khác. Nếu k = 0 thì ta nói là
hợp chất không bị lưu giữ.
14
m
mr
t
ttk −= (0.2)
Tỷ số phân bố phản ánh độ lớn thật sự lưu giữ hợp chất hơn thời
gian lưu.
1.6.1.4. Hằng số phân bố (KD)
Hằng số phân bố được định nghĩa là tỷ số nồng độ của hợp chất
trong pha tĩnh và pha động.
m
s
D C
CK = (0.3)
Cs: Nồng độ hợp chất trong pha tĩnh
Cm: Nồng độ hợp chất trong pha động
Hằng số phân bố rất tiện lợi để mô tả và đoán những thay đổi
khả năng lưu giữ dựa trên thay đổi kích cỡ và nhiệt độ cột.
1.6.1.5. Hiệu năng cột
Hiệu năng tách của cột được biểu diễn bởi số đĩa lý thuyết (n).
⎟⎟⎠
⎞
⎜⎜⎝
⎛=⎥⎦
⎤⎢⎣
⎡=
b
r
h
r
W
t
W
tn 16545,5
2
(0.4)
Wb = 1,699Wh: chiều rộng pic tại đáy
tr : thời gian lưu của pic
Wh: Chiều rộng pic tại nửa chiều cao (cùng đơn vị với tr)
Ngoài ra còn dùng số đĩa lý thuyết hiệu dụng N
2'2'
16545,5 ⎥⎦
⎤⎢⎣
⎡=⎥⎦
⎤⎢⎣
⎡=
b
r
h
r
W
t
W
tN (0.5)
Một đại lượng khác dùng để đo hiệu năng của cột là tương đương
chiều cao của một đĩa lý thuyết (h hay HETP).
n
Lh = (0.6)
n : tổng số đĩa lý thuyết
L : chiều dài của cột (mm)
15
1.6.1.6. Hệ số tách (α)
Còn được gọi là độ chọn lọc, cho biết khoảng cách giữa 2 pic.
1
2
k
k=α (0.7)
k1: tỷ số phân bố của pic giải hấp trước
k2: tỷ số phân bố của pic giải hấp sau
1.6.1.7. Độ phân giải (R)
Độ phân giải dùng để đánh giá khả năng tách giữa 2 chất
⎟⎟⎠
⎞
⎜⎜⎝
⎛
−
−=
21
1218,1
hh
rr
WW
ttR (0.8)
tr1: thời gian lưu của pic 1
tr2: thời gian lưu của pic 2
Wh1: chiều rộng ở bán chiều cao của pic 1 (cùng đơn vị với tr)
Wh2: chiều rộng ở bán chiều cao của pic 2 (cùng đơn vị với tr)
Khi độ phân giải R ≥ 1,5 thì 2 chất tách hoàn toàn khỏi nhau.
1.6.2. Những thành phần cơ bản của hệ thống LC-MS/MS (Waters)
Hệ thống gồm 7 phần chính:
Hệ thống bơm (Pump system)
Hệ thống tiêm mẫu (Injection system)
Buồng cột (Column ovent - điều chỉnh nhiệt độ cột)
Cột sắc ký (pha tĩnh – stationary phase)
Pha động (mobile phase – (hỗn hợp) dung môi)
Đầu dò khối phổ (Detector)
Hệ thống xử lý dữ liệu
16
Hình 01. Sơ đồ đơn giản của hệ thống sắc ký lỏng
1.6.2.1. Hệ thống bơm
Đặc điểm và yêu cầu của một hệ thống bơm cao áp:
- Áp suất có thể đạt đến 1000 bar (15.000 Psi)
- Có thể điều chỉnh tốc độ dòng trong khoảng 0,01 – 10 ml/min
- Thể tích chết nhỏ
- Trơ với dung môi của pha động
- Có thể trộn 2 hay nhiều dung môi với nhau
1.6.2.2. Hệ thống tiêm mẫu:
a. Đặc điểm và yêu cầu c...
