Đặt vấn đề: Sử dụng globulin miễn dịch lòng đỏ trứng gà (IgY) đã thu hút nhiều sự chú ý như là một phương tiện cho việc kiểm soát các bệnh truyền nhiễm gây ra bởi vi sinh vật. Nghiên cứu này đánh giá hiệu quả bảo vệ của IgY chống lại nhiễm trùng Vibrio anguillarum gây nhiễm vào cá ngọt( Plecoglossus altivelis). IgY đã được phân lập từ lòng đỏ trứng gà ban đầu chủng ngừa với formalin và V. anguillarum bất hoạt. Tỷ lệ tử vong thấp hơn của cá ngọt là quan sát thấy trong nhóm được điều trị bằng IgY (aVIgY) khángV. anguillarum so với những người điều trị bằng nước muối sinh lí hay với nonspecific IgY (nspIgY). Tất cả nhóm cá điều trị bằng nước muối sinh lí điều chết trong vòng bảy ngày sau khi tiêm phòng vi khuẩn.Vi khuẩn trong máu, gan, lá lách của nhóm cá được sử dụng với aVIgY thấp hơn trong cá được sử dụng với nspIgY. Điều trị với aVIgY trong việc giảm hoại tử khối u yếu tố-a (PaTNF-a), interleukin-1b (PaIL-1b), phát triển di căn -b (PaTGF-b), và bạch cầu tế bào có nguồn gốc từ chemotaxin-2 (PaLECT2) cấp tính trong thận, đầu, lá lách và gan của ayu là thách thức bởi V. anguillarum so với điều trị bằng nspIgY. Các hoạt động thực bào của các đại thực bào đối với V. anguillarum trong sự hiện diện của Specffic IgY đã cho thấy cao hơn với nonspecific IgY. Những kết quả này cho thấy rằng việc tiêm chủng thụ động bằng cách đặt nội khí quản thông qua đường miệng với tác nhân gây bệnh Specific IgY có thể gọi là một cách điều trị quan trọng đối với V. anguillarum nhiễm trong cá ngọt.
Giới thiệu.
Ayu (cá ngọt) tên khoa học Plecoglossus altivelis, thành viên duy nhất của Osmeriformes họ Plecoglossidae, là một loài cá quan trọng trong nghành nuôi trồng thủy sản của Nhật Bản, Trung Quốc và Hàn Quốc. Bệnh do vi khuẩn có là một nguyên nhân chính gây thiệt hại trong các ngành công nghiệp ở châu Á, với Vibrio anguillarum identified là một trong những tác nhân chính gây nên các mầm bệnh có hại. Trong mười năm qua, nuôi trống ayu có triển vọng tăng ở Trung Quốc, và các bệnh V. anguillarum đặt ra một mối đe dọa nghiêm trọng. Thuốc kháng sinh đã được sử dụng rộng rãi để điều trị các vi khuẩn gây bệnh lây nhiễm ở động vật thủy sản trong nhiều năm. Tuy nhiên, kháng sinh lạm dụng góp phần vào việc gia tăng số lượng các loài vi khuẩn đang trở nên đề kháng với thuốc kháng khuẩn, một trong những vấn đề nan giải trên toàn thế giới. Để giảm nguy cơ lạm dụng kháng sinh, một số biện pháp thay thế đã được khám phá và áp dụng trong nuôi trồng thủy sản , bao gồm cả việc sử dụng kháng sinh pep-IDEs, áp dụng các chế phẩm sinh học, immunostimulation , tiêm phòng [11,12], và kháng thể của lòng đỏ trứng gà mmunoglobulins (IgY).
Kháng thể lòng đỏ trứng gà (IgY) là kháng thể tìm thấy ở gà với số lượng lớn, nhưng nó cũng đang tích cực vận chuyển đến trứng trong một cách tương tự như chuyển qua nhau thai của IgG trong động vật có vú. Như một thụ động, không tốn kém, và dễ dàng sản xuất kháng thể, IgY đã thu hút nhiều sự chú ý và được công nhận là giải pháp trong cả điều trị và phòng ngừa các bệnh khác nhau. IgY rất thân thiện với môi trường và không có tác dụng phụ, bệnh kháng, hay dư lượng độc hại trong gà lẫn trứng. Các nghiên cứu đã làm sáng tỏ thành công hiệu quả bảo vệ của Specific IgYs chống lại một loạt các mầm bệnh vi khuẩn ở động vật có vú. Ví dụ, Specific trứng gà IgYs đã được sử dụng trong các con bò bị viêm chống Escherichia coli và Staphylococcus aureus. Trong nuôi trồng thủy sản, IgYs trứng gà cũng đã được sử dụng trong cá hồi vân (Oncorhynchus mykiss) chống Yersinia ruckeri và V. anguillarum, trong tôm Cray fish (Procambius clarkiaii) và (Penaeus chinensis) chống lại WSSV, và trong bào ngư nhỏ (Haliotis diversicolor supertexta) chống lại vi khuẩn Vibrio alginolyticus. Các IgY trong những nghiên cứu này đã cho thấy hiệu quả bảo vệ ở một liều lượng phụ thuộc thời gian chống lại nhiễm trùng. Tuy nhiên, nghiên cứu thêm là cần thiết để hiểu rõ hơn về cơ chế bảo vệ của IgY.
Trong nghiên cứu này, các tác động kháng V. anguillarum của IgY trên tỷ lệ tử vong do vi khuẩn và mô cytokine gen biểu hiện trong ayu, thách thức bởi V. anguillarum đã được xác định. Hoạt động của các đại thực bào cho V. anguillarum trong sự hiện diện của specific IgY cũng được đánh giá.
Vật liệu và phương pháp.
2.1. Chuẩn bị kháng nguyên
V.anguillarum ayu-H080701 phân lập từ bệnh ayu đã được sử dụng trong nghiên cứu này. V. anguillarumwere nuôi cấy qua đêm tách ra bằng cách ly tâm, rửa sạch, và tăng sinh trong môi trường nuôi cấy chứa muối (0,9 w / v NaCl) với mật độ 108 CFU / ml.Thêm Formaldehyde vào ở một nồng độ 0,5% (v / v), và các suspensionwas ủ ở khoảng 370 C trong 24 h. Tế bào được rửa hai lần với dung dịch muối vô trùng để loại bỏ formaldehyde lơ lửng trong muối vô trùng. Toàn bộ V. anguillarum đem nuôi cấy huyền phù .Vi khuẩn được bảo quản ở khoảng 4 0C trước khi sử dụng.
2.2. Phát triển của kháng thể kháng V.anguillarum ở gà.
Tất cả các thử nghiệm được thực hiện theo thực nghiệm Luật Quản lý tâm thần động vật của Trung Quốc và được chấp thuận bởi Ủy ban Đạo đức của Đại học Ningbo. Một nhóm các HyLine Gà đẻ màu trắng, 24 tuần tuổi, đã được giữ cho tiêm chủng và sản xuất trứng ở Trung tâm thiết bị vật của Đại học Ningbo.V. anguillarum được pha loãng đến 108 CFU / ml trong NaCl vô trùng 0,9% (w / v). Gà được tiêm bắp trong cơ ngực với 0,5 ml dịch chứa kháng nguyên trộn với một lượng bằng tá dược( Freund) cho các tiêm chủng đầu tiên. Sau tiêm chủng ban đầu, hai mũi tiêm tăng cường thêm mỗigồm 0,25 ml dịch chứa kháng nguyên trộn với một bằngkhối lượng không đầy đủ chất bổ trợ của Freund đã được đưa ra vào ngày 10 và 20. Trứng sau đó được thu gom hàng ngày từ tiêm chủng gà mái và bảo quản ở 4 0C cho đến khi sử dụng.
2.3. Phân lập và tinh chế IgY.
Tách IgY đã được thực hiện bằng cách kết tủa muối(ammonium sulphate ở dạng rắn) sau đó ly tâm và lọc. Tiếp theo, lòng đỏ trứng đã được tách ra khỏi lòng trắng, trộn với nước vô trùng, và đông lạnh ở 200 C qua đêm. Hỗn hợp này sau đó đã được rã đông, ly tâm ở 2500G (40 C, 45 phút) và cặn đã được bỏ đi.Thu dịch nổi phía trên và thêm ammonium sulphate (lên đến 40 %). Sau 18 giờ ở 40 C, ly tâm ở 5000G (40 C, 45 phút), và dịch đã được bỏ đi. Các viên đã lơ lửng với PBS và thẩm tách với PBS. Kháng thể kháng V. anguillarum IgY (aVIgY) là chiết xuất từ những quả trứng được tiêm chủng, trong khi finonspecic IgY(nspIgY) được chiết xuất từ sự kiểm soát. Độ tinh khiết của IgY đãđiều tra bằng natrisulfat dodecylgel polyacrylamide điện di (SDS-PAGE) dưới điều kiện giảm bằng cách sử dụng một 5%stacking gel và running gel 12%. Các gel được nhuộm với Coomassie blue giải pháp nhuộm R-250 (Bio-Rad Labo-ratories, Hercules, CA, USA)
2.4. Cá
Cá ngọt trưởng thành nặng 20-25 g thu được từ bể sạch bệnh và duy trì cung cấp trong bể với nước lọc ở 20-220 C. Cá được cho ăn một loại thức ăn thương mại cho cá.
2.5. Gây nhiễm.
Liều gây chết 50% (LD50) của V. anguillarum ayu-H080701 xác định là khoảng 5,4. 105 CFU / kg cá trong nghiên cứu này. Hai Nồng độ (100 mg / kg hay 200 mg / kg) của aVIgY hay nspIgY thông qua miệng vào trong khí quản để ayu đó được tiêm vào màng bụng (ip), đồng thời với 1,2. 104 CFU V. anguillarum mỗi con cá. Sự khác biệt của nhóm ayu mà không cần điều trị IgY đã được tiêm ip với V. anguillarum. Tỷ lệ mắc bệnh được theo dõi trong 8 ngày sau khi nhận, và kết quả đã được ghi lại mỗi 24 h.
Để xác định thời gian điều trị của aVIgY, 4 mg aVIgY thông qua miệng vào trong khí quản để Ayu trước hay sau khi tiếp nhận vi khuẩn. Đối với điều này, hai nhóm ayu được tiêm ip với 1,2. 104 CFU V. anguillarum mỗi cá tại 7 hay 14 ngày sau khi điều trị aVIgY. Hai nhóm bổ sung của Ayu đã được đặt nội khí quản qua đường miệng với 4 mg mỗi aVIgY cá ở 1 hay 2 d sau tiêm. Một nhóm các Ayu là tiêm ip với V. anguillarum mà không cần điều trị IgY. Tình trạng bệnh tật được theo dõi trong 8 ngày sau khi nhận, và kết quả là ghi lại mỗi 24 h.
2.6. Phân tích vi khuẩn chủ yếu.
aVIgY hay nspIgY tại 200 mg / kg đã được đặt vào khí quản qua đường miệng để Ayu đó được tiêm ip đồng thời với V. anguillarum. Một vi khuẩn chịu trách nhiệm được thực hiện như mô tả [2.4] trước đó. Một thời gian ngắn, máu, gan, lá lách, thận và đầu được thu hoạch vô trùng từ ayu lúc 24 h sau nhiễm (hpi). Mỗi gan, lá lách, hay đầu thận đã được đồng nhất trong 1 ml vô trùng PBS (pH7.2). Homogenates và máu đã được pha loãng trong vô trùng PBS (pH7.2) và cấy lên đĩa thạch LuriaeBertani riêng biệt. Sau khi ủ 18 giờ ở 28 C, khuẩn lạc trong các tấm được tính riêng cho từng mẫu. Gan, lách, thận và đầu mẫu được chuẩn hóa để cân tạng, và mẫu máu đã được bình thường hóa với thể tích máu.
2.7. Thay đổi biểu hiện cytokine mRNA liên quan đến IgY.
aVIgY hay nspIgY với 200 mg / kg đã được đặt vào khí quản thông qua đường miệng để Ayu đã được tiêm ip đồng thời với 1,2. 104 CFU V. anguillarum mỗi cá. Hai nhóm khác của ayu được tiêm ip với hay 1,2. 104 CFU V. anguillarum hay cùng một khối lượng nước muối mỗi cá, mà không cần điều trị IgY. Gan, thận, lá lách và đã thu thập vô trùng tại 12 hpi, đông lạnh trong nitơ lỏng, và bảo quản ở - 700 C cho đến khi sử dụng.
Những thay đổi của mRNA PaTNF-a, PaIL-1b, PaTGF-b, and PaLECT2 biểu hiện trong ayu gan, thận, lá lách và được xác định bằng thời gian thực PCR định lượng (RT-qPCR) như đã mô tả trước đây [25]. Mồi cụ thể được thiết kế theo trình tự của PaTNF-a, PaIL-1b, PaTGF-b, and PaLECT2 bảng 1.
Trong qúa trình PCR, mồi pActin2F và pActin2R được sử dụng để khuếch đại đoạn gene khoảng231- bp của b-actin mRNA [26,27]. Một ml mỗi phản ứng phiên mã ngược là một khuôn mẫu cho các 25 ml RT-qPCR phản ứng bằng cách sử dụng SYBR premix Ex Taq (Perfect Bất Thời gian) (Takara). RT-qPCR được thực hiện bằng cách sử dụng RT-CYCLER (tm) Realtime PCR huỳnh quang định lượng (CapitalBio, Bắc Kinh, Trung Quốc) với một bước biến tính ban đầu ở 95 C trong 5 phút, tiếp theo bởi sự khuếch đại của cDNA mục tiêu (35 chu kỳ của sự biến tính ở 95 C trong 30 s, ủ ở 580 C trong 30 s, và mở rộng ở 72 0C cho 30 s). Các biểu hiện mRNA của PaTNF-a, Xô-1b, PaTGF-b, và Gen PaLECT2 là bình thường đối với biểu hiện b-actin.
2.8. Khảo nghiệm thực bào của các đại thực bào.
Đa số các tế bào của Ayu có nguồn gốc thận đã được phân lập và nuôi theo báo cáo trước đó [26]. Một thời gian ngắn, thận đã được vô trùng chiết xuất, thu thập, và kếtt hợp với RPMI 1640 (Invitrogen, Thượng Hải, Trung Quốc) có bổ sung 2% huyết thanh bào thai bò (FBS) (Invitrogen), penicillin (100 U ML1 ), Streptomycin (100 mg ML1), Và heparin (20 U ML1 ). Sau khi ly tâm, các tế bào được thu thập từ các interphase, rửa sạch, và hòa tan trong RPMI 1640 có bổ sung 0,1% FBS và kháng sinh. tế bào sau đó được cấy vào giếng 35mm ở mật độ 2. 107 tế bào và ủ qua đêm ở 240 C với 5% CO2. Các tế bào huyền phù đã được rửa sạch sau khi ủ qua đêm. Các thành phần đã được thay đổi để phù hợp (4% ayu huyết thanh, 6% FBS, 100 U ML1 penicillin, 100 mg ML1 streptomycin), và các tế bào còn sót lại trong lồng ấp dưới cùng điều kiện. Trước khi nhiễm trùng, vừa được đổi kháng sinh miễn phí tế bào trung bình và được ủ thêm 12 h. Các tế bào được điều trị bằng aVIgY hay nspIgY (ở nồng độ cuối cùng 1 mg / ml), và bị nhiễm FITC-dán nhãn V. anguillarum tại một đa dạng của nhiễm trùng (MOI) là 10. Các tế bào được thu hoạch ở 30 phút sau nhiễm. Các vi khuẩn chìm đã được kiểm tra bởi huỳnh quang kính hiển vi (600 phóng đại; Nikon Eclipse tiu, Tokyo, Nhật Bản). Cường độ trung bình huỳnh quang (MFI) của vi khuẩn nhấn chìm bởi các tế bào trong nspIgY- và nhóm aVIgY-điều trị được phân tích bằng chương trình NIH ImageJ, và ít nhất 400tế bào được tính cho mỗi xét nghiệm độc lập. Kết quả được thể hiện như MFI phần trăm của sự kiểm soát và là hiện là trung bình SEM của một ví dụ điển hình từ ít nhất ba thí nghiệm độc lập.
2.9. Phân tích thống kê
Kết quả đã được phân tích theo phương pháp SEM. Tất cả các dữ liệu đã phải thực hiện một chiều hay lặp đi lặp lại theo phương pháp phân tích phương sai (ANOVA) với SPSS (phiên bản 13.0, Chicago, IL, USA), sau đó bằng phương pháp so sánh giá trị trung bình (LSD) kiểm tra các nhóm chất riêng biệt. Phương pháp KaplaneMeier đã được sử dụng để phân tích sự tồn tại. Sự khác biệt được coi là đáng kể về mặt xác suất thống kê (P) <0,05.
3. Kết quả
3.1. Phân lập và tinh chế các IgY
Trong nghiên cứu này, aVIgY cho thấy thành công bằng cách tiêm chủng gà mái với formalin-bất hoạt toàn bộ kháng nguyên nhũ hoá V. anguillarum trong tá dược Freund. IgY được tách chiết bằng việc thực hiện bởi kết tủa ammonium sulphate sau đó ly tâm và lọc. Độ tinh khiết của IgY đã được đánh giá bởi SDS-PAGE. dưới dạng sản phẩm sấy khô, các aVIgY tinh khiết có khối lượng chuỗi nặng và nhẹ là 66 và 26 kDa tương ứng (Hình. 1, dòng 1). các mô hình điện phù hợp với nspIgY (hình 1 , dòng 2).
3.2. Ảnh hưởng của IgY về sự tồn tại của V. ayu anguillarum gây nhiễm
Hai nồng độ của IgY (aVIgY hay nspIgY) đã được đặt vào khí quản thông qua miệng để ayu được tiêm cùng lúc với ip V. anguillarum, dẫn đến sự khác biệt đáng kể trong tỷ lệ cá sống (Hình 2a.). Con cá mà không được điều trị IgY đã chết trong ngày thứ 8, cá được điều trị với aVIgY 100 mg / kg hay 200 mg / kg có thể đạt được tỷ lệ sống của khoảng 50% và 80% vào ngày thứ 8, tương ứng. Tuy nhiên, tỷ lệ sống của cá được điều trị với nspIgY 100 mg / kg hay 200 mg / kg là chỉ có 10% và 15% vào ngày thứ 8, tương ứng. Dựa trên các kết quả thu được từ thí nghiệm trên, trước khi điều trị hay sau điều trị với IgY ở liều 200 mg / kg được sử dụng để phát hiện các tác dụng của aVIgY về sự tồn tại của V. anguillarum gây nhiễm trong thận cá ngọt. Con cá mà không được điều trị IgY đã chết vào ngày thứ 8. Con cá được điều trị với aVIgY 200 mg / kg 7 hay 14 ngày trước nhiễm đạt tỷ lệ sống sót của vi khuẩn là 64% và 5% vào ngày thứ 8, tương ứng. Tỷ lệ sống của cá được điều trị với 200 mg / kg aVIgY 1 hay 2 ngày sau khi nhiễm vi khuẩn là 55% và 9% vào ngày thứ 8, tương ứng.
3.3. Ảnh hưởng của IgY đến vi khuẩn V. ayu anguillarum gây nhiễm
Số lượng vi khuẩn đã được kiểm tra bởi phương pháp đếm khuẩn lạc. Số lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) mỗi mg mô hay mỗi 50 ml máu được hiển thị trong hình. 3. Vi khuẩn có trong máu của nhóm được điều trị aVIgY là 3,0. 103 CFU mỗi 50 ml, trong khi đó từ nhóm được điều trị nspIgY là 5,6. 104 CFU mỗi 50 ml. vi khuẩn có trong gan của nhóm điều trị aVIgY là 0,82.103 CFU mỗi mg, trong khi đó nhóm điều trị nspIgY là 5,2. 103 CFU mỗi mg. vi khuẩn có trong lá lách nhóm được điều trị aVIgY là 0,81.10 3 CFU mỗi mg, trong khi đó nhóm được điều trị nspIgY là 3,9. 103 CFU mỗi mg. vi khuẩn có trong đầu thận nhóm được điều trị aVIgY là 0,17.103 CFU mỗi mg, trong khi đó nhóm điều trịnspIgY là 1,14. 103 CFU mỗi mg.
3.4. Ảnh hưởng của IgY trên biểu hiện cytokine mRNA trong V. anguillaruminfected ayu
RT-qPCR được thực hiện để phân tích PaTNF-a, Xô-1b, PaTGF-b, và phiên mã PaLECT2 trong thận đầu, lá lách và gan cá ngọt được điều trị nspIgY hay aVIgY đã được tiêm ip cùng một lúc với V. anguillarum. V. anguillarum nhiễm trùng dẫn đến kể đáng tăng Pall-1b (đầu thận: 65,4 lần; lách: 121,94 lần; gan: 3,93 lần), PaTNF-a (đầu thận: 3.09 lần; lách: 6,15 lần; gan: 2,82 lần), PaTGF-b (đầu thận: 7,72 lần; lách: 2,63 lần; gan: 8,64 lần) và PaLECT2 (đầu thận: 33,28 lần; lách: 1,72 lần; gan: 13,44 lần) so với cá được tiêm nước muối sinh lí (Hình. 4). Cho nhóm V. anguillarum gây nhiễm, các biểu hiện cytokine mRNA của nhóm nspIgY được điều trị cho thấy không có sự khác biệt rõ ràng khi so sánh với những nhóm không có điều trị IgY, nhưng là cao hơn so với cá của nhóm được điều trị aVIgY (Hình. 4). nhóm được điều trị nspIgY, đã có sự thay đổi rõ rệt được quan sát thấy trong lá lách Pall 1b (giảm 12,5 lần) và PaTNF-a (giảm 4,44 lần), gan PaTGF-b (giảm 2,26 lần), và PaLECT2 đầu thận (giảm 2,54 lần).
3.5. Ảnh hưởng của IgY trên thực bào của đại thực bào
Đại thực bào có nguồn gốc thận của Ayu đã được phân lập và được sử dụng để đánh giá hiệu quả của IgY trong quá trình thực bào của FITC với V. anguillarum quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang. Kết quả cho thấy tỷ lệ phần trăm thực bào của các đại thực bào ở nhóm xử lý aVIgY cao hơn nhóm điều trị nspIgY (tăng 1,41 lần) (P <0,05) (Fig. 5).
4. Thảo luận
Là một kháng thể thụ động, không tốn kém, và dễ dàng sản xuất, IgY từ gia cầm đã thu hút nhiều sự chú ý và đã được công nhận như là một phương pháp phòng ngừa, điều trị, nguồn thực phẩm [13,14,28,29]. Những lợi thế của việc sử dụng IgY cũng được mô tả ở động vật thủy sản [30e32]. Trong nghiên cứu này, các kháng thể lòng đỏ trứng gà chống V. anguillarum đã được sản xuất, và các tác dụng bảo vệ cá ngọt khi nhiễm vi khuẩn đã được nghiên cứu. Tiêm chủng đã được chứng minh là hiệu quả trong việc chống lại V. anguillarum, và tỷ lệ sống cho cá với vaccine V. anguillarum tăng từ 64,2% đến 92,4% so với những con cá nonvaccinated [33]. Trong điều tra của chúng tôi, tỷ lệ sống tăng 65% sau điều trị aVIgY 200 mg / kg. Do đó, cả tiêm phòng và sử dụng có hiệu quả IgY chống lại nhiễm trùng V. anguillarum. Kể từ khi vắc-xin thủy sản là rất khó khăn ở Trung Quốc, việc sử dụng kháng thể IgY trong kháng khuẩn nhiễm trùng được khuyến cáo trong nuôi trồng thủy sản. Hơn nữa, tỷ lệ sống của cá ngọt tăng 55% khi điều trị với 200 mg / kg aVIgY 1 ngày sau khi nhiễm vi khuẩn. Kết quả của chúng tui cho thấy rằng IgY có thể điều trị nhiễm trùng V. anguillarum, trong khi tiêm chủng chỉ có thể ngăn chặn nhưng không điều trị nhiễm trùng. Các loại IgY cụ thể đã được chứng minh có hiệu quả trong việc thúc đẩy kháng bệnh trong một số loài động vật thủy sinh. Ví dụ, tiêm trước IgY có hiệu quả chống lại việc ngâm với Y. ruckeri hay V. anguillarum trong cá hồi vân [20,21], và đánh giá lâm sàn một chế độ ăn với IgY kháng WSSV và làm giảm đáng kể tỷ lệ tử vong của tôm sú nhiễm WSSV (Penaeus monodon) [34]. Ngoài ra, trước khi cho ăn một chế độ ăn uống với IgY kháng V. alginolyticus tăng đáng kể sự tồn tại của Bào ngư nhiễm V. alginolyticus (Haliotis diversicolor supertexta) [14]. Một nghiên cứu gần đây báo cáo rằng ngâm IgY với anti-Aeromonas hydrophila 0.5 g L1 cho thấy một tác dụng điều trị chống lại ip tiêm với 108 cfu / ml A. hydrophila ở cá trắm diếc (Carassius auratus Gibelio) [32]. Trong nghiên cứu này, cá xử lý aVIgY mà được tiêm ip đồng thời với V. anguillarum cho thấy tỷ lệ sống cao nhất (80%), và nhóm uống với aVIgY trước 7 ngày hay 1 ngày sau khi nhiễm vi khuẩn cũng cho thấy một tỷ lệ sống cao hơn (64% và 55%, tương ứng). Kết quả cho thấy rằng tác dụng của IgY cụ thể là một cách tiếp cận hấp dẫn cho thiết lập khả năng miễn dịch bảo vệ chống lại vi khuẩn gây bệnh này, Tuy nhiên, thời gian điều trị là rất quan trọng để bảo vệ hiệu quả. Mặc dù cá có thể tự sản xuất kháng thể , IgY sử dụng trong cá có vẻ có hiệu quả chống lại nhiễm trùng do vi khuẩn, cung cấp một phương pháp thay thế để kiểm soát bệnh của vi khuẩn trong nuôi trồng thủy sản. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng IgY cụ thể trưng bày khuẩn và các hoạt động diệt khuẩn bằng opsonization của vi khuẩn cho thực bào đại thực bào, hay gây ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của vi khuẩn [18,31,32,35e37]. Khi sử dụng các loại IgYs cụ thể giảm đáng kể tổng vi khuẩn trong phân của chuột [31]. Trong Nhật quản lý (Anguilla japonica), sử dụng IgYs cụ thể là báo cáo giảm số lượng vi khuẩn trong ruột [35]. Trong cá chép ingibel (C. auratus Gibelio), tác dụng của IgYs cụ thể bằng ip tiêm giảm số lượng A. hydrophila trong các mẫu thận cá chết [38]. Các nghiên cứu cho thấy rằng uống của aVIgY có thể làm giảm đáng kể số lượng vi khuẩn ở mô cá ngọt, điều này phù hợp với các báo cáo trước đó. Đó cũng báo cáo cho thấy cụ thể IgY có thể tăng cường các thực bào Hoạt động của các đại thực bào [18,36]. Immunoelectron vi Quan sát cho thấy sự gắn kết của IgY cụ thể cho các vi khuẩn bề mặt có thể dẫn đến sự thay đổi cấu trúc của bề mặt của vi khuẩn,có thể thúc đẩy thực bào của các tế bào vi khuẩn [18,39]. Trong các nghiên cứu hiện nay, điều trị aVIgY có thể làm tăng đáng kể hoạt động thực bào của các đại thực bào V. anguillarum trong ống nghiệm khi so với điều trị nspIgY, gợi ý rằng IgY cụ thể ít nhất có thể giảm bớt gánh nặng của vi khuẩn bằng cách thúc đẩy các thực bào của đại thực bào. Viêm được trung gian bởi một loạt các yếu tố hòa tan, bao gồm một nhóm các polypeptides tiết được gọi là cytokine.Cytokine đóng vai trò quan trọng trong việc làm trung gian viêm cấp tính phản ứng, chẳng hạn như IL-1b, TNF-a, TGF-b, và LECT2. IL-1b đóng vai trò quan trọng như một cytokine tiền viêm nguyên mẫu trong miễn dịch phản ứng và đã được hiển thị để tăng sản xuất cytokine, thực bào, và giết chết vi khuẩn trong các đại thực bào [40,41]. TNF-a là một cytokine tiền viêm cũng được biết đến với nhiều sinh học chức năng thông qua ảnh hưởng đến sự tăng trưởng, sự phân biệt, sự tồn tại và hoạt động sinh lý của một loạt các tế bào khác nhau [42]. TGF-b là một cytokine pleiotropic mà chủ yếu là gây sức ức chế chức năng trong hệ thống miễn dịch [42]. LECT2 là một cytokine mới được xác định tham gia vào các phản ứng miễn dịch qua trung gian đại thực bào [25,27]. Trong cá, sự biểu hiện của các gen đã được chứng minh là chặt chẽ liên quan đến Vibriosis [27,40e42]. Vì vậy, chúng tui chọn họ là đánh dấu cytokine để nghiên cứu sự ảnh hưởng của aVIgY về miễn dịch đáp ứng với nhiễm trùng V. anguillarum trong ayu. Cho đến hiện nay, hiệu ứng của IgY trên biểu hiện cytokine mRNA trong mô động vật hiếm khi báo cáo. Các nghiên cứu hiện nay cho thấy rằng biểu hiện mRNA của các cytokine trong các mô miễn dịch cá tăng lên đáng kể trong V. nhóm anguillarum nhiễm so với các nước muối được điều trị nhóm. Đặt nội khí quản bằng miệng của nspIgY không có ảnh hưởng trên biểu hiện mRNA của các cytokine trong V. ayu anguillarum nhiễm, trong khi miệng đặt nội khí quản của aVIgY ức chế biểu hiện mRNA của tất cả các cytokine thử nghiệm với các ngoại lệ của LECT2 gan. Gần đây nó đã được báo cáo LECT2 đó đã không ngăn chặn viêm sớm nhưng thay cải thiện phản ứng miễn dịch bảo vệ ở chuột nhiễm khuẩn [25], và nó là sản xuất chủ yếu ở gan [43]. Điều này có thể giải thích lý do tại sao LECT2 bảng điểm trong gan không liên quan đáng kể với aVIgY điều trị tại 12 hpi trong nghiên cứu này. Những kết quả này gợi ý cụ thể IgY có thể đóng một vai trò trong sự đàn áp của phản ứng viêm qua ức chế biểu hiện mạnh mẽ các cytokine gây viêm, mà có thể góp phần tác động có lợi trong việc nhiễm vi khuẩn cá. Trong kết luận, cho ăn cụ thể anti-V. anguillarum IgY để Ayu trước hay sau khi tiêm ip sản xuất giảm biên ở
tỷ lệ tử vong. quản lý aVIgY dẫn đến việc giảm các vi khuẩn số và biểu hiện cytokine viêm trong mô cá, và tăng cường các hoạt động thực bào của các đại thực bào chống lại V. anguillarum trong ống nghiệm. Cơ chế tác dụng bảo vệ của IgY cụ thể trong việc nhiễm vi khuẩn có khả năng diệt khuẩn của nó dựa trên (hay kìm khuẩn) tác động lên một mầm bệnh nhất định và một vai trò tiềm năng trong quy định của hệ thống miễn dịch của cá. Như vậy, cụ thể IgY tiêm chủng phải là một an toàn, chi phí-hiệu quả, và dễ dàng thực hiện kỹ thuật để kiểm soát nhiễm khuẩn trong nuôi trồng thủy sản.
Lời cảm ơn
Dự án được tài trợ bởi Chương trình cho Quốc Khoa học tự nhiên Foundation của Trung Quốc (31372555), tỉnh Chiết Giang Khoa học Foundation tự nhiên của Trung Quốc (LZ13C190001, LQ13C190002), Chiết Giang Marine đội Innovation Công nghệ sinh học (ZMBIT) (2010R50029-16), Chương trình dành cho các khoa học tự nhiên Nền tảng của thành phố Ninh Ba (2013A610166) và KC Wong Magna Quỹ tại Đại học Ningbo.
2PokZUVtG657Ezv
