Download miễn phí Đề tài Nghiên cứu hoạt chất có tác dụng ức chế enzym Lipoxygenase từ Streptomyces sp.



LỜI CẢM ƠN 1
CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT 2
ĐẶT VẤN ĐỀ 3
PHẦN 1 4
TổNG QUAN 4
1.1. VÀI NẪT VỀ KHÁNG SINH [5][6][8][11] 4
1.1.2 Định nghĨa 4
1.1.3.Cơ chế tác dụng của kháng sinh. 4
1.1.4.PHÕN LOẠI KHỎNG SINH 5
1.2.ĐẠI CƯƠNG VỀ XẠ KHUẨN [1][9][11][14][15] 9
1.2.1 Đặc điỂm cỦa xẠ khuẨn 9
1.2.2.Đặc điểm hỠNH THỎI Và SINH LỚ CỦA XẠ KHUẨN CHI STREPTOMYCES 10
1.2.3.PHÕN LOẠI STREPTOMYCES 11
1.2.4 KhẢ năng sinh tổng hỢp khỏng sinh cỦa Streptomyces 12
1.3 CẢI TẠO GIỐNG VI SINH VẬT [1][5][8][10][11][15] 12
1.3.1.Mục đích 12
1.3.2.Phân lập giống xạ khuẩn 13
1.3.3. Các phương pháp cải tạo giống 13
1.3.4. Bảo quản giống xạ khuẩn. 14
1.4. Dinh dưỡng và môi trường nuôi cấy [5] 15
1.5. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh [2][5][8] 16
1.5.1. Bản chất của quá trình lên men 16
1.5.2. Giống vi sinh vật 16
1.5.3. Các phương pháp lên men 16
1.6. Tách chiết và tinh chế [4][7] 19
1.6.1. Chiết xuất 19
1.6.2. Tách sản phẩm 20
1.7. Một số nghiên cứu mới trong sản xuất kháng sinh [12][13][16][17]. 21
1.7.1. Kháng sinh Boromycin chống HIV từ xạ khuẩn 21
1.7.2. Tinh chế và đặc trưng của serine proteinaza thuỷ phân Keratin từ Streptomyces albidoflavus. 22
1.7.3. Sản xuất 8-Demethylgeldanamycin và 4,5-Epoxy-8- demethylgeldanamycin có tác dụng điều trị ung thư vú từ Streptomyces hygroscopicus 22
1.7.4. Nghiên cứu hoạt chất có tác dụng ức chế enzym Lipoxygenase từ Streptomyces sp. 23
PHẦN 2 25
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 25
2.1.Nguyên liệu 25
2.1.1.Giống vi sinh vật 25
2.1.2.Các môi trường nuôi cấy 26
2.1.3. công cụ và hóa chất 28
2.2. Các phương pháp thực nghiệm 29
2.2.1. Phương pháp nuôi cấy và giữ giống 29
2.2.2. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuých tán 29
2.2.3. Phương pháp chọn chủng có hoạt tính kháng sinh cao bằng chọn lọc ngẫu nhiên 31
2.2.4. Phương pháp đột biến bằng ánh sáng UV 31
2.2.5 Phương pháp lên men gián đoạn 32
2.2.6. Phương pháp chiết kháng sinh bằng dung môi hữu cơ 32
2.2.7. Phương pháp xác định kháng sinh nội bào, ngoại bào 33
2.2.8. Phương pháp xác định ảnh hưởng của pH đến độ bền vững của kháng sinh trong dịch lên men 33
2.2.9. Phương pháp tách kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng 33
2.2.10. Phương pháp phân loại Streptomyces 40.16 theo ISP 34
PHẦN 3 36
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36
3.1 Xác định tên khoa học của Streptomyces 36
3.2. Khả năng tổng hợp kháng sinh của chủng Streptomyces 40.16 trên môi trường phân lập (MT1) 38
3.3. Kết quả lựa chọn môi trường nuôi cấy chủng Streptomyces 40.16 38
3.4. Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên 40
3.6. Kết quả dịch lọc thu được từ chủng Streptomyces 40.16 44
3.7.Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh 45
3.8. ảnh hưởng của pH đến độ bền vững của kháng sinh 46
3.9. Kết quả chiết xuất kháng sinh 46
3.9.1. Chiết bằng trao đổi ion 46
3.9.2.Chiết bằng dung môi hữu cơ 47
3.10.Kết quả sắc ký lớp mỏng 48
3.11. Kết quả thử độ bền của kháng sinh 49
3.12. Kết qủa thử khả năng chống nấm: 49
PHẦN 4 51
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 51
4.1. Kết luận 51
4.2. Đề xuất 51
 
 


http://s1.liketly.com/flash/edoc/web-viewer.html?file=jh2i1fkjb33wa7b577g9lou48iyvfkz6-demo-2017-08-02-de_tai_nghien_cuu_hoat_chat_co_tac_dung_uc_che_enzym_lipoxyg_3FymXXWQDO.png /tai-lieu/de-tai-nghien-cuu-hoat-chat-co-tac-dung-uc-che-enzym-lipoxygenase-tu-streptomyces-sp--93771/


Để tải tài liệu này, vui lòng Trả lời bài viết, Mods sẽ gửi Link download cho bạn ngay qua hòm tin nhắn.

Ket-noi - Kho tài liệu miễn phí lớn nhất của bạn


Ai cần tài liệu gì mà không tìm thấy ở Ket-noi, đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí

Tóm tắt nội dung tài liệu:

tư ban đầu thấp. Nhưng có nhược điểm là đòi hỏi mặt bằng lớn, hiệu xuất sử dụng thường thấp, khó cơ giới hóa và tự động hóa. Chính vì lý do đó mà ngày nay, công nghiệp kháng sinh không áp dụng lên men bề mặt trong sản xuất mà chỉ áp dụng trong các phòng thí nghiệm để chọn giống.
* Phương pháp lên men chìm:
Phương pháp lên men chìm là kiểu lên men mà VSV phát triển trong không gian 3 chiều của môi trường lỏng
Trước khi lên men phải có giai đoạn tạo giống
Giống cấp 1: Nuôi cấy trong bình nón trên máy lắc (100ml/500ml),
Giống cấp 2: Nuôi cấy trong bình giống 80l,
Giống cấp 3: Nuôi cấy trong bình 1-5m3.
Tỷ lệ giống trong môi trường là 1-10%. Tỷ lệ giống phụ thuộc vào quy mô của bình lên men.
Quá trình lên men có thể làm thay đổi các điều kiện ban đầu của môi trường: thay đổi pH, nồng độ các thành phần trong môi trường, các sản phẩm trao đổi chất, tạo bọt trên bề mặt môi trường. Để đảm bảo những điều kiện tối ưu cho sự phát triển của VSV trong quá trình lên men người ta đã đưa ra một số biện pháp như: cho thêm các chất phá bọt (mỡ cá voi, dầu thực vật, chất điều chỉnh pH hay dùng hệ đệm để ổn định pH). Cũng có thể lấy mẫu dịch lên men phân tích để đánh giá các tham số và có sự điều chỉnh (nếu cần) quá trình lên men .
- ưu điểm của phương pháp lên men chìm là:
+ Sử dụng môi trường dinh dưỡng tối ưu, đáp ứng được nhu cầu sinh lý của VSV,
+ Hệ số sử dụng không gian cao (3 chiều), hiệu suất lên men cao,
+ Các thiết bị dễ cơ giới hóa, tự động hóa, tiết kiệm mặt bằng và tốn ít nhân công.
- Nhược điểm:
Đòi hỏi phải có trang thiết bị chuyên dùng (thiết bị chịu áp lực, điều kiện vô trùng tuyệt đối) do đó chi phí đầu tư lớn.
Lên men chìm chia thành 4 kiểu chính:
- Lên men gián đoạn (lên men mẻ):
Quá trình lên men gián đoạn được xem như một hệ thống kín. Trong suốt thời gian lên men không tác động hay bổ sung gì thêm vào môi trường lên men, trừ việc cung cấp ôxi (dưới dạng không khí nén), chất phá bọt (nếu cần), điều chỉnh pH. Trong quá trình lên men VSV phát triển qua 4 giai đoạn: Pha tiềm tàng, pha log (lũy thừa), pha dừng, pha suy tàn ( hình 3).
lnx
Pha dừng
Pha log Pha suy tàn
Pha
tiềm
tàng
t(h)
Hình 3: Đường cong biểu diễn các giai đoạn phát triển của VSV trong MT lỏng.Với:
x: sinh khối khô VSV trong dịch lên men
t: thời gian lên men.
Trong công nghiệp, quá trình lên men kết thúc phụ thuộc vào việc sinh tổng hợp hoạt chất dừng lại ở pha nào trong chu kì sinh trưởng của VSV hay khi việc sinh tổng hợp hoạt chất đã bị chậm lại, nếu tiếp tục lên men sẽ không mang lại hiệu quả kinh tế.
- Lên men có bổ sung:
Lên men có bổ sung là biến tướng phát triển của lên men mẻ đống kín. Trong khi lên men, do nồng độ cao của một số chất (glucoza, các hợp chất nitơ) ức chế việc tạo ra sản phẩm trao đổi chất thứ cấp. Bởi vậy khi bắt đầu lên men các thành phần đó được đưa vào với một nồng độ thấp và được bổ sung vào hệ thống trong quá trình lên men.
- Lên men liên tục: quá trình lên men môi trường dinh dưỡng được bổ sung liên tục vào bình lên men, đồng thời lúc đó lấy ra đồng thể tích dịch lên men. Quá trình này xem như một hệ mở.
Lên men bán liên tục: Trong quá trình lên men việc bổ sung thêm môi trường dinh dưỡng và rút bớt dịch lên men không xảy ra liên tục mà định kỳ sau những khoảng thời gian xác định.
1.6. Tách chiết và tinh chế [4][7]
Trong hầu hết các trường hợp thì sản phẩm đích (kháng sinh) chỉ là một lượng rất nhỏ trong tổng số dịch lên men (0,2-30g/l). Kháng sinh là sản phẩm trao đổi chất thứ cấp, do đó kết thúc quá trình lên men kháng sinh có thể nằm trong sinh khối (ví dụ: gramicidin, nystatin) hay trong dịch lọc (ví dụ: penixilin, streptomycin) tùy thuộc vào đặc điểm của loài. Vì vậy phải chiết tách để lấy kháng sinh. Việc lựa chọn phương pháp phụ thuộc vào bản chất của kháng sinh.
Một số phương pháp tách chiết hay được sử dụng:
Phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ,
Phương pháp kết tủa,
Phương pháp dùng nhựa trao đổi ion.
Dù lựa chọn phương pháp nào thì mục đích cuối cùng vẫn là thu được một sản phẩm kháng sinh có độ tinh khiết cao. Trong công nghiệp sản xuất kháng sinh thường áp dụng một số phương pháp chiết tách và tinh chế như: lọc, chiết, hấp thụ và sắc ký.
1.6.1. Chiết xuất
* Định nghĩa: Chiết là phương pháp dùng dung môi (đơn hay hỗn hợp) không đồng tan để tách lấy một chất hay một nhóm chất từ hỗn hợp cần nghiên cứu.
* Nguyên tắc: Dựa vào sự phân bố chất tan giữa hai pha không đồng tan với nhau.
* Các phương pháp chiết lỏng – lỏng:
- Chiết đơn (chiết 1 lần): Thường cho hiệu suất thấp nhưng đơn giản, tốn ít thời gian.
- Chiết lặp (chiết nhiều lần): Hiệu suất chiết cao tuy nhiên tốn thời gian và công sức.
- Chiết ngược dòng cho kết quả tốt hơn.
1.6.2. Tách sản phẩm
* Định nghĩa: Là một nhóm các phương pháp hóa học, vật lý và hóa lý nhằm đi từ một hỗn hợp phức tạp đến những hỗn hợp đơn giản và từ hỗn hợp đơn giản tách riêng từng chất.
* Các phương pháp tách hỗn hợp đồng nhất hay được dùng:
- Phương pháp chia cắt pha: Là phương pháp đi từ hỗn hợp đồng nhất (một pha) tách thành hỗn hợp không đồng nhất (hai pha).
- Phương pháp chuyển pha: Trong nhóm này có các phương pháp như là: chiết, thẩm thấu, các phương pháp sắc ký.
* Sắc ký:
Là một nhóm các phương pháp hóa lý dùng để tách các thành phần của hỗn hợp. Sự tách sắc kí được dựa trên sự phân chia khác nhau của các chất khác nhau vào hai pha luôn tiếp xúc và không hòa lẫn vào nhau: một pha tĩnh và một pha động.
Các phương pháp sắc ký:
- Sắc ký lớp mỏng (SKLM):
Nguyên tắc: Là phương pháp tách các chất dựa trên khả năng bị hấp phụ (là chủ yếu) khác nhau của chúng trên bề mặt một chất rắn (chất hấp phụ), ở đây pha tĩnh là chất rắn, pha động là dung môi. Chọn dung môi và chất hấp phụ tùy thuộc vào chất cần xác định, nếu chất cần xác định không phân cực thì chọn chất hấp phụ có hoạt tính cao (hấp phụ mạnh) và dung môi là không hay ít phân cực. Chất phân cực ta chọn ngược lại.
- Sắc ký trao đổi ion:
Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng trao đổi thuận nghịch giữa các ion trong dung dịch chất nghiên cứu với các ion trong một chất gọi chung là nhựa ionit. Nhựa có khả năng trao đổi cation gọi là cationit, nhựa có khả năng trao đổi anion gọi là anionit. Quá trình trao đổi tuân theo định luật tác dụng khối lượng.
- Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC):
Nguyên tắc: Là phương pháp tách xác định các chất dựa trên sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha. Pha tĩnh là chất lỏng bao bọc tạo thành tấm phim mỏng trên bề mặt một chất rắn trơ (gọi là chất mang có cỡ hạt nhỏ 10 mm) được nhồi vào cột, pha động là dung môi thấm qua toàn bộ bề mặt pha tĩnh.
* Cô đặc: Sản phẩm trao đổi chất ở nồng độ thấp cần cô lại trong chân không trước khi kết tinh.
* Kết tinh: Kết tinh ở nhiệt độ thấp trên cơ sở độ tan của các chất thường giảm theo nhiệt độ.
* Sấy khô: Có nhiều phương pháp sấy trên cơ sở dùng nhiệt độ cao, độ thoáng khí hay hút.
* Nghiền vỡ tế bào VSV: Trường hợp kháng sinh là sản phẩm trao đổi chất nội bào, để thu được kháng sinh cần phá vỡ tế bào VSV, có thể dùng phương pháp vật lý, hóa học hay sinh học.
1.7. Một số nghiên cứu mới trong sản xuất kháng sinh [12][13][16][17].
1.7.1. Kháng sinh Boromycin chống HIV từ xạ khuẩn
Boromycin là kháng sinh thuộc nhóm polyête-macrolit được STH từ Streptomyces sp. A-3376, là kháng sinh chống HIV. Boromycin có khả năng ngăn chặn sự phát triển HIV ở giai đoạn cuối và có thể ngăn cản quá trình sao chép của phân tử HIV trong tiến trình trưởng thành.
Trong lên men Streptomyces sp. A-3376 tạo ra một chất ký hiệu là TMC-25, sau khi nghiên cứu đã chứng minh được TMC-25 có cấu trúc giống hệt của boromycin, kháng sinh có chứa một nguyên tử Bo. Lên men STH TMC-25 được tiến hành trên máy lắc ở 270C trong 5 ngày.
Dịch lên men thu được lọc loại bỏ sinh khối sau đó chiết bằng n-butanol, dịch chiết được tinh chế bởi phân đoạn dung môi cho ta kháng sinh ở dạng tủa thô, tiếp tục tinh chế nhờ sắc ký cột đảo pha trên silicagel ODS và Sephadex LH-20. Sau đó sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao để thu được TMC-25 dưới dạng bột vô định hình màu trắng. Cứ 24,5 lít dịch lên men đã loại bỏ sinh khối sau quá trình chiết xuất và tinh chế sẽ thu được 24,5mg TMC-25.
1.7.2. Tinh chế và đặc trưng của serine proteinaza thuỷ phân Keratin từ Streptomyces albidoflavus.
Streptomyces albidoflavus là một chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzym serine proteinaza có tác dụng thuỷ phân keratin.
Streptomyces albidoflavus khi nuôi cấy ở môi trường chứa thịt- da có thể sinh ít nhất 6 loại proteinaza ngoại bào. Dịch lên men chủng Streptomyces albidoflavus được ly tâm, lọc sơ bộ để loại bỏ sinh khối, sau đó được lọc qua màng lọc có kích thước 0,45mm( Milipore Corp., Bedford, Mass), rồi được cô đặc 10 lần bằng máy cất đặc chủng. Khi so sánh độ nhạy để ức chế enzym, các đặc trưng cơ chất với Streptomyces griseus proteinaza B (SGPB) đã cho thấy đây là một enzym mới được đặt tên là SAKaza, khá tương đồng với SGPB.
1.7.3. Sản xuất 8-Demethylgeldanamycin và 4,5-Epoxy-8- demethylgeldanamycin có tác dụng điều trị ung thư vú từ Str...

---