XÁC ĐỊNH AXIT HỮU CƠ TỪ LÁ, VỎ QUẢ BỨA BẰNG
SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP
DETERMINATION OF ORGANIC ACIDS FROM LEAVES, RIND FRUITS
OF GARCINIA OBLONGIFOLIA CHAMP. EX BENTH. BY HIGH-
PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY
ĐÀO HÙNG CƯỜNG
Trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng
ĐẶNG QUANG VINH
HV Cao học khoá 2004-2007
TÓM TẮT
Axit hữu cơ trong lá, vỏ quả bứa khô được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp. Lá
tươi và vỏ quả bứa khô được chiết với nước ở nhiệt độ 127
0
C thời gian 30-60 phút dưới áp
suất 0,15 MPa. Đồng thời, vỏ quả bứa khô được chiết bằng dung môi (axeton và metanol)
trong bộ chiết soxhlet ở nhiệt độ 75
0
C trong thời gian 8 giờ. Mẫu được bơm vào máy sắc kí
lỏng cao áp cùng với axit photphoric 0,01 M và metanol với tốc độ dòng là 0,7 ml/phút sử dụng
đetectơ 210 nm. Axit hữu cơ chủ yếu trong lá, vỏ quả bứa khô được tìm thấy là axit (-) hyđroxy
xitric hàm lượng lần lượt là 2,863 và 15,221 %. Phần axit còn lại trong lá, vỏ quả bứa là lượng
nhỏ axit xitric. Đây là kết quả đầu tiên xác định thành phần các axit hữu cơ từ bứa (Garcinia
oblongifolia Champ. ex Benth.).
ABSTRACT
Organic acids in fresh leaves and dried rinds fruits of Garcinia oblongifolia Champ. ex Benth
were determined by high-performance liquid chromatography. Fresh leaves and dried rinds
fruits were extracted with water at 127 °C for 30-60 min under 0,15 MPa pressure. Also, dried
rinds were extracted with solvents (acetone and methanol) using a Soxhlet extractor at 75 °C
for 8 h each. The samples were injected to HPLC under gradient elution with 0.01 M
phosphoric acid and methanol with a flow rate of 0.7 mL/min using UV detection at 210 nm.
The major organic acid was found to be (-)-hydroxycitric acid present in leaves and rinds fruits

H
COOHC
H
COOH
HO
C
CH
H
C=O
O
H×nh 1: CÊu tróc cña (-) axit hydroxy citric
vµ lacton cña (-) axit hydroxy citric
lặp lại
01 lần
10 g mẫu (cắt nhỏ) + 100 mL nước
Nồi áp suất 0,15 MPa, 30 phút
Lọc bằng vải muslin
Trộn lẫn dịch 02 lần chiết + 4g than
hoạt tính: ngâm trong nước ấm 30'
Lọc bằng giấy lọc, than hoạt tính
được rửa 02 lần với 15 mL nước và
lọc lại nước rửa
Trộn lẫn dịch lọc và rửa, cô đặt đến
20mL, xử lý với 100mL etanol để
15 phút để kết tủa hết pectin.
Ly tâm 10 phút, tách phần dịch nổi
và kết tủa riêng. Phần kết tủa rửa 02
lần với 20mL etanol và ly tâm để
thu hồi hết axit.
Trộn các dịch nổi, cô đặc đến thể

và kết tủa riêng. Phần kết tủa rửa 02
lần với 20mL etanol và ly tâm để
thu hồi hết axit.
Trộn các dịch nổi, cô đặc đến thể
tích 50 mL và lưu giữ ở 4
0
C đến khi
sử dụng (chuẩn độ, chạy HPLC, IR).
phá axit hữu cơ trong cây bứa tại Việt Nam là hết sức cần thiết, cây bứa có tên khoa học là
Garcinia oblongifolia Champ. ex Benth., thuộc họ Bứa (họ măng cụt) - Clusiaceae.
Bài báo này trình bày phương pháp chiết tách, xác định thành phần axit hữu cơ chính
có trong lá, vỏ quả bứa và các thông số vật lý khác.
2. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1. Nguyên liệu
Lá, vỏ quả của cây bứa (Garcinia oblongifolia Champ. ex Benth.) tại xã Hòa Liên, huyện
Hòa Vang, TP. Đà Nẵng và từ thành phố Hồ Chí Minh.
Nguyên liệu nghiên cứu lá, vỏ quả bứa được chuẩn bị theo sơ đồ ở phần 2.2.1.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu
Lá bứa: loại bỏ lá già, lá sâu, rửa sạch, hong khô tiến hành đo độ ẩm và thực hiện chiết
tách axit theo sơ đồ sau.
Quả bứa: loại bỏ quả hư, dập, quả chưa chín, rửa sạch, hong khô, tách bỏ phần ruột quả,
cắt nhỏ tiến hành xác định độ ẩm và sấy khô ở nhiệt độ 80
0
C, xoay nhỏ làm nguyên liệu để
chiết tách axit theo 02 phương pháp ở sơ đồ sau.
Lá: Vỏ quả khô:
Phương pháp 1: Phương pháp 2:
2.2.2. Phương pháp chiết tách
Chưng ninh trong nồi áp suất: Lá, vỏ quả bứa tươi hoặc khô được cắt nhỏ rồi cho

Tính kết quả: Độ axit toàn phần theo phần trăm (X
1
) tính bằng công thức:
trong đó: n: số ml NaOH 0,1N sử dụng để chuẩn độ V ml dịch thử; Vcd: thể tích mẫu
cô đặc; P: trọng lượng mẫu thử, tính bằng gam; K: hệ số của loại axit, K = 0,006904.
100.
10
m
mm
H
−
=
P
100
.
V
Vcd
.n.KX
1
=
2.2.5. Phương pháp xác định cấu trúc hoá học bằng quang phổ (IR)
Các phân tử luôn dao động không ngừng. Tần số dao động của các phân tử phụ thuộc
vào hằng số lực của liên kết và khối lượng của chúng, do đó các nhóm chức khác nhau sẽ có
tần số hấp thụ khác nhau nằm trong vùng từ 5000 – 200 cm
-1
. Mỗi nhóm nguyên tử (nhóm
chức) xác định có tần số xác định và không đổi trong bất kỳ hợp chất nào có chứa nhóm
nguyên tử đó. Vì vậy, khi phân tích trên quang phổ hồng ngoại ta có thể xác định được các
nhóm nguyên tử mà chất đem phân tích có được.
2.2.6. Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) [3] [4]

chứa 10-320 ppm HCA tự do được tiêm vào HPLC, thao tác rửa giải được thực hiện như phần
thảo luận ở trên, và kết quả thu được các diện tích pic. Đường cong HCA được vẽ dựa trên
biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ của HCA và diện tích pic (trung bình của 03 lần chạy).
Tương tự, đường chuẩn của axit xitric được tiêm vào HPLC, được thực hiện như cách thảo
luận trên, và kết quả thu được các diện tích pic.
Khoảng nồng độ mẫu chuẩn cần để xây dựng đường chuẩn được xác định dựa vào
nồng độ thực của HCA có trong mẫu. Khoảng nồng độ này tính từ giá trị giới hạn dưới
(LLOQ) đến giá trị giới hạn trên (ULOQ).
Xác định giá trị giới hạn: Giá trị giới hạn (LOQ) được định nghĩa như nồng độ thấp
nhất của HCA mà có thể xác định với độ tin cậy và chính xác <20%.
Xác định axit hữu cơ có trong mẫu: Mẫu được chuẩn bị bằng cách pha loãng theo tỉ
lệ 1:100 với nước cất 02 lần cất, ngoại trừ dịch chiết lá bứa pha loãng với tỉ lệ 1:25, quả chiết
bằng methanol tỉ lệ 1:50. Thể tích của mỗi mẫu được tiêm vào HPLC là 20 µL, HCA, axit
xitric thu được trực tiếp dựa vào diện tích pic, bằng cách áp dụng hệ số pha loãng và sử dụng
đường chuẩn. Nồng độ của HCA và axit xitric trong mẫu được trình bày bằng g/100 g mẫu.
Phương pháp chuẩn độ axit-bazơ có thể sử dụng để xác định axit hữu cơ trong dịch
chiết, phương pháp này giúp ta xác định được tổng lượng axit có trong dịch chiết. Tuy nhiên,
trong phương pháp này không thể định lượng axit (-) hyđroxy xitric và axit xitric một cách
riêng biệt. Ta cũng có thể xác định các axit bằng phương pháp sắc kí khí, trong phương pháp
sắc kí khí ta phải sấy mẫu. Nhưng axit HCA sẽ bị lacton hoá khi có tác nhân nhiệt. Trong
phương pháp sắc kí lỏng cao áp, ta có thể định lượng HCA và các axit hữu cơ khác mà không
cần phải cô đặc, sấy, hoá hơi dung dịch chiết. Đây là điểm thuận lợi để có thể định lượng (-)-
HCA và các axit hữu cơ một cách riêng biệt.
3. Kết quả và thảo luận
3.1. Kết quả xác định độ ẩm trong lá vỏ quả bứa
Kết quả xác định độ ẩm trong lá, vỏ quả bứa được trình bày trong bảng 1 sau đây:
Bảng 1. Kết quả xác định độ ẩm trong lá, vỏ quả Bứa
Mẫu Stt
mẫu
Khối lượng lá

0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
0.50
0.55
0.60
0.65
Absorbance
500
1000
1500
2000
2500
3000

3500
4000
Wavenumbers (cm-1)
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12

chuẩn độ được thể hiện trong bảng 2. Tổng axit xác định bằng phương pháp chuẩn độ axit-
bazơ có kết quả lớn hơn tổng axit xác định bằng HPLC. Từ bảng trên cho thấy, chiết bằng
dung môi nước cho lượng axit là lớn nhất, tiếp đến là axeton và metanol. Giá trị thu được chủ
yếu của phương pháp HPLC được tính đến chỉ là HCA, bởi vì giá trị thu được từ diện tích pic
của HCA lớn nhất. Axit chủ yếu được tìm thấy trong lá, vỏ quả bứa bằng HPLC là HCA, được
thể hiện trên sắc kí đồ hình 5, 6, 7, 8. Pic thứ yếu được xác định là pic của axit xitric. Trên sắc
kí đồ, HCA cho pic đơn trong tất cả các mẫu chiết. Riêng đối với mẫu lá bứa chiết trong nước
không xuất hiện pic của axit xitric. Xác định pic HCA được dựa vào pic của axit HCA chuẩn
xuất hiện ở thời gian lưu là 4,939 phút, tương tự pic của axit xitric xác định nhờ pic axit chuẩn
xuất hiện ở thời gian lưu là 5,623 phút (hình 4). Thời gian lưu của HCA và axit xitric được tìm
thấy trong tất cả các mẫu lần lượt là 4,992 ± 0,065, 5,609 ± 0,010 phút.
Đường chuẩn được xác định bằng cách thay đổi nồng độ của 05 mẫu chuẩn. Đường
chuẩn được xây dựng với nồng độ từ 10 đến 320 ppm, phương trình đường chuẩn: C = 1,37A-
6,88 với A là diện tích pic của HCA, C là nồng độ HCA, hệ số tương quan R
2
=0,999698.
Hình 4. Sắc kí đồ mẫu axit HCA và axit xitric chuẩn Hình 5. Sắc kí đồ mẫu vỏ quả bứa khô chiết trong metanol
Hình 6: Sắc kí đồ mẫu vỏ quả bứa khô chiết trong nước Hình 7: Sắc kí đồ mẫu vỏ quả bứa khô chiết trong axeton
Hì
nh 8: Sắc kí đồ mẫu lá bứa chiết trong nước
4. Kết luận
Bằng phương pháp sắc kí lỏng cao áp (HPLC) đã xác định được hàm lượng axit hữu cơ
trong lá, vỏ quả bứa. Kết quả cho thấy axit (-) hyđroxy xitric là thành phần axit chủ yếu có
trong lá, vỏ quả bứa. Hàm lượng HCA tìm thấy trong lá, vỏ quả bứa khô là khá cao, cụ thể
HCA trong lá, vỏ quả bứa khô lần lược là 2,863 và 15,221 %.
Từ kết quả này có thể tiếp tục nghiên cứu sâu để sản xuất thực phẩm chữa trị béo phì từ
cây bứa Việt nam.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1]
Đỗ Tất Lợi (2005), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.