Nghiên cứu vi sinh vật để xử lý chất thải chăn
nuôi dạng rắn Phạm Bích Hiên Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Khoa Sinh học
Luận án Tiến sĩ ngành: Vi sinh vật học; Mã số: 62 42 40 01
Người hướng dẫn: PGS.TS. Phạm Văn Toản, GS.TS. Nguyễn Đình Quyến
Năm bảo vệ: 2012 Abstract. Chương 1. Trình bày tổng quan về chất thải chăn nuôi và biện pháp xử lý;
vi sinh vật tham gia quá trình xử lý chất thải hữu cơ. Chương 2. Vật liệu và phương
pháp: các mẫu thu thập và chủng vi sinh vật, hóa chất; phương pháp: phân loại vi
sinh vật; xác định hoạt tính sinh học của vi sinh vật; xác định hiện trạng chất thải
chăn nuôi; thử nghiệm và đánh giá hiệu quả của chế phẩm. Chương 3. Kết quả và
thảo luận: thực trạng chất thải tại một số cơ sở chăn nuôi; nghiên cứu vi sinh vật để
xử lý chất thải chăn nuôi; nghiên cứu sản xuất chế phẩn vi sinh vật để xử lý chất thải
chăn nuôi ứng dụng chế phẩm vi sinh vật xử lý chất thải chăn nuôi hiệu quả sử dụng
phân hữu cơ từ chất thải chăn nuôi đối với cây trồng.

Keywords. Sinh học; Vi sinh vật học; Xử lý chất thải; Phế thải chăn nuôi

Content

MỞ ĐẦU
1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA LUẬN ÁN
Việt Nam là nước nông nghiệp, trong thời kỳ đổi mới ngành chăn nuôi có những bước

khoáng góp phần phát triển sản xuất nông nghiệp an toàn, bền vững.
4. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN
- Cung cấp 4 chủng vi sinh vật an toàn, có hoạt tính sinh học cao trong sản xuất chế phẩm vi
sinh xử lý chất thải chăn nuôi, tạo phân hữu cơ góp phần giảm lượng phân hoá học và nâng
cao hiệu quả sản xuất của nông dân.
- Đề xuất giải pháp giảm thiểu ô nhiễm môi trường trong chăn nuôi qui mô trang trại góp
phần phát triển bền vững ngành chăn nuôi.
BỐ CỤC LUẬN ÁN:
Luận án bao gồm: Phần mở đầu (3 trang); tổng quan tài liệu (37 trang); vật liệu và
phương pháp (17 trang); kết quả và thảo luận (71 trang); kết luận và kiến nghị (2 trang); danh
mục công trình liên quan đến luận án; danh mục 122 tài liệu tham khảo và các phụ lục. Luận
án có 45 bảng, 42 hình.
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Chất thải chăn nuôi và biện pháp xử lý
1.1.1. Chất thải chăn nuôi và nguy cơ ô nhiễm môi trƣờng
 Chất thải chăn nuôi: Là chất thải ra trong quá trình chăn nuôi, gồm ba dạng chủ yếu:
Chất thải rắn (bao gồm chủ yếu là phân, chất độn chuồng, thức ăn thừa và đôi khi là xác gia
súc, gia cầm chết hàng ngày); chất thải lỏng (bao gồm nước rửa chuồng, nước tắm cho vật
nuôi, nước tiểu, một phần phân); chất thải bán lỏng (gồm cả chất thải rắn và chất thải lỏng).
 Nguy cơ ô nhiễm môi trƣờng:
- Ô nhiễm do kim loại nặng: Các nguyên tố vi lượng, kim loại nặng, vật nuôi không tiêu hoá
hết bài tiết ra ngoài theo đường phân làm thoái hoá đất, ức chế hoạt động của VSV, ô nhiễm
nước ngầm, tích tụ trong nội tạng người và vật nuôi là nguyên nhân gây các loại bệnh tật.
- Ô nhiễm do khí độc: Trong phân, nước thải của lợn có khoảng 40 loại khí độc khác nhau
sinh ra từ quá trình thối rữa thức ăn thừa và xác động thực vật do hoạt động sống của vi
khuẩn yếm khí. Các khí thải H
2
S, NH
3,
CH

1.2. Vi sinh vật tham gia quá trình xử lý chất thải hữu cơ
Hệ vi sinh vật trong chất thải chăn nuôi gồm nhiều nhóm VSV có hoạt tính sinh học khác
nhau giữ vai trò hết sức quan trọng trong chu trình chuyển hóa các hợp chất hữu cơ thành các
chất mùn mà cây trồng có thể sử dụng được. Ở đây chúng tôi chỉ đề cập các nhóm VSV có
khả năng phân huỷ các hợp chất phổ biến, là thành phần chính trong chất thải chăn nuôi gồm
xenluloza, tinh bột, protein và VSV có khả năng ức chế các vi khuẩn gây bệnh đường ruột, vi
khuẩn gây thối.
1.2.1. Vi sinh vật phân giải xenluloza
Xenluloza là thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật. Trong tự nhiên khu hệ VSV
có khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza phân giải xenluloza vô cùng phong phú, bao gồm
vi khuẩn, xạ khuẩn và vi nấm. Xenlulaza là một phức hệ 3 enzym (Endo-1,4-glucanaza, Exo-
1,4-gluconaza, -1,4-glucozidaza) hoạt động cùng nhau để thuỷ phân xenluloza tạo ra các
loại đường có thể đi qua thành tế bào VSV.
1.2.2. Vi sinh vật phân giải tinh bột
Amylaza là hệ enzym rất phổ biến đối với VSV. Cơ chất xúc tác của amylaza là tinh bột
và glycogen, theo tính chất và cách tác dụng lên tinh bột, phân biệt amylaza thành các loại:
-amylaza, -amylaza, glucoamylaza và oligo 1-6 glucozidaza. -amylaza gặp ở hầu hết các
loại VSV như nấm sợi, nấm men giả, vi khuẩn có bào tử và xạ khuẩn.
1.2.3. Vi sinh vật phân giải protein
VK có khả năng sinh ra cả hai loại proteaza (endopeptidaza và exopeptidaza), do đó
proteaza của VK có tính đặc hiệu cơ chất cao. Các VK có khả năng tổng hợp proteaza mạnh
nhất. Nhiều loại nấm mốc cũng có khả năng tổng hợp một lượng lớn proteaza còn xạ khuẩn ít
được nghiên cứu hơn.
1.2.4. Vi khuẩn lactic sinh tổng hợp axit lactic và bacterioxin
Vi khuẩn lactic có khả năng sinh axit lactic làm tăng sự phân hủy các hợp chất hữu
cơ, là chất tiệt trùng được ứng dụng nhiều trong bảo quản, chế biến thực phẩm, trong y, dược
và xử lý môi trường. Gần đây vi khuẩn lactic còn được đặc biệt quan tâm nghiên cứu về khả
năng sinh bacterioxin là các chất diệt khuẩn thế hệ mới có phổ kháng khuẩn đa dạng, tính đặc
hiệu tế bào đích cao, an toàn với người, vật nuôi, cây trồng và môi trường là giải pháp cho
vấn đề kiểm soát các nguồn bệnh

định nồng độ trung bình một số khí thải và vi sinh vật gây bệnh tại các điểm điều tra đều vượt
ngưỡng cho phép (bảng 3.1.).
Bảng 3.1. Môi trƣờng không khí tại các trang trại chăn nuôi
Nơi đánh giá
Chỉ tiêu đánh giá (số liệu trung bình 3 nơi đánh giá)
Độ nhiễm khuẩn
không khí (CFU/m
3
)
Nồng độ H
2
S
(mg/m
3
)
Nồng độ NH
3
(mg/m
3
)
1. Khu tập kết chất thải nuôi
lợn
5,8 ± 0,45 x 10
6

0,36 ± 0,05
(4,5
a
)
3,12 ± 0,06

đó nồng độ H
2
S trong chuồng nuôi gà cao gấp 83,4 lần so với giới hạn và trong chuồng nuôi
lợn gấp 64,4 lần; Nồng độ NH
3
trong chuồng nuôi gà cao gấp 30,6 lần so với giới hạn và
trong chuồng nuôi lợn gấp 24,15 lần. Sở dĩ có sự sai khác là do khác nhau về thời điểm
nghiên cứu, mô hình chăn nuôi và địa điểm lấy mẫu trong chuồng nuôi và ngoài khu vực tập
kết chất thải.
Bảng 3.2. Mật độ vi sinh vật gây bệnh và ký sinh trùng trong chất thải chăn nuôi
Chất thải chăn nuôi
Mật độ tế bào vi khuẩn (CFU/g)
Trứng
giun/g
VKTS *
E. coli
Salmonella sp
1. Chất thải nuôi lợn
6,58±0,6 x 10
6

2,20±0,5x 10
5

1,2±0,2x 10
3

105± 4,8
2. Chất thải nuôi gà
7,10 ±0,4x 10

chủng phân giải tinh bột và 6 chủng phân giải protein. Trong đó, sàng lọc được 15 chủng
sinh trưởng mạnh, hoạt tính sinh học ổn định và đa hoạt tính chúng tôi tuyển chọn được
chủng xạ khuẩn ký hiệu XK112 có khả năng phân giải xenluloza cao nhất (kích thước VPG
đạt 34mm); chủng VK B20 có hoạt tính phân giải tinh bột mạnh nhất (kích thước VPG đạt
38mm); chủng VK B15 có hoạt tính phân giải protein mạnh nhất (kích thước VPG đạt 30
mm). Từ 22 mẫu thu thập trên địa bàn Hà Nội đã phân lập được 7 chủng VK lactic, lựa
chọn chủng LH19 sinh bacterioxin và ức chế chủng VK gây thối Erwinia carotovora KT03.
Kết quả thử nghiệm khả năng ức chế chéo trên môi trường thạch cho thấy 4 chủng LH19,
XK112, B20 và B15 không ức chế nhau, 4 chủng VSV trên được tuyển chọn cho nghiên cứu
tiếp theo.
Bảng 3.7. Hoạt tính sinh học của 4 chủng vi sinh vật tuyển chọn
Kí hiệu
chủng
Kích thước vòng phân giải (D-d) mm
Hàm lượng
axit lactic
(mg/ml)
Kháng E.
carotovora KT03
(D-d, mm)
Xenluloza
Tinh bột
Protein
XK112
34
20
-
-
-
B20

Hình 3.5. Hoạt tính
kháng E. carotovora
KT03 của chủng
LH15
3.2.2. Định tên và xác định độ an toàn sinh học các chủng vi sinh vật tuyển chọn
3.2.2.1. Định tên vi sinh vật bằng phƣơng pháp truyền thống
Chủng XK112: Sau 48- 72 giờ nuôi cấy trên môi trường Gauze ở 35- 37
0
C, khuẩn
lạc chủng XK112 có hình tròn, bề mặt khô, nhăn, đường kính 2- 2,5 mm, màu trắng xám,
chân khuẩn lạc bám sâu vào môi trường thạch. Chuỗi bào tử dạng thẳng, mỗi chuỗi có từ 15
đến 35 bào tử.
Hình 3.6. Hình thái cuống sinh bào tử, bào tử
của chủng XK112
Hình 3.10. Hình thái khuẩn
lạc của chủng XK112
Chủng B20: Chủng VK B20 thuộc Gram (+), kỵ khí không bắt buộc. Nuôi cấy trên
môi trường King B ở nhiệt độ 30
0
C, sau 48 giờ khuẩn lạc khô, màu nâu nhạt, mép có thùy, có
đường kính 0,5-1 mm. Tế bào chủng B20 hình que, ngắn, kích thước 5,2 x 0,8 m. Bào tử
hình ovan
Hình 3.7. Hình dạng tế bào của chủng B20
Hình 3.11. Hình thái

LH19
Cả 4 chủng đều có khả năng đồng hóa đa dạng với các nguồn hydratcacbon, trong đó có
chủng vừa có khả năng phân giải CMC hoặc tinh bột vừa có khả năng thuỷ phân gelatin,
cazein. Đặc tính này thuận lợi cho việc lựa chọn môi trường nhân sinh khối sản xuất đồng
thời phù hợp với mục đích sử dụng VSV để xử lý chất thải chăn nuôi giàu các hợp chất
hydratcacbon và protein.
Căn cứ vào tất cả các kết quả về đặc điểm hình thái, các phản ứng sinh hoá của 4 chủng
VSV, dựa vào khoá phân loại của Bergey, có thể sơ bộ khẳng định chủng XK112 thuộc chi
Streptomyces, có đặc điểm tương tự như loài S. griceosporeus; chủng B20 thuộc chi Bacillus,
có đặc điểm tương tự như loài B. licheniformis; chủng B15 thuộc chi Bacillus, có đặc điểm
tương tự như loài B. subtilis; chủng LH19 thuộc chi Lactobacillus, có đặc điểm tương tự như
loài L. plantarum.
3.2.2.2. Định tên vi sinh vật bằng kỹ thuật sinh học phân tử
Kết quả giải trình tự gien cho thấy: Chủng XK112 có trình tự gien ARNr 16S tương đồng
tới 99,7% (1245/1250 bp) so với trình tự của chủng XK S. griseosporeus có ký hiệu
AB184419. Chủng B20 có trình tự gen ARNr 16S tương đồng 99,9 % (1429/1430 bp) với
trình tự gien của chủng B. licheniformis_X68416. Trình tự gien ARNr 16S của chủng B15
tương đồng 99,9% (1449/1451 bp) với đoạn 16S của Bacillus subtilis. Chủng LH19 có trình
tự ARNr 16S tương đồng 99,9% với các loài của nhóm Lactobacillus plantarum, nằm cùng
vị trí với Lactobacillus pentosus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum.
 Căn cứ vào kết quả định danh theo phương pháp truyền thống và bằng kỹ thuật sinh
học phân tử cho phép xác định chủng XK112 là Streptomyces griseosporeus, chủng
B20 là Bacillus licheniformis, chủng B15 là Bacillus subtilis, chủng LH19 là
Lactobacillus plantarum.
 Cả 4 chủng VSV nghiên cứu đều thuộc nhóm 1, đảm bảo độ an toàn sinh học đối với
người, vật nuôi, cây trồng và môi trường, được phép sử dụng trong sản xuất nông
nghiệp.
3.2.3. Một số yếu tố môi trƣờng ảnh hƣởng đến khả năng phân giải chất hữu cơ của các
VSV
3.2.3.1. Ảnh hƣởng đến khả năng phân giải xenluloza của chủng XK112

52,8
35
5400
31
15
91,2
40
6200
34
16
100
45
5600
32
16
94,1
50
3600
31
15
92,2
55
440
31
14
92,0
60
22
19
11

(x 10
6
CFU/ ml)
Kích thước VPG (D-d, mm)
Hoạt tính
tương đối (%)
CMC
Bột giấy
4
5,0
0,18
20
11
58,0
5
5,4
6,4
22
12
64,3
6
6,8
320

26
14
76,5
7
7,3
5600

nhiệt độ khác nhau 30, 37, 40, 50, 55
0
C. Sau 48h xác định mật độ tế bào và hoạt tính amylaza
trên môi trường thạch đĩa chứa tinh bột tan, nhuộm màu với thuốc thử Lugon.

Hình 3.18. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sinh trưởng và khả năng phân giải tinh bột của chủng
B20
Chủng B20 sinh trưởng và tổng hợp amylaza trong dải nhiệt độ 30-55
0
C nhưng thích
hợp ở 30- 50
0
C, sinh khối và hoạt tính đạt giá trị cao nhất ở nhiệt độ 37
0
C. Khoảng nhiệt độ
này là phù hợp với giai đoạn 15 ngày đầu của quá trình xử lý chất thải chăn nuôi, khi đó quá
trình phân giải tinh bột trong khối ủ sẽ diễn ra mạnh nhất. Kết quả này phù hợp với nghiên
cứu của Ashger và cs, Nadia riaz và cs cho rằng nhiệt độ tối ưu cho khả năng tổng hợp
amylaza của Bacillus subtilis là 40
0
C. Ngô Xuân Mạnh và cs đã lựa chọn nhiệt độ tối ưu nuôi
cấy chủng B. licheniformis BCRP để thu nhận enzym -amylaza là 42
0
C, cao hơn nhiệt độ tối
ưu của chủng B20.
* Ảnh hưởng của pH
Chủng B20 được nuôi lắc 220 vòng/phút trên môi trường dịch thể với các pH khác nhau
gồm: 4,0, 5,0 , 6, 6,5, 7,0, 7,5 và 9,0. Sau 48h xác định mật độ tế bào và hoạt tính amylaza
của dịch nuôi.


0
15
21,2
30
4,5
2
15
92,2
30
29,5
4
15
40,3
Nồng độ Ca
2+

(mM)
Thời gian xử lý
(phút)
Hoạt tính tương đối (%)
30
20,5
Nồng độ Ca
2+
thích hợp là 2 mM trong thời gian xử lý nhiệt là 15 phút. Kết quả thử
nghiệm này phù hợp với các nghiên cứu của các tác giả khác đã công bố cho rằng Ca
2+
làm
ổn định hoá cấu trúc bậc III của enzym amylaza khi ở nhiệt độ cao (Nguyễn Thị Hoài Hà;
Kwak và Akiba).

hợp với giai đoạn 2-10 ngày đầu của quá trình xử lý chất thải chăn nuôi. Sản phẩm của quá
trình phân giải protein tạo các axit amin là nguồn cung cấp dinh dưỡng cho các VSV trong
quá trình chuyển hoá tiếp theo. Kết quả này phù hợp với kết quả của một số nghiên cứu khác
(Kim J. M và cs xác định nhiệt độ nuôi cấy tối ưu cho vi khuẩn B. subtilis tổng hợp proteaza
là 40
0
C. Nghiên cứu của Đỗ Bích Thuỷ và cs lại cho thấy chủng B. subtilis có hoạt tính
proteaza cao nhất khi nuôi ở nhiệt độ 35
0
C).
* Ảnh hưởng của pH
Chủng B15 được nuôi lắc trong môi trường dịch thể thích hợp ở các điều kiện pH
khác nhau trong khoảng từ 5 đến 9. Xác định khả năng sinh trưởng (OD) và hoạt độ enzym
proteaza trong dịch nuôi cấy (PA), kết quả thể hiện trên hình 3.21 Hình 3.21. Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng và khả năng phân giải protein của chủng B15
Hình 3.21 cho thấy: Sinh khối đạt mức cao nhất ở pH 7,0 (OD 2,6), pH tối ưu cho tổng
hợp proteaza là 7,5 (đạt 0,98 HP/ml). Khoảng pH thích hợp cho chủng B15 sinh trưởng và
tổng hợp enzym proteaza là 6,0-8,0 hoàn toàn phù hợp với quá trình xử lý chất thải chăn
nuôi. Trong một số nghiên cứu khác, tác giả Kim J. M và cs xác định pH nuôi cấy thích hợp
cho vi khuẩn B. subtilis tổng hợp proteaza là từ 5 đến 6, pH tối ưu là 7. Nghiên cứu của Đỗ
Bích Thuỷ và cs lại cho thấy chủng B. subtilis có hoạt tính proteaza cao nhất khi nuôi ở pH 8.
* Ảnh hưởng của ion kim loại: Các ion kim loại được sử dụng là: Ca
2+
, Ba
2+
, Mg
2+
, Cu

0,702
0,693
101,47
Mg
2+

0,682
0,704
0,693
101,54
Cu
2+

0,334
0,311
0,323
47,253
Fe
2+

0,629
0,647
0,638
93,48
Zn
2+

0,294
0,382
0,338


Ba
2+
và
Mg
2+

3.2.4. Hoạt tính đối kháng của chủng LH19
3.2.4.1. Khả năng đối kháng vi khuẩn gây bệnh, gây thối rữa
* Đối kháng vi khuẩn gây bệnh
Các chủng VK được nuôi cấy riêng rẽ sau 48 giờ trong môi trường dịch thể ở điều kiện
thích hợp, cho tiếp xúc trực tiếp VK lactic với từng chủng VK kiểm định. Xác định khả năng
tồn tại của mỗi chủng trong hỗn hợp sau các khoảng thời gian nhất định.
Bảng 3.14. Khả năng đối kháng vi khuẩn gây bệnh cho ngƣời và vật nuôi của chủng
LH19
Chủng kiểm định
Mật độ ban đầu
(CFU/ml)
Mật độ sau khi tiếp xúc với chủng LH19 theo thời
gian (CFU/ml)
6h
24h
48h
72h
E. coli
4,8 x 10
6

6,3 x 10
4

-
-
S. aureus
3,6 x 10
6

6,2 x 10
3

-
-
-
(-): Không xác định được ở nồng độ pha loãng 10
-1

Kết quả cho thấy chủng LH19 đối kháng được cả 4 chủng VK gây bệnh thử nghiệm, thời
gian ức chế nhanh (sau 6h tiếp xúc, nồng độ tế bào các VK gây bệnh đều giảm mạnh,
Shigella, Staphylococcus giảm từ 10
6
xuống 10
3
CFU/ml;

E. coli và Salmonella

giảm từ 10
6

xuống 10
4

3,6 x 10
4

-
-
LH19
1,4 x 10
8

2,2 x 10
8

4,6 x 10
8

3,08 x 10
8

10
6

E.carotovora KT03
3,2 x 10
6

1,06 x 10
4

-
-

protein kháng khuẩn hay không? Để tìm hiểu rõ yếu tố kháng khuẩn của chủng LH19, nghiên
cứu tiến hành các thử nghiệm xác định khả năng sinh tổng hợp bacterioxin của chủng LH19
 Xác định phổ kháng khuẩn
Mục tiêu của thí nghiệm là tìm phổ kháng khuẩn của chủng LH19 trong điều kiện sinh
trưởng và của dịch ly tâm đã được trung hòa pH để làm giảm tác động kháng khuẩn của axit
lactic, từ đó xác định được yếu tố kháng khuẩn của LH19. Căn cứ vào các công trình nghiên
cứu đã được công bố về bacterioxin của VK lactic, chúng tôi lựa chọn bộ chủng giống VK
kiểm định có cùng họ hàng hoặc cạnh tranh về dinh dưỡng, môi trường cư trú. Kết quả đánh
giá nhanh, định tính phổ kháng khuẩn của LH19 bằng phương pháp đục lỗ thạch và cấy chấm
điểm cho thấy chủng LH19 có phổ ức chế tương đối rộng với các chủng kiểm định thuộc cả
VK Gram (+) và VK Gram (-). Tuy nhiên khi điều chỉnh dịch nuôi cấy về pH trung tính để
loại bỏ tác động của axit lactic thì phổ ức chế bị thu hẹp lại, trong khi khả năng ức chế một số
VK gram (-) giảm xuống rõ rệt, vòng ức chế mờ, hầu hết nhỏ hơn 10 mm thì dịch nuôi cấy đã
trung hòa vẫn ức chế mạnh nhóm gram (+) trong đó có các chủng gây bệnh như E. faecalis và
S. aureus và khá nhiều loài VK lactic nhưng lại không ức chế các chủng L. plantarum là VK
sinh ra bacterioxin đó. Kết quả thử nghiệm này rất có ý nghĩa, phù hợp với các kết quả
nghiên cứu trước đây cho phép đưa ra khả năng chủng L. plantarum LH19 sinh tổng hợp
bacterioxin kháng khuẩn.
 Xác định bản chất của chất kháng khuẩn
Để khẳng định bản chất của bacterioxin của VK lactic có phải là protein hay không,
chúng tôi nuôi cấy VK LH19 trong môi trường MRS dịch thể, sau 14 giờ đem ly tâm thu dịch
nổi. Điều chỉnh về pH6,5; xử lý dịch ly tâm với các enzym proteaza (nồng độ 0.2 mg ml
-1
)
theo tỉ lệ 1:1. Mẫu đối chứng dương (dịch nuôi cấy VK với đệm phốtphát theo tỷ lệ 1:1). Các
mẫu thí nghiệm được ủ ở 37
o
C trong 2 giờ, dừng phản ứng bằng tác động nhiệt ở 100
o
C/15

hành điện di trên gel Tricine SDS-PAGE. Sau khi điện di, cắt đôi bản gel, nửa có marker
được nhuộm Coomasie brilliant blue, nửa còn lại được rửa (với 35% cồn, 2% glycerol 30÷60
phút, rửa nước cất vô trùng 15÷30 phút) để xác định hoạt tính kháng khuẩn. Đặt bản gel lên
đĩa petri vô trùng đã có sẵn 1 lớp thạch, sau đó đổ 1 lớp thạch bán lỏng có chứa chủng kiểm
định S. aureus. Úp ngược đĩa để trong tủ lạnh 4 giờ, sau đó nuôi 30
0
C trong 24 giờ. A: Điện di trên gel acrylamide 16%
1: Thang protein chuẩn;
2: Tủa bacterioxin từ dịch nuôi cấy
B: Vùng ức chế S.aureus do bacteriocin
từ bản gel tạo ra sau khi điện di tricine-
SDS- PAGE). Hình 3.25. Điện di tricine SDS- PAGE xác định kích thước và kiểm tra
hoạt tính bacterioxin của chủng LH19
Kết quả điện di cho thấy, bacterioxin do chủng LH19 tổng hợp có khối lượng phân tử
khoảng 3,5 kDa. Kết quả xác định hoạt tính kháng của bacterioxin tại bản gel sau điện di đối
với chủng kiểm định S. aureus cũng đã khẳng định kết quả này.
 Xác định độ bền của bacterioxin
Trong khoảng nhiệt độ <80
0
C và -20
0
C bacterioxin duy trì hoạt tính trong 120 phút. Đặc
biệt vẫn có hoạt tính kháng khuẩn ở 80
0

14
30
2,2
23,5
19
35
3,2
27,9
22
40
2,3
21,2
17
45
1,2
8,4
8
50
0,7
5,0
6
Kết quả ở bảng 3.20 cho thấy chủng VK lactic LH19 thể hiện hoạt tính kháng khuẩn
trong dải nhiệt độ 25- 50
0
C. Ở nhiệt độ 35
0
C thì OD, hàm lượng axit lactic, kích thước vòng
kháng khuẩn đều đạt mức cao nhất (lần lượt là 3,2; 27,9 mg/ml và 22mm). Khả năng sinh
trưởng, tổng hợp axit lactic và kháng khuẩn giảm nhanh ở nhiệt độ 45
0

với E. carotovora (D-
d,mm)
4
0,9
16,8
18
5
1,6
25,3
19
6
2,2
29,2
22
7
3,2
30,5
22
8
2,4
25,0
17
9
1,2
19,6
13
Ở pH 4- 9 chủng LH19 đều có khả năng sinh trưởng, tổng hợp axit lactic và bacterioxin.
Tuy nhiên ở pH 4, khả năng sinh trưởng của chủng LH19 kém (OD chỉ đạt 0,9) do đó hàm
lượng axit lactic cũng ở mức thấp (16,8 mg/ml). Khả năng sinh trưởng (OD) và sinh tổng hợp
axit lactic tăng nhanh ở pH 5-7, đạt cao nhất ở pH 7 (lần lượt là 3,2 và 30,5mm/ml), ở pH 9,

30
23
Rỉ đường
28

32
22
Bảng 3.22 cho thấy chủng LH19 có khả năng tổng hợp chất kháng khuẩn ở cả 3 nguồn
đường. Glucoza là nguồn đường tốt nhất (Mật độ tế bào, lượng axit lactic và kích thước vòng
kháng khuẩn cao nhất, lần lượt là 4,6x 10
9
CFU/ml, 30 mg/ml, 23 mm). Trên môi trường rỉ
đường cũng cho lượng axit lactic và vòng kháng khuẩn cao tương đương. Như vậy có thể sử
dụng rỉ đường để thay thế glucoza trong điều kiện sản xuất qui mô lớn hoặc tại địa phương có
sẵn nguồn nguyên liệu rỉ đường.
* Ảnh hưởng của các muối nitơ vô cơ
Chủng LH19 được nuôi trên môi trường dịch thể trong các điều kiện thích hợp với sự bổ
sung các muối amon (0,1% nitơ trong phân tử muối amon). Sau 48h, xác định khả năng sinh
trưởng và ức chế vi khuẩn E. carotovora KT03 của chủng LH19.
Bảng 3.23. Ảnh hƣởng các muối nitơ vô cơ đến sinh trƣởng và hoạt tính của chủng
LH19
Muối nitơ
Khả năng sinh trưởng
(OD, 600 nm)
Đường kính vòng vô khuẩn với
E. carotovora (D-d,mm)
(NH
4
)
3

4
Cl
2,4
16
NH
4
NO
3

2,5
18
NH
4
H
2
PO
4

1,7
15
Amoni xitrat là thích hợp nhất cho sinh trưởng và khả năng kháng khuẩn của LH19 (OD
đạt 3,3, ĐT vòng vô khuẩn đạt 22 mm). Sự khác nhau này có thể do gốc xitrat có tính đệm
cao và tính axit yếu nên không làm giảm pH của môi trường nhiều như các gốc khác. Kết quả
thử nghiệm này là phù hợp vì amoni xitrat được chọn là nguồn nitơ vô cơ trong môi trường
nuôi cấy chuẩn.
3.3. NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH VẬT XỬ LÝ CHẤT THẢI
CHĂN NUÔI
- Điều kiện nhân sinh khối VSV: Kết quả nghiên cứu động thái sinh trưởng của 4 chủng
VSV (ở các mốc thời gian 24, 48, 72, 96h) đã xác định được thời gian nuôi cấy để mật độ tế
bào đạt mức cao nhất, từ đó xác định được thời điểm thu sinh khối thích hợp nhất đối với

Thông số kỹ thuật
Chủng vi khuẩn
XK11
2
B20
B15
LH19
pH
7,3 ± 0,2
7,0 ± 0,2
7,0 ± 0,2
6,5 ± 0,2
Nhiệt độ nhân sinh khối (
o
C)
37 ± 2
30 ± 2
30 ± 2
35 ± 2
Thời gian nhân sinh khối (giờ)
72
48
48
48
Tỷ lệ giống gốc (%)
3
3
3
3
Môi trường nhân sinh khối


Kiểm tra
hoạt tính

Nhân giống cấp
I
Nhân giống cấp
I

Nhân giống
cấp I

X khun phân giải
xenluloza (Streptomyces
griseosporeus)
Vi khuâ
̉
n phân giải tinh
bột (Bacillus licheniformis)
Vi khun lactic kháng
khun, khư
̉
mu
̀
i hôi
(Lactobacillus
plantarum)

Môi trường lên
men cấp II

Hình 3.27. Sơ đồ Quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh vật xử lý chất thải chăn nuôi
3.3.3. Chất lƣợng chế phẩm
Bảng 3.29. Khả năng tồn tại của 4 chủng vi sinh vật trong chế phẩm
Chủng
VSV
Mật độ tế bào (x 10
8
CFU/ml)
0 giờ
7
ngày
1
tháng
2
tháng
3
tháng
6 tháng
XK112
5,6
40
56
52
42
4,6
B20
4,4
32
45
36


Lên men xốp

Nhân giống cấp
II

Lên men xốp

Bổ sung
dinh
dưỡng
Sấy khô

LH19
3,6
32
12
62
1,4
0,42
Bảng 3.30. Hoạt tính của 4 chủng XK112, B20, B15 và LH19 trong chế phẩm
Chủng
VSV
Đường kính vòng phân giải (D-d, mm) sau thời gian bảo
quản
Đường kính vòng
kháng E.
carotovora KT03
(D-d, mm)
Xenluloza

-

22
20
28
27
-
-
LH19
-
-
-
-
-
-
22
20
Sau 3- 6 tháng bảo quản, các chủng VSV vẫn tồn tại tốt trong chế phẩm; mật độ tế bào
của 3 chủng XK112, B20, B15 đạt 10
9
CFU/g sau 3 tháng và 10
8
CFU/g sau 6 tháng, riêng
chủng LH19 mật độ tế bào thấp hơn (đạt 10
8
CFU/g sau 3 tháng và 10
7
CFU/g sau 6 tháng).
Hoạt tính sinh học của các chủng sau 3 tháng bảo quản đều tương đương so với hoạt tính ban
đầu (bảng 3.7), sau 6 tháng hoạt tính vẫn tương đối ổn định. Như vậy, các yếu tố kỹ thuật lựa Hình 3.29. Sơ đồ Quy trình sử dụng chế phẩm vi sinh vật xử lý chất thải chăn nuôi
3.4.1.1. Động thái nhiệt độ đống ủ
Khảo sát biến động nhiệt độ đống ủ trên 2 loại chất thải chăn nuôi gà và lợn dạng rắn. Thí
nghiệm với 2 công thức: Đối chứng (ĐC) không xử lý bằng VSV và thí nghiệm (TN) xử lý
bằng VSV.
Bảng 3.31. Biến động nhiệt độ trong quá trình xử lý chất thải chăn nuôi
Thời gian theo dõi
(ngày)
Nhiệt độ khối ủ chất thải
nuôi lợn (
0
C)
Nhiệt độ khối ủ chất thải
nuôi gà (
0
C)
ĐC
TN
ĐC
TN
0
29,0
29,0
29,5
29,5
2

51 / 41,2
51,5 /
35,0
18
45,7
40,2
46,0
42,5
21
46,0
35,5
47,2
36,0
24
46,5
34,6
48,3
35,0
Làm khô, đóng bao,
kiểm tra, sử dụng

Trích đoạn Tiếng Việt

---