1
Sàng lọc đột biến gen sửa chữa bắt cặp sai
MLH1 liên quan đến ung thư ruột kết không
polyp di truyền ở người Việt Nam

Lê Thị Lan Anh

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Luận văn ThS chuyên ngành: Di truyền học; Mã số: 60 42 70
Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Hồng Vân
Năm bảo vệ: 2012 Abstract: Thu thập các mẫu bệnh phẩm (máu và mô) của các bệnh nhân đã được xác
định ung thư đại trực tràng và dạ dày. Nhân bản một số exon quan tâm của gen MLH1
bằng kỹ thuật (phản ứng chuỗi nhờ polymeraza) PCR. Phân tích và xác định các đột biến
ở một số exon nghiên cứu bằng (phân tích đa hình cấu hình sợi đơn) SSCP và (tính đa
hình độ dài đoạn giới hạn) RFLP. Giải trình tự ADN một số mẫu đã được xác định đột
biến bằng sàng lọc ở bước trên.

Keywords: Di truyền học; Di truyền học phân tử; Đột biến gen; Ung thư ruột kết Content
MỞ ĐẦU
Trong hơn 20 năm qua, những phát minh to lớn của di truyền học phân tử đã góp phần
thúc đẩy sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, nhiều kỹ thuật sinh học phân tử khác
ngày càng được ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả trong việc phát hiện, chẩn đoán và điều trị
bệnh, trong đó có bệnh ung thư.
Theo Tổ chức Y tế Thế giới, ước tính hàng năm trên thế giới có khoảng 10,1 triệu

Gen ung thư (oncogenes) có thể định nghĩa là dạng gen đột biến làm tăng nguy cơ ung
thư hoặc làm thúc đẩy sự phát sinh ung thư. Các gen ung thư cũng có thể được coi như các
dạng alen đặc biệt của các gen bình thường xuất hiện do kết quả của đột biến [3].
Gen ức chế khối u là những gen khi bị bất hoạt không còn ức chế sự sinh sản của tế bào
có thể gây tổn thương ADN và do đó cung cấp cho các khối u một lợi thế tăng trưởng.

3
1.2. Hội chứng ung thƣ ruột kết
Ung thư đại trực tràng (Colorectal cancer – CRC) được chia thành 3 dạng chính là rải rác,
gia đình và di truyền.
Ung thư đại trực tràng di truyền lại được chia thành 3 nhóm chính: Sinh polyp u tuyến
theo dòng họ (FAP), Ung thư ruột kết không polyp di truyền (HNPCC - Hội chứng Lynch) và
Hội chứng giống Lynch. Hội chứng Lynch được lấy theo tên nhà khoa học đầu tiên công bố về
căn bệnh này.
1.3. Hội chứng ung thƣ ruột kết không polyp di truyền (Hội chứng Lynch)
1.3.1. Đặc điểm di truyền của HNPCC
HNPCC là một hội chứng di truyền trội trên nhiễm sắc thể thường, gây nên bởi những
đột biến dòng mầm gây bất hoạt ở những gen tham gia vào hệ thống sửa chữa bắt cặp sai
(MMR): MLH1, MSH2, MSH6 và PMS2, trong đó chủ yếu là gen MLH1 và MSH2 [14].
1.3.2. Đặc điểm lâm sàng và phổ khối u
Không giống với FAP, HNPCC không được đặc trưng bởi số lượng tăng lên của các
polyp. Ở các bệnh nhân HNPCC, thường thì số các u tuyến giống với tỉ lệ chung của quần
thể. Tuy vậy, các u tuyến xuất hiện ở các bệnh nhân HNPCC có nguy cơ tiến triển thành ung
thư cao hơn nhiều. [17, 36]
.
1.3.3. Chẩn đoán lâm sàng
Những bệnh nhân mắc HNPCC thường hình thành ung thư khi còn khá trẻ, tuổi trung
bình của chẩn đoán ung thư dạ dày là 56 tuổi, với ung thư u biểu mô đường ruột là loại bệnh lý
phổ biến nhất được báo cáo. HNPCC kết hợp với ung thư buồng trứng có độ tuổi chẩn đoán
trung bình là 42,5, khoảng 30% được chẩn đoán trước tuổi 40 [33].

protein được tổng hợp từ gen MLH1 gồm 756 axit amin.
1.5. Một số kỹ thuật di truyền sử dụng trong nghiên cứu HNPCC
1.5.1. Kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn (RFLP: Restriction Fragment Length
Polymorphism)
Kỹ thuật RFLP là một kỹ thuật phổ biến được sử dụng trong sinh học phân tử. Sản phẩm
PCR sau khi được nhân lên sẽ được tiến hành cắt bằng enzym giới hạn phù hợp thành các đoạn
ngắn hơn, dựa vào số lượng và kích thước của các đoạn ADN thu được mà có thể phát hiện ra
những sai khác di truyền xuất hiện trong đoạn gen đó.
1.5.2. Kỹ thuật phân tích đa hình sợi đơn (SSCP: Single Strand Conformation Polymorphism)

5
Nguyên tắc: Trong điều kiện điện di không biến tính, các mạch đơn ADN sẽ có một cấu
hình nhất định tùy theo trình tự của nó. Cấu hình này được xác định bởi các liên kết nội phân tử.
Các cấu hình sẽ khác ngay cả khi chỉ khác một nucleotit. Sự khác biệt này dẫn đến sự khác về
khả năng di chuyển trong gel polyacrylamide.
1.5.4. Phương pháp giải trình tự ADN
Nguyên tắc của phương pháp dideoxy dựa trên việc bổ sung các dẫn xuất tương ứng của
các dNTP là 2’, 3’ – dideoxynucleotit (viết tắt là ddNTP) vào thành phần phản ứng tổng hợp
ADN trong ống nghiệm. Do ddNTP thiếu nhóm C3’- OH nên một khi nó được gắn vào mạch
ADN đang tổng hợp thì quá trình tổng hợp sẽ dừng lại. Do đó, thu được một hỗn hợp nhiều phân
tử ADN được sao chép không hoàn chỉnh giống nhau ở đầu 5’ được đánh dấu và khác nhau ở
đầu 3’ về chiều dài và loại nucleotit kết thúc chuỗi. Sau đó, các sản phẩm này được phân tách
trên bản điện di [4].
1.6. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài
1.6.1. Mục tiêu nghiên cứu
Sàng lọc các đột biến ở một số exon trên gen MLH1 bằng các kĩ thuật PCR-RFLP và
PCR-SSCP, góp phần cung cấp dữ liệu về đột biến ở gen này và mở ra hướng nghiên cứu tiếp
theo cho các gen MMR khác nhằm ứng dụng trong chẩn đoán sớm ung thư đại trực tràng không
polyp di truyền tại Việt Nam.
1.6.2. Nội dung nghiên cứu của đề tài

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Thu thập và bảo quản mẫu
2.2.2. Phương pháp tách chiết ADN tổng số
2.2.3. Xác định độ tinh sạch và hàm lượng ADN tổng số
2.2.4. Kỹ thuật PCR
2.2.5. Phân tích đa hình sợi đơn (SSCP - Single Strand Conformation Polymorphism)
2.2.6. Phản ứng cắt bằng enzym giới hạn
2.2.7. Giải trình tự gen

7
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tách chiết ADN tổng số

(A)

(B)
Hình 1. (A) Kết quả tách ADN tổng số từ mẫu mô. (B) Kết quả tách ADN tổng số từ mẫu máu.
Kết quả điện di cho thấy, ADN tổng số được tách chiết từ các mẫu khác nhau đều chỉ cho
1 băng duy nhất, đậm nét với kích thước xấp xỉ băng 23,1 kb của thang chuẩn λ/ Hind III. Các
mẫu ADN tổng số đảm bảo yêu cầu chất lượng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2. Phản ứng PCR
3.2.1. Kết quả tối ưu phản ứng PCR
Chúng tôi đã thu được nhiệt độ gắn mồi cho kết quả tốt nhất và ổn định nhất cho mỗi
exon như sau: exon 19 T
m
= 58
0
C, exon 18 T
m
= 52

8

(A)
(B)
Hình 3. (A) Sản phẩm PCR exon 14 gen MLH1. (B) Sản phẩm PCR exon 16 gen MLH1 (A)

(B)
Hình 4. (A) Sản phẩm PCR exon 17 gen MLH1. (B) Sản phẩm PCR exon 18 gen MLH1 (A)

(B)
Hình 5. (A), (B) Sản phẩm PCR exon 19 gen MLH1
Từ các kết quả thu được, có thể kết luận chúng tôi đã tiến hành nhân bản thành công 7
exon của gen MLH1: exon 8, exon 13, exon 14, exon 16, exon 17, exon 18 và exon 19 đúng kích

9
thước và rất đặc hiệu. Sản phẩm PCR nhân bản các exon có thể sử dụng được cho các bước sàng
lọc đột biến gen MLH1 tiếp theo.
3.3. Kết quả phân tích SSCP

(A)

(B)
Hình 6. (A) Kết quả phân tích SSCP exon 8 gen MLH1. (B) Kết quả phân tích
SSCP exon 13 gen MLH1. Hình chữ nhật màu đỏ chỉ vị trí đột biến


Hình 10. Sản phẩm cắt exon 16 và sản phẩm PCR exon 16 điện di trên gel agarose 2%
3.4.2. Kết quả xử lý exon 19 bằng enzym CviQI

Hình 11. Sản phẩm cắt exon 19 bằng enzym CviQI điện di trên gel polyacrylamide 12%
Kết quả trên tương ứng với dự đoán là tất cả các đối tượng nghiên cứu đều mang kiểu gen
đồng hợp tử C/C, tức là không có cá thể nào mang gen đột biến ở vị trí bộ ba mã hóa 718 của
exon 19.
3.4.3. Kết quả xử lý exon 18 bằng enzym CviQI

Hình 12. Sản phẩm cắt exon 18 bằng enzym CviQI điện di trên gel polyacrylamide
12%, Hình chữ nhật màu đỏ chỉ vị trí đột biến.

12
Kết quả chúng tôi thu được khi tiến hành phản ứng cắt với mẫu T19 và T20 có số lượng
băng giống với kết quả chúng tôi dự đoán nếu có đột biến xảy ra tại vị trí nucleotit 2104 (G A)
với kiểu gen dị hợp G/A. Để khẳng định kết quả thu được, chúng tôi tiến hành phân tích trình tự
ADN exon 18 từ hai bệnh nhân này.
3.5. Kết quả giải trình tự ADN và so sánh trình tự
3.5.1. Phân tích trình tự exon 13 của mẫu mô từ bệnh nhân số 6
Ở mẫu mô bệnh phẩm của người số 6, từ kết quả giải trình tự exon 13 (ký hiệu mẫu:
13T6-R), chúng tôi đã phát hiện thấy có sự thay đổi nucleotit G>A ở vị trí 203. Đây là đột biến ở
thể dị hợp tử thay thế nucleotit dạng đồng hoán dẫn tới đột biến nhầm nghĩa: sự thay đổi
nucleotit có thể dẫn tới sự thay thế axit amin tương ứng Threonin thành Isoleucine (hoặc Leu
thành Phe) – Hình 13. Tuy nhiên, chúng tôi không phát hiện được đột biến dịch khung ở trình tự
này.
5


ĐC

13T6-R

ĐC

13T6-R

ĐC

13T6-R

ĐC

13T6-R
(A)

13

(B)
Hình 13. (A) Kết quả so sánh trình tự exon 13 của đối chứng và bệnh nhân số 6 (mẫu 13T6-R).
(B) Trình tự ngược của exon 13 gen MLH1 cho thấy có đột biến ở thể dị hợp tử thay thế tại vị trí
203 G>A (vị trí mũi tên)
3.5.2. Kết quả phân tích trình tự exon 14 từ mẫu T19
Khi so sánh với trình tự ADN đối chứng, chúng tôi nhận thấy có hai biến đổi ở trình tự
gen của bệnh nhân 19 so với đối chứng. Chúng tôi đã phát hiện thấy có sự thay đổi nucleotit
C>G ở vị trí 176 (mũi tên thứ nhất Hình 14B), ở vị trí 185 trên exon này, nucleotit T cũng bị thay
bởi nucleotit A (vị trí mũi tên thứ hai Hình 14B).
18


ĐC

14T19-
F

ĐC

14T19-
F

(B)

14
Hình 14. (A) Kết quả so sánh trình tự exon 14 của đối chứng và bệnh nhân số 19 (mẫu 14T19).
(B) Trình tự xuôi của exon 14 gen MLH1 cho thấy có đột biến thay thế tại vị trí 176C>G và một
đột biến thay thế ở vị trí 185T>A
3.5.3. Phân tích trình tự exon 18 từ mẫu T20
Chúng tôi nhận thấy có sự tương đồng 100% giữa ADN của exon 18 ở hai mô này. Kết
quả cho thấy sự phát sinh khối u tại mô đại trực tràng của bệnh nhân này chưa thấy có mối liên
quan với sự biến đổi của exon 18 gen MLH1. Để có kết luận chắc chắn hơn về điều này, cần giải
trình tự của các phân đoạn khác của gen MLH1.

10

TTCACCTGGT CCAAAGAAAT TCAATACCTC AAAATAGGTA
CGAATTTAAA CATTCTCATT
********** ********** ********** ********** ********** **********
TTCACCTGGT CCAAAGAAAT TCAATACCTC AAAATAGGTA
CGAATTTAAA CATTCTCATT

CTAAACGGAG ATCACAGACT AC
********** ********** **
CTAAACGGAG ATCACAGACT AC
ĐC

18T20-
R

ĐC

18T20-
R

ĐC

18T20-
R

ĐC

18T20-
R

ĐC

TATGTACTGC TTCCGGATGG AATAGAACAT AGCGCATTCT
TTACTGAGGC TTTCAAAACA
********** ********** ********** ********** ********** **********
TATGTACTGC TTCCGGATGG AATAGAACAT AGCGCATTCT
TTACTGAGGC TTTCAAAACA

TTCCTTTTCT TCGTCCCAAT TCACCTGGTC CAAAGAAATT
CAATACCTCA AAATAGGTAC
********** ********** ********** ********** ********** **********
TTCCTTTTCT TCGTCCCAAT TCACCTGGTC CAAAGAAATT
CAATACCTCA AAATAGGTAC

GAATTTAAAC ATTCTCATTC TAAACGGAGA TCACACGACT ACTTTT
********** ********** ********** ********** ******
GAATTTAAAC ATTCTCATTC TAAACGGAGA TCACACGACT ACCTTT
R

18B19-
R

18T19-
R

18B19-
R

18T19-
R

18B19-

nucleotit đều được phát hiện ở các mẫu mô, không phát hiện được ở các mẫu máu tương
ứng. Điều này chứng tỏ những đột biến mà chúng tôi xác định được đều là các đột biến
soma.
II. KIẾN NGHỊ
Trên cơ sở kết quả nghiên cứu này, chúng tôi có một số kiến nghị như sau:
1. Tiếp tục tiến hành phân tích đột biến ở các exon còn lại của gen MLH1 bằng kỹ thuật
PCR-SSCP và các kỹ thuật di truyền khác (SSR, HET, DGGE ) để xác định các dạng
đột biến thuộc gen MLH1 có thể có ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng Việt Nam.
2. Mở rộng nghiên cứu các gen MMR khác (MSH2, MSH6…) nhằm xây dựng một cơ sở dữ
liệu về đột biến gen MMR ở người Việt Nam. References
Tiếng Việt
1. Trịnh Đình Đạt (2009), Công nghệ sinh học, Tập 4, NXB Giáo Dục, Hà Nội.
2. Võ Thị Thương Lan (2007), Một số vấn đề cơ bản của sinh học phân tử, NXB Đại Học Quốc
Gia Hà Nội.

17
3. Đinh Đoàn Long, Đỗ Lê Thăng (2009), Cơ sở Di truyền học Phân tử và Tế bào, NXB Đại
học Quốc gia Hà Nội.
4. Khuất Hữu Thanh (2006), Kỹ thuật gen nguyên lý và ứng dụng, NXB Khoa Học Kỹ Thuật.
Tiếng Anh
5. Aaltonen L, Peltomaki P, Leach FS, Sistonen P, Pylkkanen L, Mecklin J-P, Jarvinen H, et al.
(1993), “Clues to the pathogenesis of familial colorectal cancer”, Science, 260: 812-816.
6. Aarnio M, Mecklin JP, Aaltonen LA, Nystrom-Lahti M, Jarvinen HJ. (1995), “Life-time
risk of different cancers in hereditary non-polyposis colorectal cancer (HNPCC) syndrome
”,
Int J Cancer, 20: 430-43.
7. Aarnio M, Sankila R, Pukkala E, Salovaara R, Aaltonen L, de la Chapelle A, Peltomaki P,

st
ed.
18. Griffiths AJF, Miller JH, Suzuki DT, et al. (2000), An Introduction to Genetic Analysis, 7th
edition, W. H. Freeman, New York.
19. Girado A, Gomez A, Salguero G, Garcia H, Aristizabal F, Gutierrez O, Angel L.A, Padron J,
Martinez H, Malaver O, Florez L, Barvo R (2005), “MLH1 and MSH2 mutations in
Colombian families with hereditary non-polyposis colorectal cancer (Lynch syndrome)
description of four novel mutations”, Fam Cancer, 4: 285-290.
20. Han HJ, Maruyama M, Baba S, Park JG, Nakamura Y (1995), “Genomic structure of human
mismatch repair gene hMLH1, and its mutation analysis patients with hereditary non-
polyposis colorectal cancer (HNPCC)”, Hum Mol Genet, 4: 237-242.
21. Hendriks YM, de Jong AE, Morreau H, et al (2006), “Diagnostic approach and management
of Lynch syndrome (hereditary nonpolyposis colorectal carcinoma): a guide for clinicians”,
CA Cancer J Clin, 56(4): 213-238.
22. Herman JG, Umar A, Polyak K, et al. (1998), “Incidence and functional consequence of
hMLH1 promotor hypermethylation in colorectal carcinoma”, Proc Nalt Acad Sci USA, 95:
6870-6875.
23. Huang J, Kuismanen SA, Liu T, et al. (2001), “MSH6 and MSH3 are rarely involved in
genetic predisposition to nonpolypotic colon cancer”, Cancer Res, 61(4): 1619-1623.

19
24. Iaccarino I, Marra G, Palombo F, Jiricny J (1998), “hMSH2 and hMSH6 play distinct roles in
mismatch binding and contribute differently to the ATPase activity of hMutSalpha”, EMBO
J, 17(9): 2677-2686.
25. Ionov Y, Peinado MA, Malkhosyan S, Shibata D, and Perucho M (1993), “Ubiquitous
somatic mutations in simple repeated sequence reveal a new mechanism for colonic
carcinogenesis”, Nature (Lond), 363: 558-561.
26. Jiricny J (2000), “Mediating mismatch repair”, Nat Genet, 24(1): 6-8.
27. Kane MF, Massimo L, Giada GM, Lipman J, Mishra R, Goldman H, Jessup J. M, and
Kolodner R (1997), “Methylation of the hMLH1 promoter correlates with lack of expression

Drouhard, Kenneth W. Kinzler, Bert Vogelstein, Henry T. Lynch, Albert de la Chapelle, and
Paivi Peltomaki (1994), “Mismatch Repair Genes on Chromosomes 2p and 3p Account for a
Major Share of Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer Families Evaluable by Linkage”,
Am J Hum Genet, 55(4): 659–665.
38. Modrich P (2006), “Mechanisms in eukaryotic mismatch repair”, J Biol Chem, 281(41):
30305-30309.
39. Ohmiya N, Matsumoto S, Yamamoto H, Baranovskaya S, Malkhosyan SR, Perucho M
(2001), “Germline and somatic mutations in hMSH6 and hMSH3 in gastrointestinal cancers
of the microsatellite mutator phonotype”, Gene, 272(1-2): 301-313.
40. Orita M, Iwahana H, Kanazawa H, Hayashi K, Sekiya T, (1989), “Detection of
polymorphism of human DNA by gel electrophoresis as single strand conformation
polymorphism”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 2766-2770.
41. Papp J, Kovacs ME, Olah E (2007), “Germline MLH1 and MSH2 mutational spectrum
including frequent large genomic aberrations in Hungarian hereditary non-polyposis
colorectal cancer families: implications for genetic testing”, World J Gastroenterol,13(19):
2727-2732.
42. Peltomaki P (2001), “Deficient DNA mismatch repair: a common etiologic factor for colon
cancer”, Hum Mol Genet, 10: 735-740.
43. Peltomaki P (2005), “Lynch syndrome genes”, Fam Cancer, 4(3): 227-232.
44. Peltomaki P, Vasen H (2004), “Mutations associated with HNPCC predisposition-update of
ICG-HNPCC/INSIGHT mutation databases”, Dis Markers, 20: 269-276.

21
45. Sambrook J, Russell DW (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3
rd
Ed, Cold
Spring Harbor Laboratoty Press, Cold Spring Harbor, New York.
46. Shin KH, Ku JL, Park JG. (2002), “Mutational analysis of promoters of mismatch repair
genes hMSH2 and hMLH1 in hereditary nonpolyposis colorectal cancer and early onset
colorectal cancer patients: identification of three novel germ-line mutations in promoter of

hMLH1 mutations responsible for hereditary nonpolyposis colorectal cancer cluster at the
exonic region 15-16”, Am J Ham genet, 58: 300-307.
59. Yamashita K, Dai TY, Yamamoto F, Perucho (2003), “Genetics supersedes epigenetics in
colon cancer phenotype”, Cancer cell, 4: 121-131.
60. Young KS, Seung CH, Joo HS, Sung HH, Ja LK, Byong CY, Il JK, Jae GP, (2004),
“Germline mutations in MLH1, MSH2 and MSH6 in Korean HNPCC families”, Human
mutation, Mutation in brief, 748.
61. Zhang J, Lindroos A, Ollila S, et al. (2006), “Gene conversion is a frequent mechanism of
inactivation of the wild-type allele in cancers from MLH1/MSH2 deletion carriers”, Cancer
Res, 66(2): 659-664.
Trang web
62.
63.
64. Polymorphism
SSCP Analysis-by-Nondenaturing-PAGE-3468.html
65.
66.