DẠI IIỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯ ỜN G ĐẠI MỌC KHOA H Ọ C TỤ NHIÊN
BÁO CÁO TÕ NG HỢP
T r ê n d ể tà i:
NVGIiIÊN CỨU ĐỘT BIÉN GEN SỬA CHỮA BA I CẶP SAI (MMR)
LIIÊN QUAN ĐẾN ƯNG THU ĐẠI TRựC TRÀNG KHÔNG POLYP
DI TRUYỀN Ở NGƯỜI VIỆT NAM
Mã số: QG.11.15
Chủ trì Đề tài: TS. Nguyễn Thị Hồng Vân
Các cán bộ tham gia: ThS. Trần Thị Thùy Anh
ThS. Lê Văn Quảng
CN. Hoàng Hải Yến
BS. Hà Hải Nam
H à N ộ i, 2 0 1 3
£ ồ ỉ CÃMÊL đ ễ t
Đ ể tà i Q G .1 1 .1 5 th ự c h i ệ n ã ư ợ c v ó i s ự h ỗ t r ợ v ề k i n h p h í c ủ a Đ ạ i h ọ c
Q u ố c g ia H à N ộ i . C h ú n g tô i x i n tr â n tr ọ n g c ả m ơ n s ự q u a n t â m h o t r ợ
c ủ a c á c c ấ p lã n h đ ạ o Đ ạ i h ọ c Q u ố c g ia H à N ộ i tr o n g q u á t r ì n h c h ú n g tô i
th ự c h i ệ n đ ề tà i.
C á c t h à n h v i ê n t h ự c h i ệ n đ ề tà i c h â n th à n h c ả m ơ n B a n G i á m h i ệ u v à
c á c P h ò n g c h ứ c n ă n g c ủ a T r ư ờ n g Đ ạ i h ọ c K h o a h ọ c T ự n h iê n v ề s ự g i ú p
đ ỡ v à tạ o đ iề u k i ệ n c h o v i ệ c n g h i ê n c ứ u đ ề tà i.
Đ ể tà i đ ư ợ c th ự c h iệ n v ó i s ự h ỗ t r ợ v ề c ơ s ở v ậ t c h ắ t, t r a n g t h i ế t b ị v à
s ự q u a n t â m ủ n g h ộ c ủ a K h o a S i n h h ọ c , P h ò n g t h í n g h i ệ m T r ọ n g đ iể m
C ô n g n g h ệ E n z y m v à P r o te in , T r ư ờ n g Đ ạ i h ọ c K h o a h ọ c t ự n h iê n . C h ú n g
tô i x i n c ả m ơ n v ề n h ũ n g đ ó n g g ó p q u ý b á u đó .
C h ú n g tô i c ũ n g x i n c h â n t h à n h c ả m o n cá c B á c s ĩ, n h â n v iê n y t ế c ô n g
tá c tạ i K h o a Ư n g b ư ớ u v à c h ă m s ó c g i ả m n h ẹ - B ệ n h v i ệ n Đ ạ i h ọ c Y H à
N ộ i v à B ệ n h v i ệ n K v ề s ự h ợ p tá c v à h ỗ t r ợ m ẫ u n g h i ê n c ứ u .
T ậ p t h ể c á n b ộ t h a m g ia đ ề tà i Q G .1 1 .1 5 x i n tr â n t r ọ n g c ả m ơ n .
Chủ trì đ ề tài

gen MSH2 bằng PCR với những cặp mồi đặc hiệu.
Nội dung 3: Phát hiện các đột biến ở gen nghiên cứu bằng các kỹ thuật sinh học phân tử
- Hoạt động 1: Phân tích PCR-SSCP
- Hoạt động 2: Phân tích PCR-RFLP
- Hoạt động 3: Giải trình tự một số phân đoạn gen MSỈỈ2
Nội clung 4: Phân tích so liệu, viết báo cáo nghiêm thu.
V. Các kết quả đạt đuọc
]. Kết quả khoa học
- Đã thu thập được 50 mẫu bệnh phẩm (máu và mô bệnh phẩm ) từ các bệnh
nhân được chấn đoán mắc ung thư đại trực tràng, dạ dày đến khám, điều trị tại Bệnh
\ iện K, Bệnh viện Đại học Y Hà Nội và 10 mẫu đối chứng.
- Đã tách chiết thành công A D N tổng số từ các mẫu m áu và mô bệnh phẩm thu
thập được
- Đã nhân bản thành công 9 phân đoạn gen MSH2 (exon 2, 3, 6, 7, 8, 12, 13, 14
và 15) băng các cặp mồi đặc hiệu.
- Đã phát hiện được 8 mô hình phân tách băng ADN sai khác ở các mẫu mô ung
thư cửa người bệnh so với người bình thường. Cụ thể là 1 mô hình của người bệnh số
35 (exon 2), 1 mô hình người bệnh sổ 14 (exon 3), 1 mô hình người bệnh số 30 (exon
7), 3 mô hình của người bệnh số 31, 34 và 36 (exon 8) và 2 mô hình của người bệnh số
4 (exon ] 5).
- Phân tích so sánh trình tự ADN của một số mẫu máu và mô ung thư cho thấy
chủng tôi đã phát hiện được 4 đột biến bao gồm: một đột biến mất nucleotide A tại vị
trí 73331 trên exon 3 của mô bệnh phẩm số 1, một đột biến mat nucleotide A tại vị trí
5293 (vùng intron nằm trước exon 2 gen MSH2)\ một đột biến thay thế nucleotide tại
vị trí codon 199 nucleotide G bị thay thế bởi T (c.199 G>T) ở exon 3 dẫn tới thay đổi
axit amin prolin (CCG) thành axil amin glutamin (CAG) trong chuỗi polypeptide do
gen MSH2 tạo ra và một đột biến thay thế O A tại vị trí 77942 (tương ứng codon 848
trên exon 15) thuộc gen MSH2.
2. Kết quả ứng dụng: 1 quy trình phân tích nhằm phát hiện đột biến gen sửa
chữa băt cặp sai có khả năng ứng dạng trong sàng lọc và chẩn đoán ung thư đại trực

33
4
Chi phí nghiệp vụ chuyên môn của từng ngành:
52,8
76,4 129,2
- Vật tư
37
60
97
- In ấn, photo tài liệu
0,6 0,8
1,4
- Chi khác
3,2
3,6 6,8
- Phụ cấp chủ nhiệm đề tài
12,0
12,0 24,0
T ông cộng
80
90 170
KH O A QUẢN LÝ
CHỦ NHIỆM KHOA
PGS.TS.^ỚW í ỉ ữ u a n
CHỦ T R Ì Đ Ề TÀ I
TS. Nguyễn T hị H ồng Vân
TRƯ ỜN G Đ Ạ I H Ọ C KHOA HỌ C T ự N H ĨÊN
• • • •
S U M M A R Y
N am e of project: Mutation analysis o f mismatch repair gene (MMR) associated

II. R esults
1. Scientific results
- C o llected 50 sam ples inclu din g diag nosed colorectal cancer and gatric cancer
patients and 10 controls for analysis.
Genom ic D N A were extracted and purified successfully
Amplified 9 exons o f MSH2 gene with specific primers by PCR (including the exons 2,
3, 6, 7, 8, 12, 13, 14, and 15).
- Analysis of PCR -RF LP showed 01 mutation in exon 3 (sample T l) that changed the
restriction site of Healll.
- Observed 7 abnormal SSCP patterns: one in exon 2, one in exon 3, three exon 8 and two
in exon 15 using PCR-SSCP technique.
Results o fD N A sequence analysis revealed 04 mutations: 01 deletion of nucleotide A
(delA73331) in exon 3 from tumor tissue o f patient numbered 1; 01 deletion of
nucleotide A at position 5293 (in intron before exon 2 of MSH2 gene); 01 substitution
mutation G >T at codon 199 in exon 3; and 01 substitution mutation C>A at position
77942 of exon 15 of MSH2 gene
2. Applied results: 01 procedure for genetic testing o f HN PCC based on detection o f germline
mutations in MSH2 gene
3. Training results: 01 MSc. and 2 BScs
4. Public results: 02 paper on Journal of Science
1) Nguyen Thi H ong Van, Tran Thi Thuy Anh, N guyen Van Doai, Le Van Quang
(2012). M utation screening o f MLH1 and MSH2 genes in colorectal cancer patients. Journal of
Science 2012, Vol. 28, No.2S, p. 209-2015
2) Tran Thi Thuy Anh. Nguyen V an Doai, Le V an Quang, Nguyen Thi Hong Van
(2.012), I Jetection o f mutat ion in HMSH2 gene from Vietnamese sporadic colon cancer patients.
Journal o f Science 2012, Vol. 28, No.2S, p. 62-67.
III. B u d get: One hundred and seventy million dong
M Ụ C L Ụ C
DAN H M Ụ C C H Ữ VIÊT T Á T 1
MỞ DÂU 2

3.2. Ke í quà phân tích đột biến bằng SSCP và giải trình tự

29
KÉT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO 36
PHỤ LỤC 38
0
DAN H M Ụ C C H Ử V IÉ T T Ấ T
T T
T iếng Việt Tiếng Anh
C h ữ
viết tắ t
1
Axit deoxyribonucleic Deoxyribonucleic acid
DNA
2 Kháng nguyên ung thư biểu mô
phôi
Carcino embryonic antigen CEA
3
Ung thư đại trực tràng Colorectal cancer
CMC
4
Sinh polyp 11 tuyên theo dòng họ Familial Adenomatous Polyposis
FAP
5
Ung thư đại trực tràng không
polyp di truyền
Hereditary nonpolyposis colorectal cancer
HNPCC
6

Restrition fragment length polymorphism
RFLP
15
Phản ứng chuỗi polymerase nhò'
Reverse transcriptase - Polymerase chain
RT-
enzyme phiên mã ngược
reaction
PCR
16
Đa hình câu hình sợi đơn
Single strand conformation polymorphism
SSCP
1
đầu thường dựa vào các triệu chứng xuất hiện hoặc nhờ vào quá trình tầm soát. Một số
trường hợp ung thư được chẩn đoán tình cò' nhờ vào quá trình đánh giá các bệnh lý
không liên quan khác.
Hiện nay, mặc dù ung thư đại trực tràng là một trong những dạng ung thư phố biến
nhất và gây tử vong cao ở Việt Nam, song nghiên cứu nguyên nhân gây bệnh ở mức
độ phân tử và áp dụng xét nghiệm di truyền trong chẩn đoán và sàng lọc ung thư này
còn khá hạn chế. Ờ nuủc ta, xét nghiệm di truyền gen liên quan đến ung thư chưa được
áp dụng phổ biến. Cho tới nay, hầu như chưa có nghiên cứu nào đi sâu tìm hiểu các
đột biến ở nhũng gen sửa chữa bẳt cặp sai liên quan tới ung thư đại trực tràng không
polyp di truyền ở người V iệt Nam. Do vậy, việc tìm hiểu sự biến đổi di truyền ỏ’ một
số gen liên quan đến các dạng ung thư khác nhau, trong đó có ung thư đại trực tràng ở
người Việt Nam là một vấn đề có tính cấp bách xuất phát từ thực tế.
Như trên đã nêu, các gen sửa chữa bắt cặp sai được cho là liên kết chặt với hội
chứng IĨN PCC , liên quan đến nhiều loại ung thư thuộc hội chứng HN PCC , trong đó có
ung thư đại trực tràng. Các công trình nghiên cứu đã khẳng định, các đột biến dòng
m ầm ở các gen sửa chữa bắt cặp sai MLH1, MSH2, MSH6 và PMS2 liên kết khá chặt

cứu bệnh này - được mô tả lần đầu vào năm 1913. Đây là hội chứng về khuynh hướng
không chỉ ung thư đại trực tràng mà cả các dạng ung thư ở ít nhất 7 cơ quan khác nhau
(nội mạc tử cung, dạ dày, buồng trứng, ruột non, biếu mô gan mật, biếu mô niệu đạo
và não), trong đó với 80% trường hợp mắc ung thư đại trực tràng (colorectal cancer -
CRC), 50% mắc ung thư nội mạc tử cung và 10% nguy cơ hình thành ung thư dạ dày
và buồng trứng [9]. HNPC C là dạng ung thư đại trực tràng di truyền chiếm khoảng 5%
tông sô trường hợp ung thư đại trực tràng và gần đây mới được xem như một bệnh di
truyên tương đổi phổ biến [17], Đây là bệnh do gen trội trên nhiễm sắc thể thường gây
ra, trong đó các đột biến dòng m ầm làm bất hoạt các gen liên quan đến hệ thống
MMR.
Sự khác biệt giữa HNPCC và ung thư đại trực tràng polyp là ở những tổn thương
phăng cua dạng ung thư này. Các tổn thương phang này là những tổn thương tiền ung
thư ruột, dễ bị bỏ sót lúc thăm khám nội soi, nhưng dễ trở thành ung thư nhất. Trong
lòng ruột có những tổn thương bàng phẳng. thường có kích thước nằm trong giới hạn
nhìn thấy được của mat thường, có cùng màu sắc như phần còn lại của niêm mạc ruột.
N hững tôn thương này được gọi là những tổn thương “không polyp” (nonpolyp). Các
tòn thương này hoặc hơi nhô cao lên hoặc như những hố nhỏ nông, khác hẳn với các
polyp ruột xuât hiện dạne nấm có cuống và dễ nhìn thấy. M ặc dù vậy, các hố phang
4
I.ày lại có nguy cơ biến đối thành ung thư nhanh hơn so với các polyp có cuống [9],
N hững bệnh nhân H N PC C phát triển thành ung thư khi còn trẻ, điển hình ở lứa tuổi
t iCra 40, cá biệt có trường hợp sớm ỏ' tuổi thanh thiếu niên. Tuổi trung bình của người
mắc bệnh ung thư đại trực tràng rải rác là 61 tuổi, trong khi các bệnh nhân H N PC C
đều phát triển ung thư ở độ tuổi trung bình là 42. Những người mang các đột biến
HN PCC dòng m ầm cũng dễ bị ung thư ỏ' các biểu m ô như tử cung, ruột non, buồng
trứng, dạ dày, ống tiết niệu, tụy, ống mật và não. Đối với phụ nữ, 20-60 % bệnh nhân
J INPCC có nguy CO' mắc ung thư nội mạc tử cung. Tuổi trung bình của chẩn đoán ung
thư nội mạc tử cung là 46-62 tuổi. Trong số những phụ nữ có HNPCC phát triển thành
cả ung thư ruột kết và ung thư nội mạc tử cung, khoảng 50% xuất hiện ung thư nội
mạc tử cung trước [10].

nhât một thành viên của dòng họ bị ung thư đại trực tràng được chẩn đoán bị mắc bệnh
ở lứa tuổi trước 50 và 5) sự hình thành polyp tuyến theo dòng họ cần được loại trừ.
Các vị trí ban đâu khác nhau đã được mô tả trong các dòng họ đã được chẩn đoán mac
hội chứng Lynch: nội mạc, dạ dày. ruột non, niệu đạo, vùng chậu, não và ống mật.
Trong sô các khối u ở vị trí này, ung thư nội mạc tử cung, niệu đạo, vùng chậu và ruột
non thê hiện nguy cơ cao nhất, và vì vậy là những dạng đặc thù nhất của hội chứng
Lynch. Sau đó các tiêu chí này được coi là quá hạn chế cho các mục đích lâm sảng và
được sửa đôi đê phù hợp với các bệnh ung thư khác có liên quan đến HNPCC (tiêu
chuân A m sterdam
II). Vào năm 1998, các nhà khoa học đã thiết lập m ột hê thông tiêu
chuân lâm sàng mới, được gọi là tiêu chuẩn Amsterdam II: 1) ít nhất ba người trong
dòng họ mắc ung thư liên kết với I1NPCC (đại trực tràng, nội mạc tử cung, dạ dày,
buóng trứng, niệu đạo hoặc khung chậu - thận, não, ruột non. ống mật, hoặc da (các
khói II tuyến nhờn); 2) Một người trong ba người đó phải có quan hệ một đời với hai
người còn lại. 3) It nhất hai thế hệ liên tiếp bị ảnh hưởng của bệnh này; 4) ít nhất một
trong những người bị ung thư đại trực tràng phải đưọ'c phát hiện trước tuổi 50; 5) Sự
hình thành polyp tuyến theo dòng họ phải được loại trừ ở bất kỳ người nào bị ung thư
đại trực tràng: 6) Các khối u cần được kiểm tra bất kỳ lúc nào [5],
Do vậy, việc chẩn đoán của HNPCC có thể được thực hiện trên cơ sở các tiêu
chuân lâm sàng Am sterdam hoặc bằng cách kiểm tra di truyền phân tử của các đột
b iến dòng mầm trong các gen MMR.
2. Tông quan về gen sửa chừa bắt cặp sai
Trong số các gen liên quan tới ung thư, phải kể đến các gen sửa chữa bắt cặp sai
(VIMR genes). Đây là những gen chịu trách nhiệm cho việc sửa chữa những sai sót
xảy ra trong sao chép DNA. Trong quá trình sao chép DNA, các bazơ bắt cặp sai sẽ
được sưa chữa nhò' hoạt tính đọc sửa của enzyme DNA polymerase. Bên cạnh hoạt
tinh dọc sửa của DNA polymerase, tế bào còn có hệ thống sửa chữa bắt cặp sai. Chức
năng cơ bản của hệ thống sửa chữa DNA là loại bỏ sự bắt cặp sai thêm hoặc mat base
do hậu quả của các lỗi DNA polymerase trong quá trình tống hợp DNA. Hệ thống
M M R này hoạt động được nhờ sự phối họp của rất nhiều protein. Các protein M M R

phân tử của khối u m ang đột biến các gen MMR. Thông thường, sản phẩm protein của
các gen M M R này giúp tế bào sửa chữa những sai sót trong sao chép D NA do sự trượt
qua, bỏ quãng của DN A polym erase hoặc các trình tự dễ bị gãy như các vi vệ tinh.
Những sai hỏng ở các enzyme sửa chữa DNA liên kết với những đột biến mất hoặc
xen ở các vi vệ tinh, dẫn tới những độ dài khác nhau của các trình tự này. Những bệnh
nhân bị hội chứng Lynch cho thấy có sự có mặt của hàng loạt nhũng đoạn lặp các đơn
vị vi vệ tinh 112], Do vậy mức độ MSI có thể được xem như là sự biểu thị của bất ổn
hệ gen chung và là chỉ thị tuyệt vời đánh giá sự thiếu hụt chức năng M M R, giúp chẩn
đoán ung thư đại trực tràng.
base băt cặp sai
Hình 1. Cơ chê sửa chữa bắt cặp sai ờ E .co li
(Nguồn: http://m m r.m ed.ohio-state.edu/rfishel/RF2.htmn
♦ Các gen sủa chữa bắt cặp sai trong ang thư đại trực tràng nhóm HNPCC
Việc sửa chừa D N A bẳt cặp sai đóng vai trò quan trọng do nó duy trì tính on định
nguyên vẹn của hệ gen, bởi vậy, nó cũng liên kết với sự hình thành những đột biến liên
quan đến ung thư, trong đó có HNPCC. Đã có nhiều nghiên cứu công bố rằng những
sai hỏng trong sửa chữa bắt cặp sai dẫn đến hàng loạt các trường hợp ung thư di truyền
hoặc không di truyền. Các dạng đột biến chủ yếu đưọ’c phát hiện là đột biến nhầm
7
nghĩa (missense), đột biến vô nghĩa (nonsense), đột biến dịch khung (frameshift) và
các đội biến ở những vị trí cắt nối exon-intron. N hững đột biến này có thể dễ dàng
phát hiện được bằng giải trình tự tự động hoặc MSI có thể được chẩn đoán ở các khôi
II bằng phương pháp dựa vào PCR dựa vào DNA hệ gen đã được tách chiết [1,9, 12].
A
( lì h it micleotit
T's
5' G A A A A A A A A c A c A c A 0 A c A
3 ’ I I ĩ ì r i 1 I í G í G 1 G í G T n T
V
c )

-
*
<
5
6
7 8 I
9
10
llị 12 13
14
-
16
i m \ hzt'dtnz íimit ì:i
hMSHLT
imrrartio
h-MS
n iln
H6
main
MutL homo logs
interaction
___
iiiunajji
__
Hình 4 . Sơ đô protein được mã hóa bởi MSH2
Các hộp màu đỏ, vàng và xanh đại diện cho các vùng chức năng khác nhau của protein MSH2.
(nguồn: i
Khoảng 40% các trường hợp bị hội chứng Lynch với một đột biến được xác
định có liên quan đến đột biến gen MSH2. Các dạng đột biến chủ yếu gồm thay thế
nucleotide (50 - 80%), mất hoặc sắp xếp lại trình tự các nucleotide (17 - 50%) (Hình 5).

68 211 r* 147 150 134 200 no 124 151 <* u* 205 H8 rí Pl m
*99K 3MI ro* 18" 1331: 17373 jWJJ *1» .Wế: 109« roo 2176 1907
Hình 3 . Sơ dô gen MSH2Ờ người
Hộp màu xanh biếu thị các exon, khoảng trống biểu thị các intron.
(nguồn: )
Đây là gen quy định tổng hợp một loại protein đóng vai trò quan trọng trong
quá trình sửa chữa DNA. cấu trúc gen gồm 3 domain mã hóa cho 3 phần protein với
chức năng các phần khác nhau. Khi DNA sao chép để chuẩn bị cho tế bào phân chia,
domain bám DNA (từ exon 1 đến exon 6) của gen MSH2 sẽ quy định tổng hợp một
phần protein có chức năng bám vào vị trí bắt cặp nhầm của các đơn nucleotide. Riêng
domain tương tác với gen MSH3/MSH6 (từ exon 7 đến exon 12) mã hóa phần protein
có vai trò kết họp với một trong hai loại protein do gen MSH3 và MSH6 để tạo nên
một phức hợp protein hoạt động là mutSa (MSH2 - MSH6) hoặc m utsp (MSH2 -
bao gồm u tuyến bã nhờn vả ung thư da. Nguyên nhân là do tại các tuyến da (tuyến bã
nhờn) sản xuất một chất nhờn gợi là sebum. Chính dạng chất nhờn này đã gây nên các
khối II trên da. Các khối u này có thể phát triển nhanh chóng gây ra hiện tượng gai
bướu sừng khi tiếp xúc trực tiếp với ánh nắng mặt tròi.
Bên cạnh MLH1 và MSH2, MSH6 cũng đóng vai trò quan trọng trong chức
nàng MMR. Tuy nhiên, số lượng đột biến MSH6 được phát hiện ở hội chứng HNPCC
là tương đối thấp và chưa được nghiên cứu thấu đáo. Hiện nay, đột biến ỏ' gen MSH6
đã (tược phát hiện ỏ' m ột sổ trường hợp hội chứng Lynch không điển hình và chiếm
10% trong số các dạng đột biến gen ở những người mắc hội chứng Lynch. Các đột
biến dòng mầm ở gen này cũng được báo cáo ở nhũng dòng họ có nhiều thành viên bị
ung thư nội mạc tử cung [3, 7, 15]. Ngoài ba gen kể trên, còn có hai gen PMS1
(M IM //600258) và PMS2 (M IM #600259) tương ứng nằm trên nhiễm sắc thể 2q31-q33
và 7p22, với kích thước tương ứng 16 Kb và 15 exon. Theo dữ liệu đã công bố, chủng
chiếm 5% trong các trường họp hội chứng Lynch. Mặc dù gen PMS2 cốt yếu trong hệ
thống sửa chữa, những đột biến ở gen này lại hiếm được công bố trong bệnh sinh hội
chứng Lynch, hoặc ở hội chứng Turcot (một biến thể của hội chứng Lynch). Iíiện nay
vần có những tranh cãi liên quan tới cơ chế bằng cách đó PM SỈvà PMS2 có thể hoạt

của enzyme giói hạn có thể làm mất hoặc xuất hiện vị trí nhận biết của enzyme giới
hạn. Khi đó, việc xử lý nó với cùng enzyme giới hạn sẽ tạo nên các phân đoạn D N A bị
cát độ dài là khác nhau và thể hiện sự đa hình trên bản điện di. Do vậy, đây là chỉ thị
cho biết sự có mặt của đột biến ở cá thể, cũng như các đa hình do những đột biến tự
nliiôn gây ra tạo ra đặc điểm riêng biệt ở mọi giống, loài thậm chí mỗi cá thể. Đây là
một phương pháp hiệu qua cho việc phát hiện những sai khác do đột biến gen, bởi
phân đoạn DNA có kích thước gần như nhau không thể phân biệt được trên điện di đồ,
nhưng nếu chúng được cắt bàng các enzyme giới hạn thành các phân đoạn có nhỏ hơn
có kích thước khác nhau thì có thể phân biệt được trên điện di đồ. PCR-RFLP là kỹ
thuật được áp dụng phối hợp bằng việc thực hiện phản ứng PCR để nhân bản đoạn
DNA quan tâm, sau đó xử lý sản phẩm P CR với các enzyme giới hạn và điện di trên
gel (thường là polyacrylam ide) để phát hiện các mô hình sai khác.
• PCR-SSCP (Polymerase chain rection-single strand conformational polymorphism)
SSCP phát hiện những sai khác dựa trên khả năng di chuyển khác nhau của các
đoạn DNA sợi đơn có cùng kích thước nhưng trình lự khác nhau. Chuyển động của
DN A trong gel điện di phụ thuộc vào kích thước và cấu hỉnh không gian của chúng.
Một sự thay đổi nucleotide nhỏ (thêm, mất, thay thế nucleotide) của một trong hai sợi
dơn của DNA sơi kép rất khó có thể phân biệt trên gel điện di, bởi vì các tính chất vật
lý cùa các sợi cặp đôi ià gần như giống nhau nên chuyển động của DN A sợi kép trong
gel điện di gần như không thay đổi. Tuy nhiên các chuyển động của sợi đơn lại bị ảnh
hưởng bởi những thay đổi dù là rất nhỏ trong trình tự (có thể là thay đổi 1 nucleotide
trong số vài trăm nucleotide).
PCR-SSCP (đa hình cấu hình sợi đo'n dựa PCR) là một kỹ thuật đơn giản và hiệu
quả cho việc xác định những thay đổi trình tự ỏ' đoạn D N A được khuếch đại bang
PCR. Đây là kỳ thuật ban đầu được Orita et al. (1989) [14] đưa ra và được coi như là
một phương pháp nhanh và nhạy để phát hiện các đột biến hoặc sự đa hình của phân tử
DNA. Sau khi biến tính DNA sợi kép, do tính chất tương đối không ổn định của DN A
sợi đon khi vắng mặt của một sợi bổ sung, các trình tự DNA trên sợi đơn có thể gặp
12
các trình tự bố sung nằm ngay trên sợi DNA đó. kết quả quả là chúng bắt cặp với

trường hợp hội chứng Lynch theo tiêu chí truyền thống liên quan đến đột biên dòng
m ầm có thể phát hiện được ở gen M MR. Vì vậy, nếu một người dược xác định mang
hội chứng Lynch và m ang đột biến dòng mầm M M R phát hiện được, chỉ 2,5% trong
tât cả các CRC được tí nil là gây nên hội chứng Lynch [7].
13
ư n g thư dại trực tràng, trong đó có HNPCC là dạng ung thư có tỷ lệ mắc phải
cao ở các nước phát triển và ngày một tăng ỏ' các nước đang phát triển. Các nghiên cứu
vô gen sửa chữa bắt cặp sai liên kết ung thư đại trực tràng di truyền đã được thực hiện
ở khá nhiều nước trên thế giới. D ữ liệu về đột biến các gen M M R góp phần đưa ra các
quy trình chẩn đoán và sàng lọc dạng ung thư này. Hiện nay, có tới hơn 250 đột biên
dòng mầm khác nhau đã dược xác định, trong đó phần lớn các đột biến này được phát
hiện ỏ' gen MLH1 và MSH2 và được khẳng định có liên kết vói HNPCC. Đáng chú ý là
chỉ có một ít hoặc không có sự khác biệt về độ biểu hiện đã được phát hiện giữa các
đột biến MLHÌ và MSH2, cho thấy rằng cả hai gen này quan trọng như nhau đối với
chức năng MM R.
Felipe et al. đã đánh giá 25 gia đình người Brazil có hội chứng Lynch. Người ta
thấy rằng 10 gia đình (40%) trong số đó có những đột biến ở các gen MLH1 và MSH2:
8 gia đình có đột biến ở MLH1 (80% ) và hai gia đình có đột biến ở MSH2 (20%).
Trong đó có 5 đột biến nhầm nghĩa, một đột biến vô nghĩa, ba đột biến dịch khung và
một sai hỏng ỏ' vi trí cắt nối [5]. L ynch et al [9] đã xác định các đột biến tại những gen
này ỏ' 18 trong số 56 các thể (32,1%). Gần dây, nghiên cứu của Hendriks et al. đã xác
địnlì ctược 7 đột biến ở gen PMS2, bao gồm bốn đột biến sắp xếp lại hệ gen và ba đột
biến điếm. Trong số 7 cá thể có đột biến này, sáu cá thể thể hiện mô hình di truyền trội
trên nhiễm sắc thề thường [7], Theo Pistorius el củ [15], sự sắp xếp lại hệ gen có mặt ỏ'
một tỷ lệ đáng kế trong toàn bộ những đột hiến có khả năng gây bệnh ở các gen M M R
trong các bệnh nhân mắc hội chứng Lynch. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng, sự
sấp xếp lại hệ gen có mặt ỏ' 15 - 55% trong tất cả các đột biến ở các gen MMR.
Pistorius et cú đã tìm thấy 14 đột biến tái sắp xếp hệ gen trong 85 người (16,5%) trong
đó có 4 người mang đột biến ỏ' gen MLH1 và 10 người còn lại ỏ' gen MSH2. Timm
Goecker et al đã phân tích mối liên quan giữa kiểu gen đột biến ở các gen sửa chữa băt

trùng thâp (30% cho tới tuổi 71), nhưng lại có nguy cơ hình thành ung thư nội mạc tử
cung (71% cho tới tuổi 71) [15, 16]. M ột số nghiên cứu khác đã chứng minh rằng
những người m ang dột biến ờ MSH2 có nguy CO' cao hơn hình thành ung thư ỏ’ ống tiết
niệu, dạ dày và buồng trứng, so với những người mang đột biến ở MLH1.
Mặc dù nhiều nghiên cứu về những bất thường di truyền ở vùng mã hóa của các
gen M M R trong các trường hợp hội chứng Lynch, những bất thường di truyền ở
promoter trong các gen này lại rất ít được nghiên cứu. N hững nghiên cứu gần đây đang
xác định và mô tả những đột biến dòng mầm ở vùng trung tâm các promoter của
những gen này. Shin et cil [20] đã đánh giá 141 bệnh nhân Hàn Quốc mắc hội chứng
Lynch và và đã tìm thấy ba đột biến ở vùng promoter của gen MSH2. Những đột biến
này ở các cá thể không có các đột biến dòng mầm. Những đột biến này ở promoter làm
giảm đáng kế hoạt tính của chúng, do đó ảnh hưởng đến vị trí mở đầu phiên mã và vị
trí bám của nhân tố phiên mã, tạo nên phức hợp DNA-protein mới. Những kết quả này
chỉ ra rằng, những đột biến ở promoter MSH2 chịu trách nhiệm cho quá trình mở đầu
hình thành khôi u ở một số nhỏ các trường hợp hội chứng Lynch.
I liện nay, mặc dù ung thư đại trực tràng là một trong những dạng ung thư phổ
biến nhất và gây tử vong cao ở Việt Nam, song nghiên cứu nguyên nhân gây bệnh ỏ'
m ức độ phân tử và áp dụng xét nghiệm di truyền trong chẩn đoán và sàng lọc ung thư
này còn khá hạn chê. Trong những năm gần đây, đã có một số công trinh nghiên cứu
cua các tác giả trong nước về hướng nghiên cứu một số gen liên quan đến ung thư.
Chẳng hạn, N guyễn Thị Vinh Hà và cộng sự (2006) đã nghiên cứu kiểu sen của vi rút
15
v.êin gan B trên bệnh nhân ung thư gan bằng kỹ thuật sinh học phân tử; môi liên quan
gììữa sự hiến đôi gen đặc trưng vói một số đặc điềm lâm sàng và huyết học ở bệnh
nhân lơ xê mi cấp dòng tuỷ cũng đã được nghiên cứu bởi nhóm các tác giả Phạm
Qaiang V inh và cộng sự (2008). Đối với bệnh ung thư đại trực tràng, gần đây vào năm
2009, Lê Trần Ngoan đã công bố kết quả nghiên cứu tứ vong do ung thư đại - trực
tràng ỏ' 8 vùng sinh thái nước ta trong 2 năm 2005-2006. Cho tới nay, hầu như chưa có
nghiên cứu nào đi sâu tìm hiểu các đột biến ỏ' những gen sửa chữa bắt cặp sai liên quan
tòi ung thư đại trực tràng không polyp di truyền ỏ' người Việt Nam. Trên thực tế, mới

Trọng điểm công nghệ Enzyme và Protein - Trường Đại học Khoa học T ự nhiên, Đại
học Quốc gia Hà Nội.
Hóa chất và thiết bị
Kit tách chiết DNA tổng số được cung cấp bởi hãng R&D (Hàn Quốc). Các hóa
chất và dụng cụ dùng trong các thí nghiệm đều được cung cấp bởi các hãng có uy tín
trên thê giói như Fermentas, Promega, Sigma, Invitrogen, Bioneer, Corning
Thiết bị dùng cho nghiên cứu bao gồm: Các hệ thống điện di đứng và ngang của
BioRad (M ỹ), bể ổn nhiệt, máy ly tâm lạnh Kyratec và máy ly tâm nhiệt độ thường
(Eppendorf), máy PCR (Perkin Helmer), tủ lạnh -80°c, tủ lạnh thường, cân phân tích
2. Phương pháp nghiên cứu
2.1. Thu thập và bảo quản mâu
Mau m áu được thu thập trong các ống chuyên dụng, được chống đông bằng EDTA,
đảm bảo không bị nhiễm các chất khác, không bị lẫn các mẫu với nhau.
Các mẫu mô được thu và bảo quản ngay ở nhiệt độ -20°c.
Cả mẫu máu và mô được bảo quản trong điều kiện -20°c cho đến khi được sử dụng
để tách chiết và phân tích DNA.
Các m ẫu được lưu giữ với lý lịch mẫu rõ ràng, được dán nhãn theo nguyên tắc:
Mầu máu: B + số thứ tự mẫu, chẳng hạn: Bl, B2 ; Mau mô: T + số thứ tự mẫu,
chẳng hạn: T l, T2
2.2. Tách DNA tổng số
DNA tông số từ mẫu mô được tách chiết theo quy trình hướng dẫn đi kèm bộ kit
tách DNA tổng số R & D (Hàn Quốc).
Với các m ẫu máu, DN A tổng số được tách theo quy trình của của Sambrook và
cộng sự (2001) [19],
I

-
ĐẠI HỌC QUQC GIA HÀ NÔI j
TRUNG ĨÂM THÔNG TIN ỈHƯ VIEN ■
17

345
Ngược
G TG TCT C A A A CCA T TC TACT A TCA
3
Xuôi
C TT A G G CTTCT CCT G G CAATC TC TC
281
Ngược
TC TCA G T TTC C C C A TG TCT CCAGCA
6
Xuôi
T G TT C CTCT GTTTTTC AT GGCG
279
Ngược
TG GT AT AATCATGTGG GTAACTGC
7
Xuôi
G TT G A G A CTTAC G TG C TT AG TTGAT
351
Ngược
TG A G G A C A G C A C A TTG C C A A G
8
Xuôi
GT A A C T T T G G AG ACCT GC T GT A CT
365
Ngược CATC CA CTG T C C A C A A A G G T G C T
18