TRẦN QUỐC DUNG (Chủ biên)
NGUYỄN HOÀNG LỘC-TRẦN THỊ LỆ
CÔNG NGHỆ CHUYỂN GEN
(ÐỘNG VẬT, THỰC VẬT)

Huế, 2006


thức ăn cao, cho năng suất cao và chất lượng sản phẩm tốt. Ðộng vật
chuyển gen còn được sử dụng làm mô hình thí nghiệm nghiên cứu
các bệnh ở người để nhanh chóng tìm ra các giải pháp chẩn đoán và
điều trị các bệnh hiểm nghèo như ung thư, AIDS, thần kinh, tim
mạch

2
Những bước phát triển của công nghệ chuyển gen vào thực vật
bắt nguồn từ những thành công của công nghệ chuyển gen vào động
vật. Kể từ năm 1984, là lúc người ta bắt đầu tạo được cây trồng
chuyển gen và đến nay đã có những bước tiến lớn. Nhiều cây trồng
quan trọng chuyển gen ra đời như lúa, ngô, lúa mì, đậu tương, bông,
khoai tây, cà chua, cải dầu, đậu Hà Lan, bắp cải Các gen được
chuyển là gen kháng vi sinh vật, virus gây bệnh, kháng côn trùng
phá hại, gen cải tiến protein hạt, gen có khả năng sản xuất những
loại protein mới, gen chịu hạn, gen bất thụ đực, gen kháng thuốc diệt
cỏ
Triển vọng của công nghệ chuyển gen là rất lớn, cho phép tạo
ra các giống vật nuôi, cây trồng mang những đặc tính di truyền
hoàn toàn mới, có lợi cho con người mà trong chọn giống thông
thường phải trông chờ vào đột biến tự nhiên, không thể luôn luôn có
được. Ðối với sự phát triển của công nghệ sinh học trong thế kỷ XXI
thì công nghệ chuyển gen sẽ có một vị trí đặc biệt quan trọng. Có thể
nói công nghệ chuyển gen là một hướng công nghệ cao của công
nghệ sinh học hiện đại phục vụ sản xuất và đời sống.

I. Một số khái niệm cơ bản
1. Chuyển gen
Chuyển gen (transgenesis) là đưa một đoạn DNA ngoại lai
vào genome của một cơ thể đa bào, sau đó đoạn DNA ngoại lai này

tại trong cơ thể mà không hợp nhất vào trong genome của nó. Một
đoạn DNA tự do nhanh chóng bị loại trừ trong chu trình tế bào vì
vậy nó sẽ không có khả năng tái bản và truyền lại cho các tế bào con.
Tuy nhiên về lý thuyết thì có thể duy trì một đoạn DNA ngoại lai
như một nhiễm sắc thể nhỏ (minichromosome) có khả năng tự tái
bản và có mặt trong các tế bào con. Một số genome virus có đặc tính
này, ví dụ như virus herpes. Một vài đoạn nhiễm sắc thể thường
được tìm thấy ở các tế bào khối u, là các nhiễm sắc thể tồn tại trong
một thời gian ngắn, mang các yếu tố tái bản và truyền cho các tế bào
con.

2. Ðộng vật (Thực vật) chuyển gen
Ðộng vật (Thực vật) chuyển gen là động vật (thực vật) có gen
ngoại lai (gen chuyển) xen vào trong DNA genome của nó.
Gen ngoại lai này phải được truyền lại cho tất cả mọi tế bào,
kể cả các tế bào sinh sản mầm. Nếu dòng tế bào mầm bị biến đổi,
các tính trạng bị biến đổi này sẽ được truyền cho các thế hệ kế tiếp
thông qua quá trình sinh sản bình thường. Nếu chỉ có dòng tế bào
sinh dưỡng bị biến đổi, chỉ có cơ thể mang các tế bào sinh dưỡng đó
bị ảnh hưởng và không di truyền lại cho thế hệ sau. Việc chuyển gen
ngoại lai vào động vật (thực vật) chỉ thành công khi các gen này di
truyền lại cho thế hệ sau.

4
Cho đến nay, trên thế giới người ta đã thành công trong việc
tạo ra nhiều thực vật, động vật chuyển gen. Ở động vật, không chỉ
đối với động vật mô hình (chuột), vật nuôi (bò, lợn, dê, cừu, thỏ, gà,
cá ) mà cả những loài động vật khác như khỉ, muỗi và một số côn
trùng


hoàn toàn là khó hơn nhưng có thể thực hiện để đưa một marker

5
hoặc một gen chọn lọc vào genome. Vị trí hợp nhất vào genome có
thể được chọn lọc đối với khả năng chứa của nó để biểu hiện gen
ngoại lai bằng một cách chắc chắn.

III. Nguyên tắc cơ bản trong việc tạo động (thực vật)
chuyển gen
Nguyên tắc cơ bản trong việc tạo động vật (thực vật) chuyển
gen là đưa một hoặc vài gen ngoại lai vào động vật (thực vật) (do
con người chủ động tạo ra). Các gen ngoại lai này phải được truyền
thông qua dòng mầm vì vậy mọi tế bào kể các tế bào mầm sinh sản
của động vật (thực vật) đều chứa vật chất di truyền đã được sửa đổi
như nhau.

IV. Cơ chế hợp nhất của DNA ngoại lai vào genome
Trong tất cả các trường hợp, sự hợp nhất của đoạn DNA
ngoại lai vào genome được thực hiện với sự tham gia của các cơ chế
sửa sai DNA của tế bào. Các protein liên quan với các cơ chế này
nhận ra các cấu trúc DNA không bình thường, có thể là sự ghép đôi
không tương ứng của hai sợi đơn DNA, các vùng sợi đơn hoặc các
vị trí mà DNA ngoại lai liên kết với DNA chủ.
Khi DNA ngoại lai không có trình tự chung với genome chủ,
sự nhận biết giữa hai DNA chỉ bao gồm các trình tự DNA ngắn
tương đồng ít hoặc nhiều. Sự nhận biết này là cần thiết cho các cơ
chế sửa sai hoạt động. Sau đó DNA ngoại lai hợp nhất vào genome
nhờ quá trình tái tổ hợp không tương đồng (Hình 1). Sự kiện này là
khá hiếm và xảy ra ở các vị trí khác nhau trong genome.
Khi DNA ngoại lai đóng góp một trình tự dài tương đồng với

một đoạn trùng lặp mà ở đó các gen được xây dựng lại rất tốt. Sau
đó các bản sao khác nhau của các đoạn DNA ngoại lai được cấu tạo
chủ yếu ở dạng nối tiếp.
Khi các đoạn DNA khác nhau được xâm nhập đồng thời vào
một tế bào, chúng tạo thành các đoạn trùng lặp chứa một vài bản sao
của mỗi đoạn. Các đoạn trùng lặp lai (hybrid concatemers) này được
hợp nhất vào genome. Vì thế đến bốn gen khác nhau có thể được
chuyển đồng thời vào một tế bào.
Nói chung, DNA ngoại lai được hợp nhất dưới dạng đoạn
trùng lặp có kích thước khoảng 100kb, thường chứa từ một đến
mười bản sao của đoạn DNA gốc. Ðiều thú vị là khi các đoạn DNA
lớn được chuyển vào, đoạn trùng lặp hợp nhất vào thường chứa số
bản sao ít hơn mặc dù kích thước tối ưu để hợp nhất vào genome là
vào khoảng 100kb. 7 Hình 1: Các cơ chế hợp nhất ở một vị trí ngẫu nhiên của DNA ngoại
lai tiêm vào nhân của tế bào
DNA tiêm vào được cắt ra một cách ngẫu nhiên. Các đoạn DNA này lệ
thuộc vào quá trình tái tổ hợp tương đồng tạo ra các polymer (các đoạn
trùng lặp) của gen tiêm vào xếp nối tiếp nhau. Các đầu của đoạn trùng lặp
bị phân hủy bởi DNAse, tạo ra các vùng sợi đơn ngắn nhận biết các vị trí
bổ sung trong genome. Trong quá trình tái bản DNA, các cơ chế sửa sai
hợp nhất DNA ngoại lai.

8


- Gen ngoại lai có mặt trong tế bào cơ thể bao gồm cả tế bào
mầm sinh sản có thể truyền lại cho thế hệ sau.
10

- Vector phải chứa các trình tự kiểm soát (control sequences)
như khởi điểm tái bản (origin of replication), promoter.

11
- Vector phải mang một hoặc nhiều vị trí nhận biết của enzym
hạn chế.
- Vector phải mang các gen marker chọn lọc (thường là các gen
kháng chất kháng sinh). Vì vậy các tế bào chứa chúng có thể được
phát hiện một cách dễ dàng.

III. Các bước trong tạo dòng phân tử
- Nối vector và đoạn DNA ngoại lai cần được tạo dòng trong
ống nghiệm để tạo DNA tái tổ hợp nhờ sự xúc tác của enzym ligase.
- Biến nạp DNA tái tổ hợp vào một dòng tế bào chủ. Chọn lọc
thể biến nạp trên môi trường agar trong đĩa petri có chất kháng sinh.
- Tách dòng DNA tái tổ hợp bằng cách sử dụng mẫu dò
(probe).

IV. Các vector sử dụng để chuyển gen ở động vật và thực
vật
1. Các vector sử dụng để chuyển gen ở động vật
1.1. Vector sử dụng để thêm gen
Phần lớn các vector sử dụng hiện nay để tạo động vật chuyển
gen bằng cách thêm gen được xây dựng để được hợp nhất vào
genome. Các phương pháp đang được sử dụng hoặc nghiên cứu để
tăng tần số hợp nhất của gen ngoại lai hoặc duy trì chúng như là các
nhiễm sắc thể nhỏ độc lập.

1.1.1. Vector thẳng tối thiểu (Minimum linear vectors)
Ở đại đa số trường hợp, các nhà nghiên cứu sử dụng các đoạn

Cơ chế của sự hợp nhất được mô tả ở hình 1 bao hàm sự nhận
biết giữa các trình tự của đoạn xen và của genome. Tần số của sự
hợp nhất được tăng lên nhờ sự có mặt ở cả hai đầu của các đoạn xen
các trình tự lặp lại cao trong genome chủ ngay cả khi chúng bị thoái
hóa nhiều hoặc ít. Ở bò, một trình tự có mặt nhiều ở tâm động làm
tăng thêm các đoạn xen đã tăng tần số hợp nhất. Ở trường hợp đặc
biệt này, các gen chuyển vẫn không hoạt động. Ðiều này là do tâm
động là vùng không phiên mã của genome phá hủy gen chuyển.
Một phương pháp tương tự đã được tiến hành ở chuột, sử
dụng các trình tự Alu. Các trình tự này là các yếu tố lặp lại. Các trình
tự Alu chứa 200-300 nucleotid là có nhiều trong genome động vật có
vú và đặc biệt là ở các vùng lân cận hoặc ở trong các vùng phiên mã.
Một số trình tự Alu được phiên mã bởi RNA polymerase III, làm
cho chức năng của RNA không rõ ràng và có thể không tồn tại. Các
thí nghiệm đã cho thấy rằng tần số hợp nhất được tăng lên đối với
các đoạn xen chứa trình tự Alu.

1.1.3. Vector transposon
Transposon là một đoạn DNA có khả năng tự tái bản một
cách độc lập và xen vào một vị trí mới trong cùng nhiễm sắc thể
hoặc một nhiễm sắc thể khác (Hình 1.2). Với tiến bộ của kỹ thuật di
truyền transposonđã được sửa đổi, thiết kế thành các công cụ di
truyền với mục đích đặc biệt.

14 Hình 1.2: Cấu trúc của transposon

Kích thước của transposon nói chung là không dài hơn 2kb.

Các vector khác được sử dụng để tạo côn trùng chuyển gen
như Aedes aegypti hoặc tằm (Tamura, 1999). Gần đây transposon đã
được sử dụng để tạo chuột chuyển gen (Dupuy, 2002).

Hình 1.3: Sử dụng vector transposon để chuyển DNA ngoại lai
Gen transposase được thay thế bằng gen mong muốn. Transposon tái tổ
hợp được tiêm vào tế bào. Vector điều khiển sự tổng hợp enzyme gắn
(intergrase) được cùng tiêm vào. Transposon được hợp nhất bằng cách sử
dụng các trình tự lặp lại đảo ngược ITR của chúng

Trong tất cả các trường hợp, transposon và plasmid mã hóa
cho transposase phải được tiêm vào tế bào chất của phôi dưới các
điều kiện khác nhau tùy thuộc từng loài. Về phương diện này, gà là
khác với hầu hết các loài khác. Việc tiêm gen có thể được thực hiện
ở giai đoạn phôi một tế bào mà không thể đưa trở lại vào con mẹ
nuôi dưỡng như trường hợp đối với thú. Phôi đã tiêm gen phải được
đưa vào noãn hoàng của một trứng không mang phôi. Sau vài tuần

16
ấp trứng dưới các điều kiện được kiểm soát tốt, gà chuyển gen được
sinh ra với một tỉ lệ thành công có thể chấp nhận (Shermann, 1998).
Vì vậy, vector transposon cho phép tạo ra các động vật
chuyển gen đối với các loài mà vi tiêm DNA thông thường không
thành công. Vector này cũng được xem là an toàn. Vector
transposon thủy thủ ngay cả khi thiếu gen transposae của nó cũng có
thể tái bản và hợp nhất vào genome chủ với tần số thấp. Ðiều này là
do sự có mặt của transposase nội sinh của tế bào chủ. Vấn đề này có

phức hợp liposome-DNA nói chung là gây ra hiệu quả chuyển gen
cao hơn bởi vì nó làm cho phức hợp này kết hợp với màng tế bào
tích điện âm bền vững hơn. Nhờ cơ chế nhập bào, các phức hợp
liposome-DNA có mặt trong endosome và sau đó đi vào nhân. Chưa
rõ DNA được phóng thích từ endosome đi qua màng nhân như thế
nào. DOPE được xem là một lipid kích thích sự dung hợp và vai trò
cuả nó là phóng thích các phức hợp này từ endosome cũng như làm
cho sự dung hợp của màng tế bào phía ngoài với phức hợp
liposome-DNA xảy ra dễ dàng. Trong phương pháp này, các đại
phân tử trước hết được đưa vào trong các túi phosphlipid. Các loại
túi khác nhau đã được mô tả, nhưng túi một lớp mỏng là thích hợp
nhất cho chuyển gen bởi vì chúng có tỉ lệ khoảng trống chứa nước ở
bên trong tương đối cao đối với mỗi đơn vị lipid và tỉ lệ phân phối
cao hơn. Sự dung hợp của liposome với màng plasma là một sự kiện
hiếm.

Hình 1.5: Cấu trúc tổng quát của lipid cation tổng hợp Hình 1.6: Cấu trúc của DOEP

18
Hình 1.7: Phức hợp liposome-DNA

Sau khi Bangham AD mô tả liposome lần đầu tiên vào giữa
thập niên 1960, việc sử dụng liposome làm phương tiện để đưa thuốc
đến các mô đặc trưng đã nhận được sự quan tâm đáng kể.

dung hợp; liposome nhạy cảm với pH (pH-sensitive liposome),có
khả năng tránh được sự phân hủy của lysosome; liposome cation
(cationic liposome), tạo ra các phức hợp với DNA; liposome nhạy
cảm với tế bào đích (target sensitive liposome), không hợp nhất sau
khi bám vào tế bào đích và giải phóng vật chất chứa bên trong vào
vùng lân cận tế bào này; liposome miễn dịch (immunoliposome),
điều khiển các vị trí đặc hiệu bởi các kháng thể ghép đôi (coupling
antibody) tới các bề mặt của chúng.

Thiết kế các liposome
Nhờ tính linh hoạt về cấu trúc liên quan đến kích thước, thành
phần, lớp màng kép, trạng thái lỏng và khả năng kết hợp thành một
của nhiều hợp chất, liposome đã được sử dụng một cách rộng rãi như
một phương tiện dẫn thuốc trong điều trị nhiều bệnh liên quan đến tế
bào (trừ MPS), vận chuyển DNA, enzyme, vaccine

Liposome lưu thông lâu dài (Long-circulating liposome)
Như đã đề cập ở trên, C liposome bị hấp thụ nhanh chóng bởi
MPS đã hạn chế khả năng sử dụng đối với các loại tế bào khác. Các
liposome nhỏ, cứng, giàu cholesterol làm tăng tính bền vững trong
plasma, tránh được sự hấp thụ của MPS đã được cấu trúc. Các
phương pháp khác nhằm làm tăng thời gian lưu thông của liposome
trong máu là kết hợp vào liposome các polyvinyl pyrolidone
polyacrylamide lipid, glucoronic acid lipid hoặc phospholipid
distearoyl phosphatidylcholine. Bao bọc liposome với protein,
polysaccharide và glycolipid của hồng cầu cũng làm tăng thời gian
lưu thông trong máu của chúng. Liposome được bao bọc với
ganglioside GM
1
và hydrogenated phosphatidyl inositol (HPI) làm

thể hoặc các phối tử khác nhau như folate, transferrin, anionized
albumin, dextran bám vào các thụ quan làm tăng khả năng điều hòa
trên bề mặt của tế bào đích. Chúng có thể được gắn lên bề mặt của
liposome bằng cách sử dụng các gai dạng neo hoặc đầu mút PEG,
xen vào lớp màng kép của liposome nhờ một chất dẫn xuất của
phospholipid (Hình 1.8).

A B C
Hình 1.8: Các loại liposome miễn dịch
A: kháng thể được gắn với gai dạng neo, rồi xen vào lớp màng kép của
C liposome; B: kháng thể được gắn với gai dạng neo, rồi xen vào lớp
màng kép của liposome có cấu trúc không gian bền vững; C: kháng thể
gắn với đầu mút của PEG được ghép với bề mặt của liposome

21

Liposome miễn dịch là liposome mang trên bề mặt các kháng
thể cặp đôi đồng hóa trị, đảm bảo sự phân phối thuốc đến các kháng
nguyên bề mặt đặc hiệu. Một số kết quả khả quan đã đạt được trên
mô hình động vật in vitro và in vivo. Mặc dù đã sử dụng kháng thể
người để điều trị ung thư nhưng chúng vẫn chưa được phổ biến rộng
rãi trong lâm sàng. Nhiều phân tử đã được phát hiện trên bề mặt tế
bào trong các điều kiện bệnh lý, vì vậy liposome miễn dịch được
xem là một công cụ chẩn đoán và chữa bệnh đầy hứa hẹn trong
tương lai. Tuy nhiên tính bám đặc hiệu của liposome với tế bào đích
không luôn luôn dẫn đến sự phân phối thuốc có hiệu quả. Các kháng
nguyên đích mà tế bào tiếp thu có thể làm trung gian phân phối

nguồn gốc từ aicd béo (thường là palmitic acid). Sau khi bám vào bề
mặt các tế bào đích, sự tập trung của các phân tử globulin miễn dịch
ở các điểm tiếp xúc làm cho lớp màng kép của liposome không ổn
định. Tại vị trí này, các chất chứa trong liposome được giải phóng
vào các vùng lân cận của tế bào đích. Kỹ thuật này đã được sử dụng
để phân phối các tác nhân kháng virus.

Liposome được sử dụng trong liệu pháp gen, liệu pháp kháng
ung thư, điều trị các bệnh nhiễm trùng, chúng còn được sử dụng như
là hệ thống vaccine.
Liệu pháp gen là quá trình các trình tự DNA của gen đã biến
đổi đặc hiệu được đưa đến các tế bào với mục đích chữa bệnh hoặc
điều trị bệnh di truyền. Vì vậy, thay cho việc điều trị các triệu chứng
của bệnh như trong y học cổ truyền, liệu pháp gen có thể sửa chữa
chính xác nguyên nhân cơ bản của bệnh di truyền. Trong khi liệu
pháp gen là một khái niệm đơn giản thì sự phân phối gen đến các
vùng bị bệnh lại là một nhiệm vụ khó khăn. Vấn đề này cùng với sự
sử dụng vector virus đối với liệu pháp gen đã dẫn đến sự nghiên cứu
hệ thống phân phối không có bản chất virus, ít may rủi. Khi lựa chọn
với vector virus, liposome cation đã được sử dụng để chuyển gen vì
chúng không giới hạn kích thước của gen chuyển và có khả năng
sinh miễn dịch thấp. Hiệu quả của loại liposome này bị giới hạn do
sự gắn không đặc hiệu với nhiều loại tế bào. Ðể chuyển gen có hiệu
quả, cần đưa liposome tới vị trí gần khu vực đích. Sự sử dụng
liposome đích-phối tử (ligand-target liposome) cho phép điều khiển
chúng đi đến các tế bào bệnh một cách chính xác mà không đến các
tế bào khác. Một số các công ty dược đã cho ra đời các vector
liposome chuyển gen đang được thử nghiệm lâm sàng. Công ty
Vical (San Diego, USA) có hai hợp chất thử nghiệm dựa vào
liposome để phân phối gen:

tả lần đầu tiên vào đầu thập niên 1900 (Ellermann và Bang.O, 1908).
Hạt retrovirus có kích thước, hình dạng có thể thay đổi đôi
chút nhưng đường kính khoảng 100nm. Vỏ của virus là
glycoprotein, tạo thành các gai ở màng (Hình 1.9A). Protein trưởng
thành này được chia làm hai loại polypeptid (Hình 1.9B):
- Glycoprotein vỏ bên ngoài (SU), kháng nguyên chủ yếu của
virus, có chức năng bám vào thụ quan.
- Glycoprotein màng (TM), bám vào protein SU ở vỏ, chịu
trách nhiệm đối với sự dung hợp màng. 24 A

B

Hình 1.9: Sơ đồ cấu trúc cắt ngang của retrovirus

A. Cấu trúc cắt ngang
B. Cấu trúc protein vỏ

Bên trong màng là protein cơ bản (MA), không định hình.
Protein này bao lấy capsid (CA). CA là protein phong phú nhất trong
hạt virus (chiếm khoảng 33 % trọng lượng tổng số), có hình khối 20
mặt. Bên trong capsid là lõi, thường có hình nón, bao gồm: RNA
genome, protein nucleocapsid (NC), enzym phiên mã ngược (reverse
transcriptase = RT) và enzyme hợp nhất (integrase = IN).
Genome retrovirus bao gồm hai bản sao của phân tử RNA sợi