Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải
Trang 1

Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh
Bộ môn Công nghệ sinh học
Lớp DH06SH

Bài tiểu luận: MỘT SỐ KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN VI
KHUẨN LEPTOSPIRA Giáo viên hướng dẫn: Nguyễn Ngọc Hải
Sinh viên thực hiện:
Lý Sơn Tùng
MSSV:
06126178

cấy, MAT, ELISA và PCR trong việc chẩn đoán Leptospira.
Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải
Trang 3
TỔNG QUAN
I. Leptospira
1. Phân loại học
Theo Noguchi, 1917:
Giới: Monera
Ngành: Spirochaetes
Họ: Leptospiraceae
Giống: Leptospira
Các loài gồm có: L. alexanderi, L. biflexa, L. broomii, L. borgpetersenii, L. fainei, L. inadai, L.
interrogans, L. kirschneri, L. licerasiae, L. meyeri, L. weilii, L. noguchii, L. santarosai, L.
wolbachii, L. kmetyi, L. wolffii, L. genomospecies 1, L. genomospecies 3, L. genomospecies 4, L.
genomospecies 5. Trong số đó, người ta phân ra thành các loài gây bệnh, không gây bệnh và loài
trung gian.
Các loài gây bệnh
Leptospira interrogans
Leptospira kirschneri
Leptospira noguchii
Leptospira alexanderi
Leptospira weilii
Leptospira genomospecies 1
Leptospira borgpetersenii
Leptospira santarosai
Leptospira kmetyi
Các loài trung gian
Leptospira inadai
Leptospira fainei
Leptospira broomii

L. australis
L. canicola
L. autumnalis
L. grippothyphosa
L. bataviae
L. hebdomalis
L. ictero- haemorrhagiae
L. ponoma
L. mitis
L. saxkoebing
L. poi
L. sejroe
3. Khả năng gây bệnh
Leptospira gây bệnh xoắn khuẩn, gọi là Leptospirosis. Xoắn khuẩn có trong các loại động vật
(chuột, lợn, chó, sói, nhím). Súc vật thường không có triệu chứng bệnh. Người có thể bị lây trực
tiếp qua da bị xây xát, qua niêm mạc mắt mũi miệng, bộ phận sinh dục khi tiếp xúc. Người cũng có
thể bị lây gián tiếp qua môi trường (đất cát, nước, rau ) bị nhiễm xoắn khuẩn do nước tiểu súc vật
thải ra.
Đặc điểm chung của bệnh: có thương tổn ở gan hay thận và có biến chứng ở mắt, có thể gây
sẩy thai ở động vật và người.
Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải
Trang 5
Bệnh phổ biến khắp thế giới, nhưng có nhiều hơn ở những vùng khí hậu nóng ẩm, đất kiềm và
có nhiều mặt nước.
Các bệnh lí:

1) Bệnh lí ở bò thường do L. pomona và L. grippotyphosa. Đã thấy nhiều con vật có kháng
thể đặc hiệu và không phát bệnh lâm sàng.
2) Bệnh lí ở chó do L. icterohaemorrhagiae. Chuột là môi giới truyền bệnh; hoặc lây từ chó
sang chó.

Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải
Trang 6
- Thể thương hàn: biểu hiện xuất huyết trầm trọng viêm kết mạc mắt với nhũng điểm xuất
huyết ở da và niêm mạc, ói ra máu và phân sậm màu có máu, thú bị mất nước rất nhanh và chết
trong 24 ngày cùng với giảm thấp thân nhiệt, thường thấp hơn bình thường.
- Thể hoàng đản : Chó bệnh có biểu hiện viêm kết mạc mắt, hoàng đản, vàng da khó thở
tăng dần cùng với kém ăn, ói mửa, nếu không chữa trị trong giai đoạn cuối chó có sự tăng cao nhiệt
độ khó thở, hơi thở hôi. Tiêu chảy đôi khi xuất huyết và những biểu hiện viêm não trước khi hắt
hơi, thú chết trong khoảng 5-8 ngày mắc bệnh.

Hình 1. Chó bị tiêu chảy ra máu
Thể bán cấp tính và mãn tính:
- Thể này tương ứng với sự phát triển hội chứng sinh urea huyết hậu quả của viêm thận mà
một trong những biểu hiện là chứng tiểu nhiều, chứng khát nước rất nhiều cùng với ói mửa và tiêu
chảy. Sau một thời gian hôn mê do urea huyết chó sẽ chết.
- Thể thở khó có mùi urea ở miệng và xáo trộn hô hấp –viêm màng móng mắt, viêm cơ….
b. Bệnh lợn nghệ (24)
Thể á lâm sàng: biểu hiện triệu chứng lâm sàng ít thấy nhưng khi xét nghiệm huyết thanh học
thì phổ biến, có khi bị cả đàn nhất là lợn vỗ béo và lợn hậu bị.
Thể cấp tính: lúc đầu lợn bỏ ăn, nằm một chỗ, sốt 40 – 40,5
o
C, ỉa chảy nhưng không có triệu
chứng của vàng da hay đái ra máu. Sau đó xuất hiện triệu chứng điển hình nặng của vàng da, đái ra
máu, xuất huyết và triệu chứng thần kinh quỵ nửa thân sau, viêm màng não, phù đầu rất nặng, tỷ lệ
chết cao. Thể rối loạn sinh sản cho thấy lợn bị sẩy thai, hay chết lưu thai, tỷ lệ con sơ sinh chết cao
cùng với sốt, mất sữa và vàng da
ở lợn nái. Sẩy thai sau khi nhiễm vi khuẩn 4 – 7 ngày.
c. Bệnh trên bò (20)
Thể cấp tính: Bò thường có vẻ yếu và sốt 40 – 41
0

Các nguồn lây bệnh cho người (19)
Về lâm sàng, bệnh có thể chia thành 2 thể (23):
Thể vàng da xuất huyết: Đây là thể nặng với các biểu hiện: sốt dao động, da sung huyết, mắt
đỏ ngầu, đau cơ nặng (chủ yếu ở cơ bắp khi co bóp). Có ban xuất huyết thưa ở lưng và ngực (vào
ngày thứ 6 hay thứ 7), thiếu máu huyết tán. Vàng da và niêm mạc. Một số người bị sưng đ
au gan.
Đa số người tiểu ít hay vô niệu. Có thể có các biến chứng: viêm màng não thanh dịch, suy thận cấp,
xuất huyết đường tiêu hóa hoặc hô hấp, viêm cơ tim, rối loạn ý thức , bị sảy thai Tỷ lệ tử vong thể
này cao từ 5 – 10%.
Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải
Trang 8
Thể không vàng da: Là thể nhẹ hơn với các biểu hiện: sốt dao động, da sung huyết, mắt đỏ
ngầu, đau cơ nặng (chủ yếu ở cơ bắp chân, khi co bóp). Một số người có hạch sưng, đau, không
nóng đỏ. Hội chứng vàng da và hội chứng gan không rõ. Thể này không có tử vong.
5. Phòng và chữa bệnh do Leptospira
(19)
Phòng bệnh:

Phòng bệnh không đặc hiệu bằng cách cắt đứt dây chuyền dịch
tễ như diệt chuột, phòng bệnh cho gia súc nhưng chủ yếu là phòng
hộ lao động cho những đối tượng thường phải tiếp xúc với nguồn
lây, các đối tượng nguy cơ như các công nhân làm việc tại các trại
gia súc, công nhân vệ sinh cầu cống, làm việc trong hầm mỏ, Nói
chung, để có được hiệu quả thì cần triển khai nhiều khâu với sự phối hợp đa ngành chức năng mới
được;
Phòng bệnh đặc hiệu bằng vaccin chết, song chỉ cho các đối tượng phải tiếp xúc với nguồn lây.
Vấn đề phòng bệnh dựa trên nguyên tắc an toàn vệ sinh lao động bằng các biện pháp đơn giản như
mang giày cổ cao khi lội ruộng, bùn sình. Mang thêm găng tay khi phải dùng đến tay để thao tác.
Diệt chuột, vệ sinh sạch sẽ chất thải của các loại thú nuôi. Không được sử dụng nước hoặc tắm gội
tại các vùng nghi ô nhiễm Leptospira.

• Nếu môi trường nuôi cấy đã được giữ lạnh cần ủ môi trường cho tới nhiệt độ phòng trước
khi sử dụng.
• Mẫu xét nghiệm tránh tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng (tia cực tím có thể phá hủy các mô).
b. Kết quả

Một thí nghiệm nhằm tối ưu hóa việc nuôi cấy Leptospira đã sử dụng bốn loại phương pháp lấy
mẫu khác nhau. Đó là: whole blood, surface plasma (huyết tương bề mặt), deposit from spun
plasma và clotted blood (máu ngưng đọng lại) (2).
Kết quả thí nghiệm cho bởi bảng sau (2): Kết quả cho thấy sử dụng whole blood vẫn cho tỉ lệ phát hiện cao (81.3%).

Tuy nhiên, đối với Leptospira trong máu thường chỉ tồn tại 7-15 ngày nên việc lấy mẫu máu tốt
nhất cho nuôi cấy là vào khoảng ngày thứ 5 khi nhiễm bệnh.
Kết quả nuôi cấy Leptospira tại
Leptospira Research Laboratory
(26)
Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải
Trang 10
c. Nhận xét
Ưu điểm: thường sử dụng trong công tác nghiên cứu bệnh học phòng thí nghiệm.
Nhược điểm:

• Mất thời gian (khoảng 20 – 30 ngày để nhận kết quả dương tính).
• Độ nhạy thấp, khả năng thành công không cao khi nuôi cấy. Sau ngày nhiễm bệnh
thứ 14, hiếm khi thu được khuẩn lạc.
• Có thể gây nhiễm cho người thí nghiệm.
• Thường không sử dụng trong xét nghiệm bệnh.
2. Kỹ thuật Microscopic agglutination test (MAT)

0
C – 37
0
C.
• Kết quả đọc từ đĩa truyền một giọt từ mỗi giếng trên vật kính kính hiển vi.
− Phương pháp thông dụng (Cole et al – 1973): Dịch pha loãng huyết thanh của
hỗn hợp kháng nguyên/ huyết thanh ở đĩa chuẩn độ và truyền được chuyển lên vật
kính bằng pipette (3).
− Phương pháp cải tiến (Philip L. Carter và Terence J. Ryan – 1975): Đặt các
đĩa truyền, đĩa chứa mẫu, vật kính lên đĩa đỡ. Các giọt mẫu chả
y xuyên qua đĩa
truyền lên 2 vật kính. Sau đó, vật kính sẽ được lấy ra khỏi đĩa đỡ, tránh làm nghiêng
khiến các giọt hòa vào nhau (3).
• Đọc kết quả dưới kính hiển vi (X200), khô, với tụ sáng là tối (4).
b. Kết quả
Kết quả dương tính khi 50% kháng nguyên hay hơn có phản ứng ngưng kết. Điểm cuối chuẩn
độ xác định bởi giếng cuối cùng mà 50% kháng nguyên hay hơn có phản ứng ngưng kết quan sát
thấy (4).
Sự ngưng kết ở phương pháp thông thường và phương pháp cải tiến thu được là như nhau (3).
Phương pháp cải tiến được đề nghị sử dụng và thay thế phương pháp thông dụng (1975) do khi
sử dụng phươ
ng pháp này không có sự mất mẫu khi chảy qua các lỗ ở đĩa chuyển. Trong khi đó, sử
dụng pipette thường có sự rò rỉ của mẫu vì không hút được toàn bộ dịch mẫu (3).
Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải
Trang 12

c. Nhận xét
Đây là kỹ thuật đã được sử dụng từ lâu trong việc chẩn đoán Leptospira. Nó được dụng rộng rãi
trong nhiều nước (theo Thiermann và Garrett, 1983; Ellis, 1986), đặc biệt là trong các phòng thí
nghiệm.

(This image is in the
public domain and thus
free of any copyright
restrictions. Courtesy
of the Centers for
Disease Control/Mrs.
M. Gatton) (27)
Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải
Trang 13
sẽ tạo màu và cường độ màu tỉ lệ thuận với lượng kháng thể có trong mẫu đặc hiệu với kháng
nguyên đã biết.
a. Quy trình thực hiện
Có nhiều kỹ thuật ELISA khác nhau được sử dụng trong chẩn đoán Leptospira. Đây là quy trình
thực hiện được đưa ra bởi WJ Terpstra et al (1980) và El Jalii et al (2002) (4).
• Phản ứng ELISA thực hiện trên một đĩa vi chuẩn (đĩa ELISA) thường gồm 96 giếng đồng
đều nhau.
• Kháng nguyên sử dụng trong ELISA là kháng nguyên đặc trưng cho loài
(lipopolysaccharide) thu từ nuôi cấy Leptospira đã đun sôi (đã giết chết Leptospira).
• Chuẩn bị đối chứng là mẫu huyết thanh đã biết dương tính (lấy từ gia súc hoặc người bị
bệnh) và âm tính (lấy từ ngân hàng máu).
• Chuẩn bị mẫu huyết thanh từ động vật hay người nghi nhiễm.
• Đầu tiên ta phủ một lớp khoảng 100µl kháng nguyên (đã được pha loãng khoảng 1/1600
trong chất đệm (buffer) carbonate/bicarbonate pH 9.6) vào các giếng, sau đó đem ủ ở 4
0
C
qua đêm (cũng có thể tiến hành ở 37
0
C trong 1 giờ).
• Sau đó tiến hành rửa 4 lần với buffer rửa có chứa 0.05% Tween 20 trong PBS pH 7.0.
• Tiếp theo, thêm vào các giếng 100µl BSA/PBS để ngăn các kết dính không đặc hiệu, rồi tiến

ELISA, kỹ thuật dot – ELISA với bộ KIT (Ví dụ: bộ KIT Panbio của Ustralia có thể sử dụng cho cả
kỹ thuật ELISA và Dip – S – Tick
TM
(dot – ELISA)) được thiết kế phù hợp.
ELISA sử dụng bộ KIT được ứng dụng trong chẩn đoán nhanh các bệnh Leptospirosis.
Sau đây là bảng kết quả so sánh giữa ELISA và dot-ELISA khi sử dụng bộ KIT Panbio (7):

c. Nhận xét
Ưu điểm:
• Phương pháp bán tự động, dễ thực hiện và dễ theo dõi kết quả.
• Có thể sử dụng bộ KIT để chuẩn đoán nhanh, cùng lúc có thể thực hiện được nhiều test trên
mỗi KIT.
• Có khả năng phát hiện sớm hơn các phương pháp đã nêu trước đó.
• Độ nhạy, độ đặc hiệu cao (theo bảng trên), độ chính xác cũng tương đối cao.
• Sử dụng kháng nguyên đã được giết nên không gây nhiễm cho người trong quá trình thao
tác.
Nhược điểm:

• Cần thời gian để kháng thể xuất hiện.
• Có khi cần thực hiện xét nghiệm 2 lần liên tiếp. Sử dụng IgM ELISA chỉ cần xét nghiệm 1
lần (1).
• Có thể xảy ra hiện tượng âm tính giả hay dương tính giả (1).
4. Kỹ thuật Polymerase chain reaction (PCR)
Kỹ thuật khuếch đại gene (PCR) được Kary Mullis (giải Nobel năm 1993) phát minh trong
những năm 1980. Kỹ thuật này có thể xem là một kỹ thuật phòng thí nghiệm khá đơn giản (1).
Phản ứng xảy ra tạo màu
(26)
Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải
Trang 15
Nguyên tắc chung (1): được thực hiện dựa trên cơ sở đặc điểm của sự hồi tính, biến tính và kéo

Dưới đây là một số hình ảnh về kết quả điện di sản phẩm PCR: Kết quả PCR từ mẫu
nước tiểu của heo (13):
1. L.pomoma
2. L.grippothiphosa
3 . L.ballum
4. E.coli
5. B. melitensis
6. S. aureus
7. L. patoc
8. S. abortus ovis
9. M. bovis
10. L. infantum
K-no DNA tamplate
M-thang 100bp
Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải
Trang 16
c. Nhận xét

Hiện nay, phương pháp PCR được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: chẩn đoán, xét nghiệm, giải
mã di truyền, nghiên cứu sự tiến hóa của sinh vật ở mức độ phân tử,….
Kỹ thuật PCR được ứng dụng trong test nhanh bệnh Leptospirosis. Nhiều bộ KIT đã được sản
xuất để phục vụ tốt hơn cho kỹ thuật này (Ví dụ: Fast DNA Kit từ Q BIO GENE (13)).
Kết quả PCR từ mẫu nước
tiểu của người (14):

Ưu điểm:
• Đơn giản, nhanh, nhạy, đặc hiệu.
• Chi phí thấp.
Nhược điểm:
• Có thể xảy ra hiện tượng dương tính giả.

III. So sánh giữa các kỹ thuật
Bệnh Leptospirosis có ảnh hưởng nguy hiểm đến người và vật nuôi, vì vậy rất nhiều người quan
tâm đến nó. Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện nhằm tìm phương pháp tốt nhất cho việc chẩn
đoán xoắn khuẩn Leptospires.
Các kỹ thuật thông dụng hiện nay là kỹ thuật MAT, ELISA và PCR. Kỹ thuật MAT đã được đưa
ra, áp dụng từ 1965 và vẫn dùng cho đến ngày nay. Kỹ thuật ELISA và PCR ra đời sau MAT và có
những ưu điểm nhất định trong việc chẩn đoán nhanh Leptospira. Hai kỹ thuật này đã ược nghiên
cứu nhằm phát triển hoàn chỉnh nhất để thay thế cho MAT.
Giữa ELISA và MAT, một thí nghiệm thực hiện bởi I.M. El Jalii (2008) trên 170 mẫu huyết
thanh bò đã cho kết quả như sau (4):
− 27.7% mẫu dương tính với MAT, trong khi với ELISA là 56.5%.
− Tất cả các mẫu dương tính với MAT đều dương tính với ELISA.
− Không có mẫu dương tính nào của MAT mà âm tính với ELISA. 28.8% dương tính với
ELISA nhưng âm tính với MAT.
Như vậy kỹ thuật ELISA nhạy hơn và phát hiện được nhóm huyết thanh Leptospira gây bệnh
nhiều hơn kỹ thuật MAT.
Thí nghiệm công bố năm 1998 của Eliete C. Romero và ctv (8) (mẫu từ dịch não tủy
cerebrospinal fluid (CSF) của 103 bệnh nhân) so sánh ba kỹ thuật với nhau, cho kết quả như sau: Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải
Trang 18

Như vậy độ nhạy của PCR cao hơn hẳn các kỹ thuật khác, tuy nhiên một số mẫu cho kết quả âm

Trang 20
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Công nghệ sinh học trong thú y – Nguyễn Ngọc Hải, nhà xuất bản nông nghiệp.
2. Optimization of Culture of Leptospira from Humans with Leptospirosis - Vanaporn
Wuthiekanun và ctv, JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, tháng 4/2007, trang 1363
–1365.
3. New Microtechnique for the Leptospiral Microscopic Agglutination Test - Philip L.
Carter và Terence J. Ryan, JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, tháng 8/1975, trang
474 – 477.
4. Comparison between ELISA and the Microscopic Agglutination Test for the Diagnosis
of Bovine Leptospirosis - I.M. El Jalii, Revue Élev. Méd. vét. Pays trop., 2008, số 61(2) trang
73-75.
5. Bayesian inference for within-herd prevalence of Leptospira interrogans serovar
Hardjo using bulk milk antibody testing - FRASER I. LEWIS, GEORGE J. GUNN, Biostatistics
Advance Access tháng 7/2009, trang 1 – 10.
6. ELISA for the detection of Human Leptospirosis – Ana Fuentes và ctv, Mem Inst
Oswaldo Cruz, tháng 9/1994, số 89, trang 365.
7. Leptospirosis: diagnose with confidence – Panbio diagnostics, www.panbio.com
8. Detection of Leptospira DNA in Patients with Aseptic Meningitis by PCR - ELIETE C.
ROMERO,
JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, tháng 5/1998, trang 1453–1455.
9. Two Test Strategy for the Diagnosis of Leptospirosis - Vaishali B Dohe và ctv, Bombay
Hospital Journal, Vol. 51,(2009).
10. Linnodee Leptospira Hardjo ELISA – LINNODEE, www.linnodee.com
11. Handbook for the Collection, Storage and Transport of Pathology Specimens in Rural
and Remote Queensland – Queensland Health, tháng 12/2007, mục 9.9 trang 38 – 39.
12. Pcr detection of Leptospira DNA in rodents and insectivores from Tanzania - G.F.
Mgode và ctv, Belg. J. Zool, tháng 12/2005, 135 (phần bổ sung) : 17-19.
13. Polymerase chain reaction method for leptospirosis, analysis on samples from an
autochthon swine population in Sicily, Italy - Dr. Maria Vitale và ctv, REV CUBANA MED

và ctv, Clin Diagn Lab Immunol, tháng 3/2001, số 8(2), trang 349–351.
26. Leptospira Research Laboratory
27.

Trang web www.google.com.vn với từ khóa: Leptospira, Leptospirosis, ELISA Leptospira,
PCR Leptospira, Microscopic agglutination test, Leptospira blood culture để tìm một số hình
ảnh và bài báo có liên quan
Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải
Trang 22 PHỤ LỤC Trang

LỜI MỞ ĐẦU 3
TỔNG QUAN
I. Leptospira 4
1. Phân loại học 4
2. Đặc điểm sinh vật học 5