Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
-------------------------------
PHẠM THẾ VŨ
NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG MỘT SỐ KỸ THUẬT
CHẨN ĐOÁN NHANH VIBRIO CHOLERAE GÂY DỊCH
TIÊU CHẢY CẤP TẠI TỈNH THÁI NGUYÊN NĂM 2008 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
THÁI NGUYÊN - 2009
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa có ai công bố
trong một công trình nào khác.

Tác giả

Phạm Thế Vũ
Lời cảm ơn

Để hoàn thành luận văn này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô:
Khoa Sau đại học, Khoa sinh - KTNN Trường Đại học Sư phạm Thái
Nguyên, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương, Viện Khoa học – Công nghệ Việt
Nam.

1
2. Mục tiêu nghiên cứu
3
3. Những đóng góp mới của đề tài
3
4. Giới hạn nghiên cứu
3
5. Cấu trúc của luận văn
3
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tình hình dịch tả trên thế giới và Việt Nam
4
1.1.1. Tình hình dịch tả trên Thế giới 4
1.1.2. Tình hình bệnh tả ở Việt Nam 8
1.2. Căn nguyên gây bệnh
11
1.2.1. Ổ chứa và nguồn bệnh 11
1.2.2. Tác nhân gây bệnh 11
1.2.3. Phương thức lây truyền 12
1.2.4. Tính cảm nhiễm 13
1.2.5. Diễn biến bệnh 13
1.2.6. Kháng nguyên và cấu trucas lớp vi khuẩn 14
1.2.7. Độc tố của vi khuẩn tả 16
1.2.8. Một số phương pháp phát hiện Vibrio cholerrae trong
phòng thí nghiệm
18

Chƣơng 2. ĐÓI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU


3.2.4. Nhận biết Vibio cholerrae bằng phương pháp test nhanh 52

3.2.5. Chẩn đoán Vibio cholerrae bằng kỹ thuật PCR 54
3.3. Đánh giá các kỹ thuật chẩn đoán Vibrio cholerae O1

3.3.1. Kỹ thuật soi tươi với kháng huyết thanh đặc hiệu 56
3.3.2. Kỹ thuật soi tươi và kỹ thuật nhuộm Gram 57
3.3.3. Kỹ thuật soi tươi với kỹ thuật nuôi cấy 58
3.3.4. Kỹ thuật nhuộm Gram với kỹ thuật nuôi cấy 58
3.3.5. Phương pháp test nhanh với kỹ thuật nuôi cấy 59
3.3.6. Kỹ thuật nuôi cấy với phương pháp PCR 60
3.4. Tổng hợp kết quả các phƣơng pháp và thời gian
61
KẾT LUẬN
66
ĐỀ NGHỊ
68
TÀI LIỆU THAM KHẢO
69

DANH MỤC CÁC BẢNG

1 Bảng 1.1 Tình hình dịch tả ở Việt Nam từ tháng 10/2007
đến tháng 5/2008
9
2 Bảng 1.2 Phân lập V.cholerae typ cổ điển và typ Eltor 15
3 Bảng 2.1 Danh mục một số dụng cụ, hóa chất 20
4 Bảng 3.1 Phân bố đối tượng nghiên cứu theo giới, tuổi 29
5 Bảng 3.2 Tỷ lệ bệnh nhân theo tuổi 31
6 Bảng 3.3 Phân bố bệnh nhân dương tính Vibrio cholerrae
theo giới tính
33
7 Bảng 3.4 Tỷ lên thu thập mẫu các địa điểm nghiên cứu 34
8 Bảng 3.5 Tỷ lệ vi khuẩn di động quan sát trên lam kính 36
9 Bảng 3.6 Tỷ lệ vi khuẩn Gram âm quan sát dưới kính hiển
vi
37
10 Bảng 3.7 Phần đánh giá chung trong việc xác định các vi
khuẩn
38

57
23 Bảng 3.20 So sánh kỹ thuật soi tươi và kỹ thuật nhuộm
Gram
57
24 Bảng 3.21 Bảng so sánh kỹ thuật soi tươi với kỹ thuật nuôi
cấy
58
25 Bảng 3.22 Bảng so sánh kỹ thuật nhuộm Gram với kỹ thuật
nuôi cấy
59
26 Bảng 3.23 Bảng so sánh phương pháp test nhanh với kỹ
thuật nuôi cấy
59
27 Bảng 3.24 Đánh giá kết quả của phương pháp thử Oxidase
với kỹ thuật soi tươi
60
28 Bảng 3.25 Bảng so sánh phương pháp nuôi cấy và PCR 61
29 Bảng 3.26 Tổng hợp kết quả các phương pháp và thời gian
được áp dụng
61
30 Bảng 3.27 Một số phương pháp có thể áp dụng chẩn đoán
nhanh Vibrio cholerrae
62
31 Bảng 3.28 Bảng so sánh kỹ thuật nuôi cấy với (bảng 3.27) 64

DANH MỤC CÁC HÌNH

1 Hình 1.1 Biểu đồ khu trú vi khuẩn tả ở ruột non 17
2 Hình 2.1 Sơ đồ phân lập chẩn đoán Vibrio cholerrae O1 24
3 Biểu đồ 3.1 Đánh giá độ tuổi trong thu thập mẫu 30


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
MỞ ĐẦU

1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI

Dịch tiêu chảy cấp đang có chiều hướng gia tăng ở các địa phương, tính
từ 23/10/2007 miền Bắc đã xảy ra ba đợt dịch tiêu chảy cấp nguy hiểm, số
bệnh nhân tiêu chảy cấp đã lên đến 1.335 người, có 136 trường hợp dương
tính với phẩy khuẩn tả tại 18 tỉnh / thành phố trong cả nước trong đó có tỉnh
Thái Nguyên [13].
Khống chế dịch tả là mục tiêu lớn trong chương trình quốc gia phòng
chống bệnh tiêu chảy của Việt Nam. Với những thành tựu và kinh nghiệm
phòng chống dịch tả trong nhiều năm qua, ngày nay bệnh tả không còn là nỗi
khiếp đảm của mỗi người dân, của các tổ chức chính quyền và xã hội. Các
điều kiện chuẩn mực về kiểm soát môi trường ở nước ta còn lạc hậu. Các vấn
đề cung cấp nước, vệ sinh thực phẩm, dinh dưỡng an toàn và vấn đề xử lý vệ
sinh chất thải chưa làm được bao nhiêu, nhiều nơi còn bị buông lỏng hoặc
quên lãng. Trong thời kỳ giao lưu phát triển kinh tế và ngoại giao trong quan
hệ hợp tác giữa các nước trong khu vực và toàn cầu ngày càng được mở rộng
thì bên cạnh đó là những điều kiện rất dễ bùng phát các vụ dịch nói chung,
trong đó có dịch tả nói riêng [30].
Thái Nguyên là tỉnh miền núi phía Bắc tiếp giáp với các tỉnh: Lạng
Sơn, Bắc Giang, Bắc Kạn, Tuyên Quang, Vĩnh Phúc, Hà Nội, là cửa ngõ giao
lưu Kinh tế - Văn hoá – Xã hội thuận lợi giữa các tỉnh miền núi phía Bắc với
đồng bằng Bắc Bộ, là trung tâm đào tạo quan trọng đứng thứ 3 trong cả nước.
Trường Đại học Thái Nguyên với 6 trường đại học thành viên và trên 20
trường cao đẳng trung học dạy nghề. Toàn tỉnh hiện có gần 4000 cơ sở sản
xuất kinh doanh và chế biến dịch vụ phục vụ, trong số 1.150 cơ sở sản xuất
kinh doanh công nghiệp có hàng ngàn bếp ăn tập thể của công nhân, học sinh,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

- Xác định tỷ lệ bệnh nhân dương tính với Vibrio cholerae (V. cholerae )
trong giai đoạn từ tháng 3 năm 2008 đến tháng 7 năm 2008.
- Đánh giá hiệu quả các kỹ thuật phát hiện Vibrio cholerae (soi tươi, nhuộm
soi, test nhanh, nuôi cấy, PCR)
- Lựa chọn những kỹ thuật phù hợp để áp dụng sàng lọc chẩn đoán nhanh
Vibrio cholerae tại labo tuyến huyện khi có dịch tiêu chảy cấp.

3. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI
- Đề tài nghiên cứu đã đánh giá các kỹ thuật phát hiện Vibrio cholerae trên
mẫu phân của bệnh nhân mắc bệnh tiêu chảy cấp tại tỉnh Thái Nguyên.
- Đáp ứng tính ứng dụng và hiệu quả tại labo tuyến huyện.

4. GIỚI HẠN NGHIÊN CỨU
- Thời gian nghiên cứu ngắn nên ứng dụng đánh giá hiệu quả sau phân tích
chưa có số liệu đánh giá cụ thể.

5. CẤU TRÚC CỦA LUẬN VĂN
Ngoài phần mở đầu và kết luận, luận văn có 3 chương:
Chương 1: Tổng quan tài liệu
Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
Chương 3: Kết quả và bàn luận
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
CHƢƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.Tình hình dịch tả trên thế giới và Việt Nam
1.1.1. Tình hình dịch tả trên thế giới

nhân tả mất nước nặng bằng phương pháp tiêm tĩnh mạch dung dịch chứa
muối và điện giải [5], [47].
- Vụ đại dịch thứ 3: Dịch tả lan tới nước Anh, tại Luân Đôn, John Snow đã
phát hiện rất quan trọng về dịch tễ học là bệnh tả lan truyền theo đường nước
sinh hoạt bị ô nhiễm và từ đó đã đề ra biện pháp chống dịch hiệu quả là loại
bỏ nguồn nước sinh hoạt không hợp vệ sinh [17], [27], [61].
- Vụ đại dịch thứ 4: Dịch tả hoành hành dữ dội ở New Orleans và các thành
phố, thị trấn dọc theo triền sông Missippi, Missouri và Ohio của nước Mỹ [1],
[5], [62].
- Vụ đại dịch thứ 5: Dịch tả lan tới vùng trung cận đông, sau đó lan tới Nam
Mỹ, gây ra các vụ dịch lớn với tỷ lệ tử vong cao ở các nước Argentina, Chilê
và Peru. Tại Ai Cập và Calcutta (Ấn Độ), Robert Koch đã phân lập được vi
khuẩn tả từ phân của bệnh nhân bị bệnh tả , chỉ một năm sau khi Koch phân
lập được vi khuẩn tả, Ferran là người đầu tiên đã gây miễn dịch dự phòng
tả bằng vaccin [12], [45].
- Vụ đại dịch 6: Gây ra các vụ dịch lớn ở vùng Trung Cận Đông và bán đảo
Ban Căng, từ năm 1921 đến năm 1961, ngoài một vụ dịch tả lớn xảy ra ở Ai
Cập năm 1961 với 32.978 trường hợp tả, gây tử vong 20.472 người, dịch tả
chủ yếu lưu hành ở các nước thuộc khu vực Đông Nam Á và châu Á, trong 6
vụ đại dịch đầu tiên tác nhân gây bệnh là V. cholerae O1, typ sinh học cổ điển
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
do Pacini mô tả đầu tiên phân lập được năm 1854 và được nhà vi trùng học
người Đức Robert Koch khảng định lại năm 1883[5], [46], [59].
- Vụ đại dịch thứ 7: Tác nhân gây bệnh là V. cholerae O1, týp sinh học El
Tor, do Goschlich lần đầu tiên phân lập được năm 1905 được chia làm 4 giai
đoạn sau: Từ năm 1961-1962 dịch tả khu trú ở các đảo thuộc Indonesia và các
nước Đông Nam Á, với tổng số 13.393 người mắc, tử vong 1.977 người [49],
[55]. Năm 1963-1969 chỉ trong thời gian ngắn dịch xuất hiện nhiều nước châu
Á: Ấn Độ, Pakistan, Liên Xô cũ, I-Rắc, Việt Nam bắt đầu có dịch tả El Tor
vào tháng 1 năm 1964. Giai đoạn tiếp theo từ năm 1970-1990 theo số liệu của

Mỹ, dịch tả xuất hiện vào những năm 1800 sau đó được khống chế do đảm
bảo vệ sinh nguồn nước sinh hoạt. Tuy vậy, giao thông và du lịch tạo điều
kiện để bệnh xuất hiện lẻ tẻ. Đa số trường hợp do đi du lịch tại các nước Mỹ
La tinh, châu Phi, châu Á. Một số trường hợp nhiễm bệnh do ăn thức ăn mang
về từ các quốc gia còn lưu hành bệnh [44], [52].
Theo Nguyễn Anh Dũng, tính đến năm 1991, đại dịch tả lần thứ 7 đã có
91 nước có dịch [6], đến năm 1992 theo Tổ chức Y tế thế giới đã có ít nhất 98
nước có dịch tả. Nhờ những hiểu biết đáng kể về căn nguyên gây bệnh, về
điều trị và cơ chế miễn dịch bệnh tả mà tỷ lệ tử vong do tả đã giảm xuống một
cách đáng kể chỉ còn 1% - 3% [6].
Phẩy khuẩn V. cholerae O1 bao gồm hơn 60 nhóm huyết thanh, nhưng
chỉ có một nhóm huyết thanh O1 là gây được bệnh tả, V. cholerae O1 lại gồm
2 sinh týp là sinh týp cổ điển và sinh týp El-Tor, mỗi sinh týp lại gồm 2 týp
huyết thanh (Ogawa và Inaba) [8], [22].
Sinh týp El-Tor gây nên hầu hết các vụ dịch tả gần đây, tuy vẫn còn
nhiều vụ dịch xảy ra ở tiểu lục địa Ấn Độ là do sinh týp cổ điển. Sinh týp El-
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Tor có thể sống kết hợp với một sinh vật dưới nước, làm cho nước trở thành
một kho tàng lưu trữ gây nhiễm [31], [54].
Từ cuối năm 1992, dịch tả do V. cholerae O139 đã xuất hiện ở một số
nơi thuộc Đông nam Ấn Độ, sau đó nhanh chóng lan tới Đông Bắc nước này
thuộc vịnh Belgan.Tháng 3/1993 dịch lớn sảy ra ở Bangladesh, tiếp đó xuất
hiện ở Miama, Trung Quốc (Tân Cương,7/1993), Thailand (8/1993) đến tháng
9 cùng năm đã có nhiều trường hợp mắc tả V. cholerae O139 ở Malaysia [34].
Người ta đã phân lập được V. cholerae non O1 ở các bệnh nhân tiêu chảy
nặng thuộc 2 cộng đồng ở Florida.Tính gây bệnh đường tiêu hoá ở người và
sự đồng nhất hoá của những chủng này làm nảy sinh những câu hỏi về sự
tương quan của những chủng V. cholerae O1 độc và không độc dọc bờ biển
Gulf của hoa Kỳ [39], [56].
Một đánh giá khảo sát trên tất cả các bệnh viện tư nhân ở Recife cho

Ngày xuất hiện 23/10/2007 24/12/2007 5/3/2008
Tổng số mắc 1.907 58 3.480 5.445
Số dương tính (+) với tả 295 32 581 908
Số tỉnh/thành có tả (+) 14 1 18
Tập trung nhiều nhất tại Hà Nội Hà Nội Hà Nội
Số tử vong 0 0 0 0
Ngày kết thúc 06/12/2007 5/2/2008 22/5/2008

(Nguồn số liệu: Cục Y tế Dự phòng và Môi trường Việt Nam)

Nguyễn Phú Quý (1993) đã thông báo về những đặc điểm sinh học của
V. cholerae O139 và quy trình kỹ thuật phân lập xác định mầm bệnh với
kháng huyết thanh đặc hiệu của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương [36].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Kết quả xét nghiệm phân lập được V. cholerae El-Tor có sự dao động
lớn giữa các tác giả, thấp nhất là 1,52 % và cao nhất là 45,70 %. Phan Đạo và
cộng sự cho rằng thời gian đỉnh của vụ dịch tỷ lệ phân lập cao trên 50% [9].
Một số tác giả còn đưa ra tỷ lệ phân lập theo nhóm tuổi, tỷ lệ phân lập vi
khuẩn tả dương tính ở nhóm tuổi 6-16 tuổi là 15,08 %, 17-50 tuổi là 44,56 %,
điều này càng chứng tỏ dưới 50 tuổi có tỷ lệ mắc tả cao [6], [7]. Tỷ lệ người
lành mang trùng, khi phân lập vi khuẩn tả ở những người lành trong các vụ
dịch, các tác giả trong nước cho thấy rất thấp là 1% và cao nhất là 15% [9],
[14].
So với nhiều dịch bệnh mới xuất hiện và đang diễn biến phức tạp hiện
nay, bệnh tiêu chảy cấp nguy hiểm không phải là bệnh khó kiểm soát, dịch
bệnh có thể bùng phát khi có đủ ba mắt xích liên kết với nhau (nguồn bệnh,
đường lây, sức cảm thụ), cả 3 mắt xích này đã được xác định rất rõ bởi các
nhà dịch tễ học. Mặc dù chưa khẳng định được nguyên nhân gây bệnh, nhưng
qua số liệu nghiên cứu của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, có thể khẳng
định vi khuẩn tả xuất phát từ thực phẩm. Chưa bao giờ có một vụ dịch nào

cholerae được xác định rất rõ thông qua các tính chất sinh vật, hoá học và sự
đồng nhất của DNA, tuy nhiên chúng không đồng nhất về khả năng gây bệnh,
điều này đặc biệt quan trọng vì các chủng gây bệnh mới có khả năng sinh độc
tố ruột và gây dịch. Một sự phân biệt đơn giản trong y tế cộng đồng là V.
cholerae thuộc nhóm huyết thanh O1 có khả năng sinh được độc tố, còn lại tất
cả các nhóm khác thì không có khả năng gây bệnh hoặc rất hiếm khi gây
bệnh. V. cholerae O1 thuộc nhóm huyết thanh O1 có khả năng sinh độc tố và
gây thành đại dịch tả, tuy nhiên có một số ít chủng không sinh ra độc tố và
không có gen mã hoá độc tố. Các chủng ở môi sinh không có khả năng sinh
độc tố và không gây bệnh, ngoại lệ có một só chủng V. cholerae O1 phân lập
được ở một số bệnh nhân tiêu chảy hoặc nhiễm trùng ngoài đường tiêu hóa,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
V. cholerae O1 gồm 3 týp huyết thanh là Inaba, Ogawa và Hikojima và bao
gồm hai sinh týp khác nhau là sinh typ cổ điển và sinh týp El tor [23], [35].
Những năm gần đây, khi các vụ dịch tả do V.cholerae O139 gây ra,
việc định danh tất cả các chủng V. cholerae đều dựa trên tính chất sinh vật
hoá học, sau đó nếu chủng nào không ngưng kết với O1 thì được gọi là
“Vibrio cholerae - không O1”, sau này được đổi thành Vibrio không gây tả
hoặc “nhóm Vibrio không ngưng kết”. Hiện nay các nhóm này thuộc các
nhóm huyết thanh từ O2 - O138, không có khả năng gây dịch tả. Nhóm Vibrio
này đôi khi gây tiêu chảy do liên quan đến ăn hải sản, hoặc các nhiễm trùng
ngoài đường tiêu hoá như vết thương...
Vụ dịch tả xảy ra vào đầu năm 1993 tại Ấn Độ và Bangladaesh do một
loại Vibrio non O1 gây ra, đó là V. cholerae O139 còn gọi là Vibrio Bengal.
Nhìn chung đây là một chủng lai giữa V. cholerae O1 và Vibrio cholerae -
non O1 và điều quan trọng là độc lực của nó là độc tố ruột và kháng nguyên
nhung mao đồng điều hoà độc tố, tuy nhiên chủng O139 giống với sinh týp
ElTor hơn [38], [41].
Dựa vào độc tính vi khuẩn V. cholerae O1 có thể chia thành 2 nhóm
chính theo huyết thanh (serogroups) đó là O1 và O139. Nhóm O1 có hai týp

vệ sinh, sử dụng thức ăn đường phố, hải sản chưa chín, nước chưa qua khử
trùng, dùng phân tươi trong trồng trọt, khu vực đồng bằng cửa sông, ven biển,
vùng bị ngập lụt [31].
1.2.5. Diễn biến bệnh
Thời kỳ ủ bệnh từ vài giờ tới 5 ngày, thường từ 2-3 ngày, thời kỳ khởi
phát rất ngắn, bệnh nhân bắt đầu cảm thấy đầy bụng và sôi bụng; tiếp theo đó
tiêu chảy, lúc đầu có phân, sau chỉ toàn nước và kiệt sức nhanh chóng. Bệnh
nhân thường chỉ nôn sau khi đã tiêu chảy nhiều lần, thời kỳ toàn phát thường
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
có các triệu chứng tiêu chảy liên tục, nhiều lần, phân toàn nước, nước phân lờ
lờ đục như nước vo gạo, trong đó có những vẩy màng màu trắng (là mảnh tế
bào thượng bì niêm mạc ruột lẫn phẩy khuẩn tả). Bệnh nhân không đau bụng,
mót rặn và không có nhày máu mũi. Số lần tiêu chảy và số lượng nước mất
thay đổi tùy từng trường hợp nặng nhẹ khác nhau như nôn dễ dàng, lúc đầu
nôn ra thức ăn, sau chỉ toàn nước trong hoặc vàng nhạt, tiếp theo các triệu
chứng khác bệnh nhân không sốt, người mệt lả, có thể bị chuột rút, biểu hiện
tình trạng mất nước từ độ I đến độ III như khát nước, da khô, nhăn nheo, hốc
hác, mắt trũng, mạch nhanh, huyết áp hạ, có khi không đo được, tiểu tiện ít
hoặc vô niệu, chân tay lạnh... Ngoài ra bệnh nhân có thể bị rối loạn thăng
bằng điện giải như hạ kali máu [5], [19].
1.2.6. Kháng nguyên và cấu trúc lớp vỏ vi khuẩn
Sự thay đổi tính chất kháng nguyên là yếu tố quan trọng trong nghiên
cứu dịch tễ và độc lực của vi khuẩn. Đối với vi khuẩn tả, khả năng gây thành
dịch của chủng Bengal nói trên là môt ví dụ minh hoạ. Nhiều loại vi khuẩn
khác trong môi trường nước cũng có kháng nguyên roi như vi khuẩn tả vì vậy
không thể căn cứ vào loại kháng nguyên này để phân biệt. Týp huyết thanh
phẩy khuẩn đã được phân biệt dựa trên đặc điểm vào kháng nguyên O ( kháng
nguyên vỏ). Hầu hết các chủng vi khuẩn tả đều không có độc tính. Chủng
Bengal gây thành dịch được định danh là O1. Tuy vậy có tới 3 týp sinh học
của O1 được gọi tên Ogawa, Inaba và Hikojima. Mỗi chủng trong 3 loại này