Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản

SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng
MSSV: 2052056
Trang 1
Phần 1: ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1. Giới thiệu
Listeria monocytogenes có khả năng gây bệnh listeriosis với các triệu
chứng như sảy thai, thai chết lưu và đẻ non, gây nhiễm trùng máu và viêm
màng não đối với trẻ em và những người có hệ miễn dịch kém. Vì vậy Listeria
monocytogenes là một chỉ tiêu được kiểm soát trong quản lý chất lượng thực
phẩm.
Các phương pháp truyền thống ví dụ như ISO 11290-1:2004 hay BAM
– FDA (chương 10) phát hiện Listeria monocytogenes trong thực phẩm bao
gồm các bước tăng sinh, phân lập trên môi trường chọn lọc và thử nghiệm hóa
sinh để định danh. Quá trình này thường kéo dài từ bốn ngày cho trường hợp
âm tính và trên bảy ngày cho các trường hợp dương tính. Đây thật sự là một
trở ngại cho việc đánh giá chất lượng nói chung và phân tích vi khuẩn gây
bệnh trong sản phẩm thực phẩm vì thời gian chờ trả kết quả quá dài.
Trong những năm qua, nhiều phương pháp phát hiện Listeria
monocytogenes dựa trên nguyên tắc sinh học phân tử và miễn dịch học như
phương pháp lai phân tử, PCR, ELISA, … đã được triển khai. Trong đó nhiều
phương pháp đã được thiết kế theo hướng cho kết quả phân tích nhanh. Vì vậy
việc ứng dụng phương pháp phân tích nhanh vào kiểm nghiệm thực phẩm là
vấn đề được nhiều phòng thí nghiệm quan tâm. RAPID’L.mono là phương
pháp mới khắc phục được các nhược điểm của phương pháp truyền thống nhờ
khả năng phát hiện nhanh, dễ thực hiện, đọc kết quả phân tích dễ dàng, cho kết
quả cùng lúc về Listeria monocytogenes và các loài khác thuộc Listeria spp
trên cùng một đĩa môi trường chọn lọc. Vì những lý do đó chúng tôi tiến hành
nghiên cứu “ứng dụng phương pháp phân tích nhanh RAPID’L.mono để

11290-1:2004. Kết hợp kết quả thu được từ Mục 1 – 3 để đánh giá mức
độ tương đồng của phương pháp RAPID’L.mono so với phương pháp
chuẩn ISO 11290-1:2004.
1.4. Thời gian thực hiện đề tài
Tháng 01/2009 đến 05/2009
Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản

SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng
MSSV: 2052056
Trang 3
Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về Listeria monocytogenes
2.1.1. Phân loại học
Theo khóa phân loại của Bergey’s (tái bản lần thứ 7), giống Listeria
được xếp vào họ Corynebacteriaceae. Tuy nhiên theo nghiên cứu của
Stackebrandt và cộng sự (1983) về rRNA 16S, ông đã chứng minh rằng
Listeria monocytogenes hoàn toàn khác biệt trong nhánh Lactobacillus-
Bacillus thuộc cây phát sinh loại vi khuẩn do Woese xây dựng năm 1981. Năm
2001, Họ listeriaceae đã được tạo ra, bao gồm cả Staphylococcaceae,
Bacillaceae và các họ khác. Trong phạm vi cây phát sinh loại này có sáu loại
thuộc loại Listeria: L. monocytogenes, L. seeligeri, L. welshimeri, L. ivanovii
L.innocua và L. grayi. Loại L. grayi có hai loài phụ là L.grayigrayi và L.
grayimurrayi.
2.1.2. Hình thái học
Listeria monocytogenes là vi khuẩn hình que, gram dương, di động nhờ
tiêm mao, không sinh bào tử và đôi khi chúng tạo thành hình chuỗi ngắn. Khi
kiểm tra kính phết, vi khuẩn này có dạng hình cầu, vì vậy thường lầm tưởng
chúng là vi khuẩn Streptococci. Đôi khi xuất hiện những tế bào dài hơn có thể
trông giống corynebacteria. Ở nhiệt độ phòng (không lớn 37

NaCl(%)
cực đại
T
0
C tối
thiểu
T
0
C cực
đại
Nhu cầu oxy
0,92-0,95 4,6 9,6 8-12 0-2 45 Kỵ khí tùy nghi
2.1.3.2. Trong thực phẩm
Listeria monocytogenes có khả năng sống trong nhiều loại thực phẩm
đông lạnh, trong các sản phẩm chưa được gia nhiệt tốt, bề mặt sản phẩm đã bị
tách nước. Sự phát triển của chúng phụ thuộc nhiều vào các yếu tố như nhiệt
độ, pH và các loại thịt cũng như sự hiện diện của quần thể vi sinh vật.
2.1.4. Khả năng chịu đựng
Listeria monocytogenes là vi khuẩn gây bệnh ưa lạnh và có khả năng
phát triển ở nhiệt độ 2 - 8
0
C (nhiệt độ của tủ lạnh), pH tối thiểu là 4,6; chúng
có khả năng sống trong điều kiện kỵ khí, hiếu khí ngay cả môi trường hút chân
không hoặc có sự hiện diện của vi khuẩn lactic.
Loài vi khuẩn này cũng có khả năng sống từ 10 đến 30 ngày trong
nguồn nước công cộng ở nhiệt độ 28- 30
0
C và từ 7 đến 110 ngày ở nhiệt độ 5
đến 10
0

Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản

SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng
MSSV: 2052056
Trang 5
khí từ -26
0
C đến 9
0
C. Ở nước biển Listeria monocytogenes có thể sống đến 3
tuần hoặc lâu hơn nữa. Việc tồn tại trong nước biển thì tùy thuộc vào nhiệt độ
và chủng vi khuẩn này.
Trong môi trường chế biến thực phẩm với độ ẩm là 75% và ở 15
0
C, hỗn
hợp vi khuẩn Listeria monocytogenes và Flavobacteria spp. Có thể tồn tại hơn
75 ngày trên bề mặt thép không gỉ. Thời gian để giết chết 90% các tế bào này
là 18,5 ngày.
Vi khuẩn này có khả năng tồn tại trong các sản phẩm thủy sản xông
khói đóng gói chân không được bảo quản ở nhiệt độ từ 4 – 10
0
C, trong nhiều
trường hợp chúng còn gia tăng số lượng tế bào. Ví dụ: trong tôm, thịt cua,
surimi và cá được bảo quản ở nhiệt độ 7
0
C trong vòng 14 ngày, Listeria
monocytogenes gia tăng đến 10.000 tế bào trên một gam sản phẩm. (Nguồn:
Baron’s Medical Microbiology, Miscellaneous Pathogenic Bacteria (H Hof)).
Khả năng chịu nhiệt của Listeria monocytogenes cũng là một yếu tố khá

seeligeri thì rất hiếm khi xảy ra ở người.
Thuật ngữ bệnh do listeria (listeriosis) bao gồm nhiều triệu chứng bệnh
giống nhau ở người và động vật. Listeria monocytogenes gây bệnh ở người và
động vật; L.ivanovii chỉ gây bênh ở động vật, chủ yếu ở cừu. Bệnh viêm màng
não là hình thức bệnh thường gặp nhất ở động vật nhai lại. Ở những động vật
còn nhỏ, thường xuất hiện nhiễm trùng nội tạng hoặc nhiễm trùng máu. Nhiễm
trùng cổ tử cung ở bào thai qua đường nhau thường làm cừu và gia súc đẻ non.
Tác động thật sự bệnh do Listeria ở người đến nay vẫn còn chưa sáng
tỏa, vì bình thường đối với người trưởng thành khỏe mạnh, các bệnh truyền
nhiễm thường ít có triệu chứng hoặc có chăng chỉ là triệu chứng cảm nhẹ.
Biểu hiện lâm sàng dao động từ triệu chứng trông giống như là bệnh cảm cúm
nhẹ và/hoặc viêm não và màng não. Bệnh do Listeria hầu hết chỉ xuất hiện ở
phụ nữ mang thai, trẻ sơ sinh, người già và người suy giảm hệ miễm dịch,
nhưng đối với những người khỏe mạnh cũng có thể bị ảnh hưởng. Hình thức
bệnh nghiêm trọng thể hiện rõ ràng nhất là ở bệnh viêm màng não và thường
đi kèm theo nhiễm trùng máu. Tuy nhiên ở phụ nữ mang thai, mặc dù triệu
chứng thường xuất hiện là bệnh giống như cúm nhẹ không bị viêm màng não,
nhưng dễ có khả năng thai nhi bị bệnh và dẫn đến phải phá bỏ hoặc sinh non.
Ở người bệnh do listeria biểu hiện rõ ràng nhất là do L. monocytogenes
thường ít xảy ra, nhưng đã xuất hiện những đợt bùng phát thành dịch. Vào
năm 1981, xuất hiện đợt bùng phát liên quan đến 100 người ở Canada. Ba
phần tư những trường hợp bị nhiễm bệnh là phụ nữ mang thai, trong trường
hợp này có 9 thai nhi bị chết, 23 trẻ sơ sinh bị nhiễm trùng và 2 trẻ còn sống
khỏe mạnh. Trong số 77 người trưởng thành không mang bầu bị nhiễm khuẩn
đã biểu hiện bệnh do listeria một cách rõ ràng, tỷ lệ chết gần 30%. Nguồn
bùng phát là từ xà lách trộn được sản xuất tại một nhà máy tại địa phương.
Các biểu hiện bệnh do Listeria bao gồm nhiễm trùng máu, viêm màng
não, viêm não và nhiễm trùng tử cung hoặc cổ tử cung ở phụ nữ mang thai dẫn
đến khả năng xẩy thai hoặc phá bỏ thai nhi. Khởi đầu các biểu hiện này
thường xuất hiện các triệu chứng tương tự như các bệnh cúm bao gồm sốt kéo

· Khẳng định: cấy chuyển khuẩn lạc Listeria monocytogenes nghi ngờ
sang thạch không chọn lọc để làm thuần vi khuẩn và thực hiện các thử
nghiệm sinh lý, sinh hóa để định danh. Khẳng định là Listeria spp. bằng
các thử nghiệm Henry-illumination, catalase, nhuộm Gram, khả năng di
động phương pháp giọt treo. Sau khi các thử nghiệm trên đều nghiệm
đúng Listeria spp., kế tiếp khẳng định Listeria monocytogenes qua các
thử nghiệm bổ sung sau: khả năng tan huyết, khả năng biến dưỡng
đường, thử nghiệm CAMP, di động trong ống nghiệm tạo hình tán dù.

Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản

SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng
MSSV: 2052056
Trang 8
2.2.1.2. Sơ đồ quy trình phân tích theo ISO 11290-1:2004

(II) (I)

±
2giờ. Sau bước
tăng sinh lần 1 thực hiện hai quy trình (I), (II).
Ủ 25
0
C, 8-24 giờ (TSYEB)
Ủ 37
0
C, 24 giờ (TSYEA)
A.Tăng sinh lần 1
25 g mẫu + 225ml Half Fraser

B.Tăng sinh lần 2
0,1ml dịch tăng sinh lần 1
+ 10ml Fraser

C. Cấy ria trên ALOA +
Palcam hoặc Oxford

Đồng nhất (30-60 giây)
Ủ 30
0
C, 24 giờ
D. Đọc kết quả trên ALOA, Oxford
E. Chọn khuẩn lạc điển hình cấy sang
TSYEA, TSYEB

C. Cấy ria trên ALOA +
Palcam hoặc Oxford


F. Khẳng định

G. Đọc kết quả

G. Đọc kết quả

Hình 2.2.1.2: Sơ đồ phân tích Listeria monocytogenes theo ISO 11290-1:2004
Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản

SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng
MSSV: 2052056
Trang 9
B. Tăng sinh lần 2: Chuyển 0.1ml từ dịch tăng sinh lần 1 sang ống
nghiệm chứa 10ml môi trường Fraser để tăng sinh lần 2. Ủ ống nghiệm trong
tủ ủ ở 37
±
1
0
C trong 24 giờ.
C. Cấy ria trên ALOA, Oxford hoặc Palcam: Dùng que cấy kim loại
hoặc que cấy nhựa vô trùng cấy ria dịch mẫu tăng sinh lần 1 theo quy trình (I)
và dịch mẫu tăng sinh lần 2 theo quy trình (II) sang môi trường thạch ALOA
và Oxford hoặc Palcam sao cho khuẩn lạc mọc rời, ủ trong tủ ủ ở 37
±
1
0
C
trong 24 giờ.
D. Đọc kết quả trên ALOA, Oxford hoặc Palcam. Thường sau 24 giờ ủ

ánh sáng trắng có màu xanh óng ánh (xanh xám đến xanh).
- Thử nghiệm Catalase
+ Thực hiện: Lấy sinh khối ở tâm khuẩn lạc trên môi trường thạch dinh
dưỡng sau 18-24 giờ ủ. Chuyển sinh khối lên miếng lam. Nhỏ lên sinh khối
một giọt H
2
O
2
3% (dùng ống nhỏ giọt hoặc pipette Pasteur). Quan sát nhanh
sự hình thành bọt khí và ghi nhận kết quả. Bỏ miếng lam vào dung dịch khử
trùng.
+ Kết quả: Dương tính khi có hình thành bọt khí (O
2
). Âm tính khi
không có hình thành bọt khí.
- Nhuộm Gram (thử nghiệm KOH)
Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản

SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng
MSSV: 2052056
Trang 10

Thử nghiệm KOH dùng để phân biệt vi khuẩn gram dương và gram âm:
nhỏ 1-2 giọt KOH 3% lên lam kính, sau đó lấy khuẩn lạc đã được làm thuần từ
TSYEA trộn vào thuốc thử KOH trên lam. Sau khi trộn nếu gặp hiện tượng
đặc quánh kéo thành dây thì dùng khuyên cấy nhích lên là phản ứng dương
tính và ngược lại là phản ứng âm tính.
Vi khuẩn gram (-): thử nghiệm KOH dương tính
Vi khuẩn gram (+): thử nghiệm KOH âm tính

- Thử nghiệm sử sụng đường
Dùng que cấy vòng, lấy sinh khối từ môi trường TSYEB cấy lần lược
sang các ống nghiệm chứa khoảng 5ml dung dịch đường Xylose và sang các
ống nghiệm chứa khoảng 5ml dung dịch đường Rhamnose. Ủ các ống trong tủ
ủ ở 37
±
1
0
C trong 24 – 48 giờ.
Kết quả: Dương tính khi dung dịch đường có màu vàng. Âm tính khi
dung dịch đường không đổi màu. Listeria monocytogenes Xylose (-),
Rhamnose (+).
- Thử nghiệm CAMP
Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản

SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng
MSSV: 2052056
Trang 11

Cấy ria 2 đường chủng vi khuẩn S.aureus và Rhodococcus equi theo
các đường thẳng đứng song song, cách nhau 4 cm trên mặt thạch máu cừu. Sau
đó cấy ria thẳng góc ở giữa các chủng nghi ngờ Listeria monocytogenes đã
được làm thuần từ TSYEA lên thạch máu, gần như không chạm vào 2 đường
cấy S.aureus và Rhodococcus equi khoảng 1-2mm. Cấy đồng thời các chủng
chứng L.monogenes, L.innocua, L.ivanovi để kiểm tra trên cùng một đĩa. Ủ ở
37
0
C
±

- Hoạt động của một enzyme đặc hiệu cho phép dò tìm ra Listeria
monocytogenes, chất nền tạo sắc là phospholipase tạo khuẩn lạc có màu xanh.
Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản

SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng
MSSV: 2052056
Trang 12

- Sự lên men đường cho phép phân biệt các loài Listeria spp. Listeria
monocytogenes âm tính với phản ứng Xylose nên không tạo quầng sáng màu
vàng xung quanh khuẩn lạc.
2.2.2.2. Sơ đồ quy trình phân tích nhanh trên RAPID
’
L.mono theo
AOAC.
B. Phân lập trên RAPID
’
L.mono
Đồng nhất
30
0
C trong 24h
Hình 2.2.2: Sơ đồ quy trình phân tích nhanh trên RAPID
’
L.mono theo AOAC.
E. Đọc kết quả
37
0
C trong 24h
C. Đọc kết quả trên RAPID’L.mono
D. Chọn khuẩn lạc điển hình khẳng định bằng cách cấy
ria lên ALOA.
Ủ 37
0
C, 24 giờ
A. Tăng sinh
25g mẫu + 225ml Half Fraser
B. Phân lập trên RAPID
’
L.mono
Đồng nhất (30-60 giây)
Ủ 30
0
C, 24 giờ
Hình 2.2.2: Sơ đồ phân tích nhanh Listeria monocytogenes trên RAPID

- Acriflavine hydrochloride solution
c) Ammonium Iron (III) citrate (Merck,1.10399/1)
Cách pha chế môi trường Half Fraser (HF)
Cân 55gam Fraser Listeria Base Broth cho 1000ml nước cất. Khuấy
đảo cho môi trường tan đều. Sau đó hấp thanh trùng ở 121
0
C trong 15 phút.
Trong lúc chờ thanh trùng môi trường tiến hành tan rã thành phần của một lọ
nhỏ ammonium iron (III) citrate và một lọ nhỏ supplement selective trong 1ml
nước vô trùng, cho hai lọ nhỏ trên vào môi trường Fraser Listeria Base Broth
vừa thanh trùng sau khi đã được làm nguội dưới 50
0
C.
2.3.2. Môi trường Fraser Borth
Môi trường Fraser chứa các thành phần chọn lọc như ở tăng sinh lần 1
nhưng với hàm lượng cao hơn.
Thành phần môi trường: Half Fraser Broth cộng thêm một lọ nhỏ
Supplement selective (b)
2.3.3. Thạch ALOA
a) Listeria selective Agar Base acc OTTAVIANI and AGOSTI
Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản

SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng
MSSV: 2052056
Trang 14

Thành phần môi trường (gam/lít)
- Peptone from meat 18.0
- Peptone from Casein 6.0

cồn/nước = 1:1 vào Supplement 1 hòa tan.
A.L. Supplement 2 dạng trai lớn dung dịch chứa 20ml.
2.3.4. Thạch Oxford
a) Oxford Listeria selective Agar (base) (Merck,1.07004.0500)
Thành phần môi trường (gam/lít)
Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản

SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng
MSSV: 2052056
Trang 15

- Peptone 23.0
- Starch 1.0
- Sodium chloride 5.0
- Agar-agar 13.0
- Aesculin 1.0
- Ammonium-iron (III) citrate 0.5
- Lithium chloride 15.0
b) Oxford Listeria Selective Supplement (Merck, 1.07006)
Thành phần môi trường
- Cycloheximide
- Colistin sulfate
- Acriflavine hydrochloride
- Cefotetan
- Fosfomycin
- Ethanol
- Pha thạch Oxford
Cân 29,25 gam Oxford Listeria selective Agar (base) cho vào 500ml
nước cất, hòa tan sau đó đem thanh trùng ở 121

0,2. Sau đó hấp thanh trùng ở 121
0
C trong 15 phút, sau
thanh trùng làm nguội ở bể điều nhiệt (45-50
0
C). Đỗ đĩa. Chú ý đổ một
lớp thật mỏng để xem Henry illumination.
- TSYEB: Cân 30gam/lít Trytone soya broth, 6gam/lít Yeast extract,
1000ml nước. Hòa tan hỗn hộp trên. Chỉnh pH hỗn hợp dung dịch
7,3
±
0,2, sau đó tiến hành đỗ vào ống nghiệm khoảng 3ml/ống. Hấp
thanh trùng ở 121
0
C trong 15 phút.
2.3.6. Rhramnose, Xylose.
Môi trường sử dụng Purple Broth làm nền. Sau đó bổ sung đường
Rhramnose, Xylose.
a) Purple Broth Base (BBL
TM
, 211558)
Thành phần môi trường
- Pancreactic Digest of Gelatin 10.0gam
- Sodium chloride 5.0gam
- Bromcresol purple 0.02gam
b) Đường D(+)(-) Xylose (Merck, 1.08689.0100)
c) Đường L(+)- Rhramnose monohydrate (Merck, 1.07361.0025)
Cách Pha chế môi trường
Cân 15gam/lít Purple Broth Base thêm vào 1000ml nước cất, khuấy tan
dung dịch, chỉnh pH 6,8

2.3.8. Motility Agar
Thành phần môi trường
- Casein peptone
- Meat peptone
- Agar
- Nước
Pha môi trường Motility agar: Cân 22gam/lít motility agar, bổ sung
0.05gam TTC (2,3,5-Triphenyl Tetrazodium Chloride) chỉnh pH 7,3
±
0,2.
Làm tan dung dich bằng Microwave. Phân ống (5-7ml/ống). Sau đó hấp thanh
trùng ở nhiệt độ 121
0
C trong 15 phút.
2.3.9. Môi trường lỏng BHI (Brain Heart Infusion)
Cân 37gam/lít Brain Heart Infusion hòa tan chỉnh pH 7,4
±
0,2. Phân
ống (5ml/ống). Sau đó hấp thanh trùng ở 121
0
C trong 15 phút.
Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản

SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng
MSSV: 2052056
Trang 18

Phần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.1. Vật liệu

-Đĩa thạch RAPID’L.mono
3.1.3. Thiết bị và vật dụng
-Bể điều nhiệt 45,0
±
1,0
0
C
-Tủ ấm: 25,0
±
1,0
0
C, 30,0
±
1,0
0
C 37,0
±
1,0
0
C
-Thiết bị đồng nhất mẫu
- Kính hiển vi
Và một số vật dụng khác dùng trong phòng thí nghiệm vi sinh
Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản

SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng
MSSV: 2052056
Trang 19


A
3
A
4
A
5
A
6

A.
Tăng sinh trong BHI
Ủ 37
0
C, 8 giờ
C. Đọc kết quả trên RAPID’L.mono
D. Chọn khuẩn lạc điển hình khẳng định bằng cách cấy ria lên ALOA.
Ủ 37
0
C, 24 giờ
B. Phân lập trên RAPID
’
L.mono
E. Đọc kết quả
Ủ 37
0
C, 24 giờ
Hình 3.2.1: Sơ đồ thí nghiệm 1

bảo quản cẩn thận ở nhiệt độ 4
0
C có nhãn ghi đầy đủ các thông tin như: tên, ký
hiệu chủng, ngày, số lần cấy chuyển. Các ống môi trường lỏng BHI đã được
chuẩn bị sẵn, đánh ký hiệu lên các ống BHI tương ứng. Cấy chuyển từ ống
chủng vi sinh vật chuẩn sang các ống BHI. Ủ ở 37
0
C trong 8 giờ.
Cấy ria từng chủng vi sinh vật chuẩn trong ống BHI tương ứng lên từng
đĩa RAPID’L.mono tương ứng. Các bước sau thực hiện theo quy trình phân
tích nhanh định tính chỉ tiêu Listeria monocytogenes trên RAPID’L.mono như
mô tả ở Trang 12 Mục 2.2.2.3.
d) Phương pháp thu thập số liệu
Quan sát khuẩn lạc trên môi trường RAPID’L.monno ở các đĩa cấy các
vi sinh vật khác nhau. Có hình thành hay không hình thành khuẩn lạc, hình
dạng và màu sắc khuẩn lạc.
3.2.2. Thí nghiệm 2: Xác định độ nhạy của phương pháp phân tích định
tính chỉ tiêu Listeria monocytogenes trên RAPID’L.mono
a) Mục đích thí nghiệm
Xác định độ nhạy (giới hạn pháp hiện – LOD
50
) của phương pháp
thông qua phân tích dãy nồng độ pha loãng chủng Listeria monocytogenes để
tìm nồng độ thấp nhất mà phương pháp có khả năng phát hiện.
.
Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản

SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng
MSSV: 2052056

2
0 1,175% vào 99,5ml
dung dịch H
2
SO
4
1%. Sau đó, độ đục chuẩn này được chia thành các thể tích
nhỏ chuyển sang các ống nghiệm giống nhau. Các ống này được dùng để so
sánh dịch vi khuẩn. Trước khi sử dụng, lắc đều để dung dịch đồng nhất.
- Thực hiện dãy pha loãng nhị phân
So sánh độ đục của dịch khuẩn chuẩn có độ đục gần giống độ đục của
ống McFarland khi đó ống dung dịch khuẩn chuẩn có mật độ tế bào khoảng
10
8
tế bào/ml. Pha loãng dịch khuẩn đến mật độ từ 10-100 tế bào/ml. Từ dịch
pha loãng dự đoán có mật độ từ 10-100 tế bào/ml (xem đây là nồng độ 2
0
) pha
Dựa vào độ đục chuẩn McFarland để xác định hàm lượng tế
bào Listeria monocytogenes có từ 10-100 tế bào/ml
Pha loãng dịch tế bào có mật độ 10-100 thành dãy nhị phân
(2
0
, 2
-1
, 2
-2
, 2
-3
,….)

- Cho chủng vào mẫu
Tại mỗi nồng độ pha loãng 2
0
, 2
-1
, 2
-2
, 2
-3
, 2
-4
hút 1ml vào bao PE chứa
25gam mẫu trắng + 225ml dung dịch Half Fraser (lặp lại 10 lần), và 1ml vào
đĩa petri (hai đĩa petri), cho vào các đĩa petri 15-20ml PCA lắc đều và ủ ở
37
0
C trong 24 giờ, còn các bọc PE đã cho chủng ủ ở 30
0
C trong 24 giờ.
- Phân tích trên RAPID’L.mono.
Mỗi bao PE chứa 25 gam mẫu đã cho chủng được phân tích định tính chỉ
tiêu Listeria monocytogenes bằng phương pháp phân tích nhanh
RAPID’L.mono được mô tả ở Mục 2.2.2.3 Trang 12.
d) Thu thập số liệu
· Đếm số khuẩn lạc trên PCA
· Chọn tất cả các kết quả có cùng số lượng chủng cho vào thấp nhất mà
tại đó các kết quả đều dương tính.
· Chọn tất cả các kết quả có cùng số lượng chủng cho vào mà tại đó
>50% kết quả dương tính.
· Chọn tất cả các kết quả có cùng số lượng chủng cho vào mà tại đó các

i
– 0.5)= m

Với độ tin cậy 95% LOD
50
nằm trong khoảng
(10
m-2SQRT(U
m
)
; 10
m-2SQRT(U
m
)
)Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản

SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng
MSSV: 2052056
Trang 23

Trong đó
· LOD
50
: giới hạn phát hiện của phương pháp mà tại đó 50% phép thử
cho kết quả dương tính.
· U

A. Tăng sinh
25g mẫu + 225ml Half Fraser

Đồng nhất, gây nhiễm
Ủ 30
0
C trong 24 giờ
C. Đọc kết quả trên RAPID’L.mono
D. Chọn khuẩn lạc điển hình khẳng định bằng cách cấy
ria lên ALOA.
Ủ 37
0
C trong 24 giờ
B. Phân lập trên RAPID
’
L.mono
E. Đọc kết quả
Ủ 37


SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng
MSSV: 2052056
Trang 25
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần trên mẫu cá tra phi lê đông lạnh.
Phân tích song song mẫu bằng hai phương pháp định tính chỉ tiêu
Listeria monocytogenes trên RAPID’L.mono và theo ISO 11290-1:2004.
c) Thu thập số liệu
· Tổng hợp kết quả từ thí nghiệm 1, 2, 3.


C. Cấy ria trên ALOA +
Palcam hoặc Oxford

37
0
C,48 giờ
37
0
C, 48 giờ
37
0
C, 48 giờ
25
0
C, 8-24 giờ (TSYEB)
37
0
C, 24 giờ (TSYEA)
F. Khẳng định:
- Henry illumination
- Catalase
- Gram
- Tan huyết
- Khả năng sử dụng đường
Xylose, Rhamnose
- Thử nghiệm CAMP
- Di động