TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT
F 7 G

GIÁO TRÌNH
CÔNG NGHỆ SINH HỌC
THỰC VẬT
GS.TS. MAI XUÂN LƯƠNG

2005

3. Các muối khoáng vi lượng. 19 -
4.Các vitamin 19 -
5. Các chất kích thích sinh trưởng (phytohormone). 20 -
6. Các chất hữu cơ khác 21 -
7. Chuẩn bò các dung dòch đậm đặc và dung dòch làm việc. 21 -
8. Vấn đề lựa chọn môi trường 23 -
III. CHỌN VÀ XỬ LÝ MÔ CẤY 23 -
IV. PHÒNG THÍ NGHIỆM NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT. 24 -
1.Cách bố trí phòng thí nghiệm nuôi cấy mô 24 -
2. Các thiết bò chủ yếu của phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật. 24 -
CHƯƠNg III. CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ 26 -
I. NUÔI CẤY ĐỈNH SINH TRƯỞNG 26 -
1/ Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cây khoai tây 27 -
2/ Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cây đòa lan 29 -
II. NHÂN GIỐNG BẰNG CON ĐƯỜNG PHÁT SINH PHÔI VÔ TÍNH 32 -
III. NHÂN GIỐNG BẰNG CÁCH TẠO MÔ SẸO (CALLUS) 34 -
IV. NHÂN GIỐNG BẰNG NUÔI CẤY LÁT MỎNG 36 -
GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
Công nghệ Sinh học thực vật
-
2 -
V. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT VI GHÉP TRONG NHÂN GIỐNG. 38 -
VI. NUÔI CẤY TÚI PHẤN 41 -
1.Chọn vật liệu khởi nguyên 41 -
2.Tạo các tổ hợp gen mới bằng phương pháp lai hữu tính. 41 -
3.Nuôi cấy túi phấn cây lai. 42 -
VII. NUÔI CẤY VÀ DUNG HP PROTOPLAST Ở THỰC VẬT 45 -
1. Tách và nuôi cấy protoplast thực vật. 46 -
2. Dung hợp protoplast 48 -
VIII. CHUYỂN GEN THỰC VẬT 51 -

VIII. GHÉP CÀNH 74 - GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
Công nghệ Sinh học thực vật
-
3 -PHẦN I. NHÂN GIỐNG IN VITRO

MỞ ĐẦU
Giống là một khâu rất quan trọng trong sản xuất nông nghiệp. Công tác
giống chủ yếu bao gồm các khâu thu thập nguồn gen, bảo quản quỹ gen, lai tạo,
tuyển chọn, thử nghiệm giống và nhân giống.
Nhờ phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật nên ngày nay phần lớn các
công việc này được thực hiện một cách khá thuận lợi và nhanh chóng.
Sự hình thành và phát triển của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật là
kết quả của những phát hiện sau đây trong lónh vực sinh lý thực vật và di truyền học
phân tử:
1. Tính toàn thể (potipotency) của mô và tế bào thực vật cho phép tái sinh
được cây hoàn chỉnh từ mô, thậm chí từ một tế bào nuôi tách rời;
2. Khả năng tạo các cây đơn bội qua nuôi cấy túi phấn, từ đó tạo các dòng
đồng hợp tử tuyệt đối và nhờ đó rút ngắn được chu trình lai tạo;
3. Khả năng hấp thu ADN ngoại lai vào tế bào thực vật và khả năng
chuyển gen để gây biến đổi (transformation) ở thực vật do ADN ngoại lai nhờ công
nghệ gen (genetic engineering);

CHƯƠNG I. NHỮNG NGUYÊN TẮC CỦA NUÔI CẤY MÔ
TRONG CÔNG TÁC VI NHÂN GIỐNG

I. GIỚI THIỆU CHUNG.
Khả năng kiến lập và duy trì các cơ quan và các mô thực vật (phôi, đỉnh sinh
trưởng, rễ, hoa tế bào, callus, tế bào trần) trong nhân giống vô trùng để tái sinh
những cây mới từ chúng là kết quả của những nghiên cứu cơ bản và nghiên cứu ứng
dụng trong các phòng thí nghiệm thực vật học, bệnh học và di truyền học từ cuối
thế kỷ 19. Công việc này được gọi chung là nuôi cấy mô và cơ quan, nuôi cấy trong
ống nghiệm, vi nhân giống và thuật ngữ mới nhất là công nghệ sinh học.
Các quy trình chính của công nghệ sinh học bao gồm tái sinh chồi, tái sinh
cây con, tạo callus và tạo phôi vô tính.
Vi nhân giống khác với phương pháp nhân giống truyền thống ở chỗ quá trình
được chia thành nhiều giai đoạn để có thể kiểm mỗi khía cạnh của quá trình tái
sinh và phát triển cây con. Mỗi bước của trật tự công việc có thể được thao tác
(hoặc lập chương trình) bằng cách chọn mẫu cấy và kiểm tra môi trường nhân
giống. Nhìn sâu vào các cơ chế sinh học của mỗi quá trình vi nhân giống sẽ có thể
tìm thấy khả năng ứng dụng nó trong phương pháp nhân giốngcây con phục vụ sản
xuất đại trà.
Trong chương này sẽ mô tả các công việc đã nêu và xác đònh các cơ sở hình
thái, sinh lý và di truyền của quá trình sinh trưởng và phát triển của cây trong nuôi
cấy mô.
Trước hết hãy cùng nhau nắm vững ý nghóa của một số thuật ngữ quan trọng.
• Nuôi cấy mô. Thuật ngữ này dùng cho một trật tự các thao tác dùng để
duy trì và sinh trưởng của các mô thực vật (tạo callus, tế bào, tế bào trần), của các
cơ quan trong nuôi cấy vô trùng. Kỹ thuật này dùng để nhân giống, cải biến
genotype (tức tạo giống mới), sản xuất sinh khối chứa các sản phẩm hóa sinh học,
nghiên cứu bệnh học thực vật, bảo quản phôi và các nghiên cứu khoa học. Tất cả
các thao tác này đều được gọi chung là công nghệ sinh học.
• Vi nhân giống. Thuật ngữ dùng để ám chỉ công việc nhân giống thực vật

vô trùng. Công dụng chủ yếu của kỹ thuật này là “cứu” các phôi không thể nẩy
mầm bên trong hạt trước khi quả chín. Rất nhiều cây lai giữa các loài bước đầu
được nhân giống bằng phương pháp này rất có kết quả nhưng đôi khi phôi bò hỏng
trong quá trình phát triển (hiện tượng bất thụ của phôi vô tính). Những dòng chín
sớm của nhiều loại cây ăn quả có xu hướng cho quả chín trước khi phôi của chúng
phát triển đầy đủ. Trong điều kiện tự nhiên những phôi này dễ bò hỏng nhưng nếu
tách chúng và nuôi chúng trong môi trường nuôi cấy thích hợp thì có thể làm cho
chúng nẩy mầm.
Ứng dụng thứ hai của nuôi cấy phôi là kích thích nẩy mầm những hạt chín
đang ngủ để rút ngắn chu trình nhân giống.
3. Nuôi cấy tế bào trứng.
Hệ thống này bao gồm nuôi cấy vô trùng trứng tách rời, noãn (đã thụ phấn
hoặc chưa thụ phấn), và thực giá noãn gắn bên trong tế bào trứng. Mặc dù kỹ thuật
này đã được sử dụng lần đầu tiên để nghiên cứu các vấn đề về cây ăn quả và sự
phát triển của hạt, quy trình thích hợp đã được sử dụng trong nhân giống, đặc biệt
là trong việc làm hoàn thiện bộ gen.
Tế bào trứng chưa thụ tinh được tách và cấy trong môi trường dinh dưỡng
cùng với phấn hoa và sau đó cho thụ phấn trong ống nghiệm. Quy trình này đã
được sử dụng rất có hiệu quả đối với những cây có nhiều loại tế bào trứng. Phấn
hoa có thể đặt trực tiếp vào thực giá noãn để ống phấn có thể phát triển trực tiếp
vào tế bào trứng.
GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
Công nghệ Sinh học thực vật
-
7 -
Tế bào trứng nuôi cấy rất có hiệu quả trong việc cứu phôi khi còn rất non nếu
như chúng chưa bò tách khỏi cây mẹ. Đây là kỹ thuật đơn giản hơn nhiều so với
nuôi cấy phôi. Các tế bào trứng có thể được khử trùng dễ dàng hơn và nói chung có
thể sinh trưởng dễ dàng trong môi trường cơ bản có chứa muối khoáng, đường và
đôi khi cần thêm một số phytohormone.

thông tin về những giống cây đó trong các tài liệu đã xuất bản.
Nói chung, những thực vật dễ nhân giống bằng các biện pháp thông thường
thì cũng đễ thực hiện vi nhân giống. Ví dụ các loại thảo mộc vừa dễ nhân giống
thông thường vừa dễ thực hiện vi nhân giống. Trong khi đó các loại cây gỗ thì khó
GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
Công nghệ Sinh học thực vật
-
8 -
tái sinh hơn nhiều và đễ nhân giống chúng cần phải tìm được các phương pháp
thích hợp.
Thành công trong vi nhân giống các loài cây gỗ rất phụ thuộc vào đặc điểm
của cây non dùng để nhân giống. Vi nhân giống cây con mọc từ hạt dễ hơn nhiều
so với những cây đã trưởng thành, và các chủng khác nhau của cùng một loài cây
trồng thường có các yêu cầu đặc trưng riêng trong vi nhân giống. Nói chung, yếu tố
hạn chế trong vi nhân giống là sự hình thành rễ chứ không phải là tăng sinh trưởng
bộ rễ đã hình thành. Các thao tác nhằm thu nhận những cây giống trẻ hóa bao gồm
sự lựa chọn những bộ phận còn trẻ của phần gốc cây con sinh ra từ hạt để tạo ra
chồi bất đònh và phối hợp bằng cách ghép những chồi bất đònh này với cây con sinh
trưởng từ hạt.
Mục đích của vi nhân giống là tạo được cây giống trẻ hóa có đầy đủ khả năng
ra rễ. Sự tiến bộ về khả năng ra rễ và song song với nó là những biến đổi về sức
khỏe và hình thái của cây con đã được ghi nhận ở một số loài cây gỗ.
2/ Khử trùng mẫu cấy. Các yếu tố gây nhiễm trong vi nhân giống bao gồm:
a/ Nhiễm nấm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn trên bề mặt mẫu cấy;
b/ Nhiễm virus và các cơ thể tương tự virus;
c/ Các nguồn bệnh bên trong.
Trong một số trường hợp các yếu tố gây nhiễm không chỉ làm ức chế sinh
trưởng và sự ra rễ của cây con thu nhận được trong vi nhân giống mà còn duy trì
tác dụng ức chế này sau khi trồng cây con thu nhận được ra vườn ươm.
Các yếu tố gây nhiễm hầu như có mặt khắp mọi nơi. Để diệt trừ chúng thường

cây gỗ đòi hỏi nhiều lần cấy hơn, thậm chí rất khó đạt được tính ổn đònh. Sự khó
khăn trong việc làm ổn đònh mẫu cấy thường gằn liền với trạng thái sinh trưởng
của mẫu cấy: mẫu cấy còn non dễ được ổn đònh hơn. Mùa vụ sinh trưởng của mẫu
cấy cũng liên quan với sự ổn đònh này.
2.Giai đoạn 2: nhân giống.
Mục đích của giai đoạn 2 là duy trì việc vi nhân giống ở trạng thái ổn đònh và
nhân được nhiều cây con theo yêu cầu. Môi trường cơ bản của giai đoạn 2 cũng
giống như giai đoạn 1.Tốc độ vi nhân giống nhanh chóng sản phẩm thương mại có
thể đòi hỏi sự tối ưu hóa không những các nguyên tố vô cơ mà cả các yếu tố khác
của môi trường. Điều. này có thể thực hiện được bằng cách thử một cách hệ thống
các nồng độ khác nhau của các nguyên tố sử dụng trong sự phối hợp với các yếu tố
khác.
Các chất điều hòa sinh trưởng được dùng để duy trì mức độ sinh trưởng cơ bản
cũng như phản ứng phát triển của cây nhân giống. Cytokinin ở một số nồng độ có
tác dụng khá mạnh trong việc kích thích tạo chồi. Nói chung, nồng độ tối thiểu của
cytokinin kích thích tạo chồi được lựa chọn trong quá trình nhân giống. Nồng độ
cao của cytokinin vẫn kích thích tạo chồi nhưng có thể ức chế quá trình sinh trưởng
của chồi theo chiều dài. Vì vậy, xác đònh chính xác nồng độ cytokinin là rất cần
thiết. Auxin thường được dùng với nồng độ thấp hoặc không được sử dụng ở giai
đoạn 2.
Tỉ lệ nhân giống là số cây thu được trong một lần vi nhân giống. Nói chung, tỉ
lệ nhân giống từ chối bất đònh lớn hơn so với từ chồi nách. Tuy nhiên, tỉ lệ nhân
giống từ một số loại chồi đặc biệt thường có thể cao hơn chồi bất đònh. Vì vậy, tỉ lệ
nhân giống cao nhất không nhất thiết phải là đáng ao ước nhất để duy trì chất
lượng của cây con thu được.Tần số nhân giống có thể kéo dài từ hai đến tám tuần.
Kỹ thuật cấy chuyền cần được tối ưu hoá đối với từng loại cây trồng, bao gồm
kích thước và tính mùa vụ của mẫu cấy, phương pháp cắt và hướng đặt mẫu cấy
lên môi trường.
3.Giai đoạn 3: hình thành rễ.
Chức năng của giai đoạn này là tạo rễ cho mẫu cấy chuyền để sau đó mang

những cây tạo rễ trong ống nghiệm có thể bò chết, trong khi những cây tạo rễ ngoài
ống nghiệm dễ thích nghi với điều kiện môi trường hơ và có tỉ lệ sống sót cao.
Một khía cạnh tốt của nhân giống trong ống nghiệm là nhiều loại thực vật
thông thường khó ra rễ bằng cách giâm cành ngoài ống nghiệm lại có thể ra rễ khi
tiến hành vi nghân giống trong ống nghiệm. Điều này chủ yếu liên quan với trạng
thái trưởng thành của cây dùng làm mẫu cấy, bới vì những mẫu cấy lấy từ khu vực
còn non của cây thường dễ nhân giống hơn.
4.Giai đoạn 4. Làm cho các cây tái sinh thích nghi khí hậu.
Giai đoạn này bao gồm sự di chuyển từ đặc điểm dò dưỡng (cần cung cấp
đường) sang đặc điểm tự dưỡng (có khả năng quang hợp) và sự thích nghi của cây
con mới tái sinh với môi trường ngoài ống nghiệm. Giữ cho số cây con này tiếp tục
sinh trưởng là rất quan trọng vì sự thích nghi với khí hậu và phát triển trong điều
kiện tự dưỡng rất phụ thuộc vào khả năng sinh trưởng tiếp tục của cây con từ sau
khi đưa chúng ra khỏi ống nghiệm. Những cây con tái sinh trong ống nghiệm cần
phải giữ trong điều kiện có độ ẩm cao để thích nghi dần với điều kiện môi trường,
đặc biệt là làm cho chúng tránh bò mất nước.
GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
Công nghệ Sinh học thực vật
-
11 -
Những chồi con hình thành trong quá trình vi nhân giống có hình thái lá khá
đặc biệt. Kích thước lá và số lớp tế bào tạo ra lá thấp hơn đáng kể so với những là
hình thành sau khi chuyển cây con ra vườn ươm. Do độ ẩm cao trong ống nghiệm
trên lá không phát triển lớp sáp bảo vệ với số lượng và chất lượng cần thiết. Kết
quả là những lá hình thành trong vi nhân giống bò khô rất nhanh sau khi được rút ra
khỏi ống nghiệm.
Xử lý để thúc đẩy tốc độ thích nghi với khí hậu.
Trước khi đưa cây ra khỏi ống nghiệm:
a/ Làm giảm độâ ẩm (khoảng 35%) của môi trường trong ống nghiệm trước khi
đưa cây con ra ngoài. Công việc này có thể được thực hiện bằng cách đặt chất hút

6
và vitamin PP.
Sau khi Went và Thimann pháp hiện chất kích thích sinh trưởng thực vật đầu
tiên là IAA, năm 1939 Gautheret đã sử dụng thành công chất này và các vitamin
GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
Công nghệ Sinh học thực vật
-
12 -
nhóm B nói trên để kích thích sinh trưởng mô sẹo của cây cà rốt và duy trì sinh
trưởng của mô sẹo này trong thời gian vô hạn trên môi trường thạch.
Năm 1941 Overbeck chứng minh tác dụng kích thích sinh trưởng của nước
dừa trong nuôi cấy phôi cây họ cà (Dacura); và sau đó, năm 1948, Steward xác
nhận tác dụng của nước dừa trên mô sẹo cà rốt. Trong thời gian này cùng với IAA
một số auxin khác đã được phát hiện và tổng hợp thành công, như NAA và 2,4D.
Nhiều tác giả nhận thấy cùng với nước dừa 2,4D và NAA đã giúp tạo mô sẹo và
phân chia tế bào ở nhiều thực vật rất khó nuôi cấy.
Năm 1954 Skook phát hiện một loại phytohormone đầu tiên thuộc nhóm
cytokinin là 6-furfuryllaminopurin (kinetin) từ dòch thủy phân ADN và tác dụng
kích thích sinh trưởng của nó đối với mô thân cây thuốc lá.
Việc phát hiện vai trò của IAA, NAA, 2,4D, và kinnetin cùng với phát hiện
vai trò của nước dừa và vitamin là những bước tiến rất quan trọng trong quá trình
phát triển của nuôi cấy mô tế bào thực vật. Đó là tiền đề kỹ thuật cho việc xây
dựng các môi trường nuôi cấy ổn đònh về mặt hóa học để thực hiện các thí nghiệm
và nghiên cứu khác nhau, dẫn đến sự phát triển nhanh chóng của kỹ thuật nuôi cấy
mô trong giai đoạn tiếp theo.
Đặc biệt quan trọng là phát hiện của Skoog và Miller năm 1957 về ảnh hưởng
của tỉ lệ cytokinin/auxin trong môi trường nuôi cấy đối với sự hình thành cơ quan
của mô sẹo thuốc lá. Khi tỉ lệ này thấp mô sẹo có khuynh hướng phát triển rễ;
ngược lại, khi tỉ lệ này cao thì mô sẹo có khuynh hướng tạo chồi. Hiện tượng này
được xác nhận ở nhiều cây khác nhau và đóng góp rất lớn vào việc điều khiển sinh

công cụ không thay thế được để nghiên cứu hiện tượng nhiễm sắc thể hòa hợp của
các tế bào khác loài sau khi dung hợp và vai trò của ADN trong các cơ quan tử và
quan hệ của chúng với ADN của nhân tế bào.
- Thành công trong công nghệ chuyển gen từ những năm 1980-1982. Người ta
sử dụng các plasmid, tức các phân tử ADN vòng thường có trong các tế bào vi
khuẩn để chuyển tải các gen từ protoplast này đến protoplast khác. Bằng cách đó
người ta đã đưa được các gen ngoại lai vào tế bào thực vật. Tiếp sau đó người ta
còn sử dụng các biện pháp khác để chuyển gen trong nuôi cấy protoplast như kỹ
thuật sử dụng thiết bò xung điện (electroprorator), kỹ thuật vi tiêm (
microinjection), kỹ thuật siêu âm (ultrasonic gen transfer), kỹ thuật bắn gen (gene
gun)
- Thành công trong công tác nhân giống và phục tráng giống bằng phương
pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Ngay từ 1969 Morel đã nhận thấy đỉnh sinh trưởng
của các loài đòa lan (Cymbidium) khi đem nuôi cấy sẽ hình thành các protocorm.
Khi chia cắt những protocorm này để tiếp tục nuôi cấy sẽ hình thành những
protocorm mới. Khi để trong những điều kiện nhất đònh, những protocorm này sẽ
tái sinh thành những cây hoàn chỉnh. Hơn nữa, các tế bào ở đỉnh sinh trưởng của
thực vật chứa rất ít hoặc hoàn toàn không chứa virus, do đó, với phương pháp nuôi
cấy đỉnh sinh trưởng Morel có thể phục tráng, tạo các dòng vô tính không bò nhiễm
virus.
Việc ứng dụng nuôi cấy mô thực vật trong nhân giống được Nozeran nâng lên
một mức mới khi ông nhận thấy sự hóa trẻ của các chồi nách cây nho và cây khoai
tây đem nuôi cấy và cấy chuyền nhiều lần trong ống nghiệm.
Việc ứng dụng nuôi cấy mô trong nhân giống và phục tráng giống ngày nay
không còn hạn chế ở một vài loại cây mà đã được thực hiện ở quy mô thương mại
đối với hàng loạt cây trồng có ý nghóa kinh tế như chuối, cà phê, cọ dầu, sắn, khoai
lang, khoai tây, mía, cây ăn quả có múi v.v và đã có những đóng góp to lớn cho
nông nghiệp thế giới.
Ngày nay chúng ta đang bước vào giai đoạn phát triển thứ tư của nuôi cấy mô
tế bào thực vật. Đó là giai đoạn nuôi cấy mô thực vật được ứng dụng mạnh mẽ vào

GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
Công nghệ Sinh học thực vật
-
15 -
CHƯƠNG II. PHÒNG THÍ NGHIỆM NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO
THỰC VẬT.

Ở các cơ sở nghiên cứu và sản xuất có sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô khác
nhau tùy thuộc vào hoàn cảnh thực tế người ta có thể xây dựng các phòng thí
nghiệm với các trang thiết bò với mức độ hiện đại khác nhau. Tuy nhiên, tất cả các
phòng thí nghiệm này đều phải đảm bảo được ba yêu cầu sau đây:
- Bảo đảm điều kiện vô trùng;
- Chọn đúng môi trường và chuẩn bò môi trường đúng cách;
- Chọn mô cấy thích hợp, xử lý mô cấy thích hợp trước và sau khi cấy.
I. BẢO ĐẢM ĐIỀU KIỆN VÔ TRÙNG.
1. Ý nghóa cuả vô trùng trong nuôi cấy mô thực vật.
Môi trường nuôi cấy mô thực vật rất thích hợp cho nấm và vi khuẩn phát
triển. Do tốc độ sinh trưởng của nấm và vi khuẩn rất nhanh so với tế bào thực vật,
nên nếu trong thời gian nuôi cấy chỉ nhiễm một vài bào tử nấm hoặc vài vi khuẩn
thì chỉ sau vài ngày hoặc vài tuần toàn bộ bề mặt của môi trường nuôi cấy mô sẽ bò
nấm hoặc vi khuẩn phủ đầy, làm cho mẫu mô cấy không thể tiếp tục sinh trưởng và
chết dần.
Thông thường một chu kỳ nuôi cấy mô thực vật kéo dài từ 1 đến 5 tháng, khác
với thí nghiệm vi sinh vật, có thể kết thúc trong vài ngày. Như vậy, mức độ vô
trùng trong thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật đòi hỏi rất nghiêm khắc.
2. Nguồn nhiễm tạp.
Có ba nguồn nhiễm tạp chính là:

C. Sau khi vô trùng cần phải làm
khô nút bông hoặc nắp đậy. Các dung dòch mẹ dùng để pha môi trường (như dung
dòch muối khoáng, vitamin, phytohormone v.v không nên pha nhiều (100-200ml)
và cần được bảo quản trong ngăn đá của tủ lạnh. Đối với các chất không chòu nhiệt,
có thể bò phân hủy ở nhiệt độ 120
o
C cần tiến hành lọc vô trùng (ví dụ lọc qua phễu
lọc thủy tinh số 5 hay qua các loại màng lọc vô trùng) trước khi được đưa vào môi
trường đã hấp vô trùng.
4. Vô trùng mô cấy.
Mô cấy có thể là tất cả các bộ phận khác nhau của thực vật. Tùy theo sự tiếp
xúc với môi trường, các bộ phận này đều chứa nhiều hay ít vi khuẩn và nấm. Đòng
lúa non khi còn trong bẹ hay mô thòt quả thường ít nhiễm vi sinh vật, ngược lại, lá,
thân, đặc biệt là rễ do nằm trong đất nên có độ nhiễm vi sinh vật rất cao. Vì vậy
đối với các loại mô cấy khác nhau người ta khử trùng bằng các phương pháp khác
nhau.
Phương pháp vô trùng mô cấy thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hóa
học có hoạt tính diệt nấm diệt khuẩn. Hiệu lực diệt nấm, khuẩn của các chất này
phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng vào các
kẽ ngách lồi lõm trên bề mặt mô cấy, khả năng đẩy hết các bọt khí bám trên bề
mặt mô cấy. Để tăng tính linh động và khả năng xâm nhập của chất diệt khuẩn,
thông thường người ta xử lý mô cấy trong vòng 30 giây trong rượu ethylic 70%, sau
đó mới xử lý dung dòch diệt khuẩn. Đồng thời, người ta thêm các chất giảm sức
căng bề mặt như Tween 80, fotoflo, teepol vào dung dòch diệt nấm khuẩn.
Các chất diệt nấm khuẩn thường dùng và cho kết quả rất tốt là calcium
hypochloride 9-10% xử lý trong thời gian 5-30 phút, natrium hypochloride 9-10%
xử lý trong thời gian 5-30 phút và nước brôm 1-2% xử lý từ 2-10 phút. Ngoài ra,
hydro peroxide 10-12% xử lý trong 5-10 phút và chlorua thủy ngân 0,1-1,0% xử lý
trong 2-10 phút cũng cho kết quả tốt đối với từng loại mô cấy.
Trong thời gian xử lý mô cấy phải ngập hoàn toàn trong dung dòch diệt khuẩn.

Trước khi cấy, người cấy cần lau tay kỹ đến khuỷu tay bằng cồn 90%. Để
đảm bảo mức độ vô trùng cao, trong phòng cấy cần có một đèn tử ngoại 40W treo
trên trần. Chỉ bật sáng đèn này khi không có người trong phòng cấy. Cần giảm sự
chuyển động không khí ở trong buồng cấy đến mức tối thiểu, vì vậy cần tránh ra
vào buồng cấy nhiều lần.
Để tránh sự ngột ngạt trong buồng cấy, có thể quạt không khí qua các lớp
bông thủy tinh ngăn bụi với tốc độ nhỏ vào buồng cấy.
Tủ cấy: Trong một số trường hợp người ta sử dụng các tủ cấy đóng bằng gỗ
hoặc ghép bằng kính. Tuy nhiên, ngày nay các loại tủ cấy vô trùng lamine
(laminar-aie-flow cabinet) được dùng khá phổ biến. Đó là loại tủ cấy có thiết bò
thổi không khí đã lọc vô trùng vào chỗ thao tác cấy. Nhờ có hệ thống màng lọc, tủ
cấy lamine loại trừ một cách có hiệu quả nguồn nhiễm tạp từ bên ngoài và tạo điều
kiện thoải mái cho người cấy.
II. CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG.
Thành phần môi trường nuôi cấy mô thực vật thay đổi tuỳ thuộc loài, bộ phận
nuôi cấy, mục đích nuôi cấy và nhiều yếu tố khác. Tuy vậy, tất cả các môi trường
nuôi cấy bao giờ cũng gồm 3 thành phần:
- Đường làm nguồn carbon,
- Các muối khoáng đa lượng,
- Các muối khoáng vi lượng
- Các vitamin,
GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
Công nghệ Sinh học thực vật
-
18 -
- Các phytohormone.
Ngoài ra, người ta còn thường thêm vào môi trường nuôi cấy một số chất hữu
cơ thành phần hóa học xác đònh (aminoacid, EDTA ) hoặc không xác đònh (nước
dừa, nước chiết nấm men )
1. Đường.

3
). Amôn cung cấp dưới
dạng muối amôn sulphat (NH
4
)
2
SO
4
hoặc amôn nitrat NH
4
NO
3
. Trong một số ít
trường hợp có thể được cung cấp ở dạng urê. Tổng nồng độ của NO
3
-
và NH
4
+
trong
môi trường thay đổi từ 3 đến 6mM, thông thường khoảng 2mM.
Nguồn phospho: Hai dạng phospho thường dùng nhất là NaH
2
PO
4
.7H
2
O và
KH
2

O. Nồng độ Ca
2+
trong
môi trường tứ 1,0 đến 3,5mM, trung bình là 2,0mM.
Nguồn magiê: Magiê được cung cấp dưới dạng magiê sunphat MgSO
4
.7H
2
O,
với nồng độ trong môi trường khoảng 0,5 – 3,0mM.
GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
Công nghệ Sinh học thực vật
-
19 -
Nguồn sắt: Những môi trường cổ điển dùng sắt ở dạng chlorua sắt
FeCl
2
.FeCl
3
.6H2O, sulphat sắt FeSO
4
.7H
2
O, Fe
2
(SO
4
)
3
, citrat sắt Fe(C

Iốt (I)
MnSO
4
.4H
2
O
H
3
BO
3
ZnSO
4
.7H
2
O
CuSO
4
.5H
2
O
(NH
4
)
6
Mo
7
O
24
.4H
2

)
Panthotenat canxi
100
0,5 – 1,0
0,05 – 0,5
10 - 50
1 – 5
GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
Công nghệ Sinh học thực vật
-
20 -
Riboflavine (vitamin B
2
)
Biotin
Acid folic
1 – 5
0,1 – 1,0
0,1 – 1,0
Các vitamin thường dùng được pha trong hỗn hợp các dung dòch mẹ có nồng
độ cao gấp 500 hoặc 1000 lần dung dòch làm việc và được bảo quản ở nhiệt độ dưới
0
o
C. Nên chia sẵn dung dòch mẹ vitamin ra nhiều lọ nhỏ, mỗi lọ đủ dùng cho một
hoặc vài lít môi trường và bảo quản trong ngăn đá tủ lạnh.
5. Các chất kích thích sinh trưởng (phytohormone).
Các phytohormone thường dùng trong nuôi cấy mô được trình bày trong bảng
3.
Tên phytohormone Nồng độ sử dụng (mg/l)
2,4D (Dichlorophenoxyacetic acid

Cần chú ý, phytohormone có thể tác động lên mô nuôi cấy ở nồng độ rất thấp,
vì vậy cần dùng pipet riêng cho từng loại phytohormone và chú ý rửa cẩn thận các
dụng cụ thủy tinh đã dùng để đựng và pha chế các phytohormone ở nồng độ cao.
Trừ IAA và GA, các phytohormone còn lại được coi là bền vững trong quá
trình hấp vô trùng.
GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
Công nghệ Sinh học thực vật
-
21 -
6. Các chất hữu cơ khác.
Nước dừa: chất có hoạt tính trong nước dừa đã được chứng minh là myo-
inozitol và một số aminoacid. Lượng nước dừa dùng trong môi trường nuôi cấy
thường khá lớn, từ 15 đến 20% thể tích môi trường.
Lấy nước dừa ở trái dừa già, lọc trong và bảo quản trong lạnh sâu cho đến khi
dùng. Thời gian bảo quản không quá vài tháng, tốt nhất là sử dụng tươi.
Nước chiết nấm men: là các chế phẩm thường dùng trong nuôi cấy vi sinh vật,
mô tế bào động vật, đã được tiêu chuẩn hóa và bán dưới dạng thương phẩm. Thành
phần hóa học không rõ, trừ một số aminoacid. Lượng thường dùng là 1 gam cho 1
lít môi trường.
7. Chuẩn bò các dung dòch đậm đặc và dung dòch làm việc.
Để thuận tiện cho việc pha các môi trường nuôi cấy (môi trường làm việc)
người ta pha trước các dung dòch đậm đặc, sau đó chỉ cần pha loãng khi sử dụng.
Các dung dòch đậm đặc được bảo quản dài ngày trong tủ lạnh thường hoặc tủ lạnh
sâu.
Hiện nay một số hãng sản xuất hóa chất đã có bán loại môi trường chuẩn bò
sẵn thành gói gồm đủ các thành phần thích hợp với một mục đích nhất đònh, ví dụ,
môi trường MS để nhân giống một số cây cảnh. Khi dùng chỉ cần hòa một gói vào
một lít nước cất, đun sôi là có ngay một môi trường làm việc.
Sau đây chúng ta sẽ làm quen với công việc pha chế môi trường qua ví dụ với
các môi trường MS và White.

KNO
3
82,5
95,0
20 C
H
3
PO
3
KH
2
PO
4
KI
Na
2
MoO
4
.2H
2
O
1,24
34,00
0,166
0,050
2
O
74,00
4,46
1,72
0,005

5
E CaCl
2
.2H
2
O 88,00 5
F Thiamine.HCl 0,02 5
G NAA 0,10 1
H Kinetin 0,40 0,5
Sau đó, để pha 1 lít môi trường làm việc cần thực hiện các động tác sau:
- Cho khoảng 800ml nước cất vào một cái bình có dunh tích 2 lít;
- Dùng pipet cho 28ml dung dòch mẹ A, 20ml dung dòch mẹ B, 5ml mỗi
dung dòch mẹ C, D,E, F, 1 ml dung dòch mẹ G và 0,5ml dung dòch mẹ H.
Trong khi trộn lẫn các dung dòch cần luôn luôn khuấy đều;
- Thêm 100 ml mezo-inozitol;
- Đo pH và dùng HCl 0,1N và NaOH 0,1N để chỉnh pH đến 6,5;
- Thêm 20g saccharose và khuấy cho tan
- Thêm 6-8g aga-aga;
- Đun sôi cho đến khi tan hết thạch, vừa đun vừa khuấy đều để aga-aga
không bò cháy;
- Chia hỗn hợp dung dòch này vào các ống nghiệm hay bình nón khi còn
đang nóng trong khi aga-aga chưa đông lại.
Bảng 2. Thành phần các dung dòch mẹ White.

PO
4
.2H
2
O
3,0
2,0
0,80
0,65
0,19 100
B MgSO
4
.7 H
2
O 75,0 10
MnSO
4
.4H
2
O 0,50
GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
Công nghệ Sinh học thực vật
-
23 -

C
ZnSO

(SO
4
)
3
0.25 10
E Thiamine.HCl
Pyridoxine.HCl
0,01
0,01
10

8. Vấn đề lựa chọn môi trường.
Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật có hàng trăm loại môi trường khác nhau.
Tuy nhiên có thể chia chúng thành 3 nhóm:
- Môi trường nghèo dinh dưỡng: điển hình là môi trường Knop, môi trường
Knudson C;
- Môi trường trung bình: điển hình là môi trường môi trường White; môi
trườnng B
5
của Gamborg;
- Môi trường giàu dinh dưỡng: điển hình là môi trường Murashige – Skoog
(môi trường MS).
Vì vậy khi bắt đầu nghiên cứu nuôi cấy mô một đối tượng nào đó mà chưa có
tài liệu tham khảo về môi trường để nuôi cấy đối tượng đó thì trước hết cần tiến
hành thí nghiệm thăm dò một trong 3 loại môi trường nói trên để tìm môi trường
thích hợp. Sau khi đã tìm thấy môi trường thích hợp chúng ta có thể từng bước cải
tiến để tự tìm cho mình môi trường thích hợp nhất cho mục đích, đối tượng và nội
dung nghiên cứu. Ví dụ, chúng ta có thể thử tìm tỷ lệ NO
3
-

với khả năng tái sinh chồi, rễ hay toàn cây rất khác nhau. Vì vậy, khi bắt đầu một
chương trình sử dụng phương pháp nuôi cấy mô để chọn giống và nhân giống một
cây nào đó, trước hết cần thí nghiệm tìm hiểu phản ứng của các bộ phận khác nhau
của cây trong nuôi cấy ở các nồng độ phytohormone khác nhau. Ví dụ, đối với cây
mía, kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả cho thấy lá non đang còn bọc trong bẹ
và đòng hoa non là mô cấy thích hợp hơn cả cho việc tạo mô sẹo và tái sinh cây
hoàn chỉnh.
Sau khi cấy, mô cấy cần được đặt trong các điều kiện nhiệt độ và ánh sáng ổn
đònh phù hợp với nhu cầu của từng loại mô cấy nhờ các máy điều hoà tự động.
IV. PHÒNG THÍ NGHIỆM NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT.
Nuôi cấy mô thực vật không cần nhiều máy móc đắc tiền Có thể bắt đầu
hoạt động nuôi cấy với các thiết bò tối thiểu gồm nồi hấp vô trùng và buồng cấy vô
trùng hoặc tủ cấy bằng gỗ có trang bò đèn tử ngoại.
1.Cách bố trí phòng thí nghiệm nuôi cấy mô.
Một phòng thí nghiệm nuôi cấy mô hiện đại được thiết kế phù hợp với tính
chất dây chuyền của công việc như mô tả trong hình 1.
1 2 3 4 5
6
10 9 8 7
Hình 1. Sơ đồ một phòng thí nghiệm nuôi cấy mô hoàn chỉnh:
1: Phòng rửa và sản xuất nước cất; 2: phòng sấy, hấp, kho thủy tinh sạch;
3: phòng chuẩn bò môi trường; 4: phòng chuẩn bò mẫu; 5: phòng cấy vô
trùng; 6: phòng ảnh; 7: phòng kính hiển vi; 8,9: phòng sáng; 10: phòng
sinh hóa.
Bên cạnh phòng thí nghiệm phải có hệ thống nhà kính, vườm ươm để trồng
cây lấy nguyên liệu nuôi cấy và cây tái sinh trong ống nghiệm.
2. Các thiết bò chủ yếu của phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật.