KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH
MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TỦA PROTEIN
I. Phương pháp tủa bằng các tác nhân gây tủa là dung môi hữu cơ (Ethanol 80%,
Aceton)
Độ hòa tan của protein trong dung dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố, một trong số đó
là hằng số điện môi của dung dịch. Nhìn chung, những phân tử dung môi có hằng số điện
môi lớn (như nước, dimethylsulphoxid) có thể ổn định tương tác giữa chúng với các phân tử
protein và tạo điều kiện thuận lợi cho sự hòa tan của protein trong dung dịch. Ngược lại, các
dung môi với hằng số điện môi nhỏ (aceton, ethanol…) ngăn cản sự phân tán của các phân
tử protein trong môi trường. Do đó, độ hòa tan của những phân tử protein giảm và xảy ra kết
tủa do sự làm giảm hằng số điện môi hiện hữu của môi trường. Điều này có được bằng cách
thêm một dung môi hòa tan trong nước như aceton vào dung dịch chứa protein. Sự tủa bằng
aceton hoặc ethanol 80% có nhiều thuận lợi hơn vì nó tương đối rẻ, có sẵn ở dạng tinh khiết
với ít chất tạp nhiễm gây độc hay ức chế đối với enzym, do nhiệt độ bay hơi của dung môi
thấp nên dễ tách bỏ dung môi khỏi chế phẩm enzym bằng phương pháp sấy nhẹ bằng quạt
gió.
II. Phương pháp tủa bằng muối
Người ta có thể dùng muối (NH
4
)
2
SO
4
, NaCl… để tủa protein vì các muối này vừa
làm trung hòa điện (do các ion tác động tương hỗ với các nhóm tích điện trái dấu), vừa loại
bỏ lớp vỏ hydrat của phân tử protein. Các protein khác nhau có thể bị kết tủa với nồng độ
muối khác nhau, vì vậy có thể dùng muối để tách riêng các protein ra khỏi hỗn hợp của
chúng.
Phần thí nghiệm
1. Dụng cụ và hóa chất
Dụng cụ

Nghiền ép, xay nhuyễn
Lọc
Ly tâm 6000 v/p, trong
15 phút
Dịch trong
Chồi ngọn, vỏ quả
Bã
Bã
Tủa cồn 4
o
C / 2 giờ
Ly tâm 6000 v/p, trong
20 phút
Thu tủa
Sấy khô
Bromelin
Bỏ
dịch
trong
cồn 80%, làm
lạnh 4
0
C
KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH
Quy trình thu nhận enzym Bromelin bằng muối (NH
4
)
2
SO
4

bão hòa
KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH
3. Kết quả: Hãy tính hàm lượng protein có trong 100g nguyên liệu ban đầu.
III. Phương pháp tủa protein bằng điểm đẳng điện.
1. Nguyên tắc
Giá trị pH mà tại đó phân tử protein trung hòa điện gọi là điểm đẳng điện của protein
(pI), ở giá trị pH = pI phân tử protein trung hòa điện sẽ không chuyển dịch trong điện
trường, phân tử protein sẽ kém bền nhất dễ kết tủa.
Người ta lợi dụng tính chất này để kết tủa protein.
2. Dụng cụ và hóa chất
Dụng cụ
Máy khuất từ
Máy ly tâm
Cân phân tích
Bercher 100ml, 250ml
Pipet 5ml, 10ml
Hóa chất
Dung dịch NaOH 20%
Dung dịch HCl 10%
Ete
Etanol
Giấy pH
3. Thực hành
Tách chiết protein cá:
Cân 100g cá đã xay nhuyễn trong một bercher rồi cho 4 lần nước. (1 cá : 4 nước, g/l)
Khuấy đều rồi cho từ từ NaOH 20% vừa cho vừa khuấy cho đến pH 11 thử bằng giấy pH,
khuấy khoảng 45 phút rồi ly tâm, giữ lại dịch chiết trong một bercher 250ml, bã còn lại thêm
nước chiết tiếp lần hai rồi ly tâm lấy dịch bỏ bã. Dịch thu được cho vào bercher 250ml gộp
chung với phần dịch chiết bên trên.
Cho từ từ HCl 100% vào dịch chiết vừa cho vừa khuấy đến pH thích hợp là 6 sẽ thấy

Dung dịch hóa chất Ống nghiệm
1 2 3 4 5 6
Dung dịch Tyrosin chuẩn (ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
Lượng Tyrosin tương ứng (µM) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
Dung dịch HCl 0,2N (ml) 5,0 4,8 4,6 4,4 4,2 4,0
Dung dịch NaOH 0,5N (ml) 10 10 10 10 10 10
Thuốc thử Folin (ml) 3 3 3 3 3 3
Lắc mạnh, sau 10 phút đo OD ở bước sóng 660nm
Ống số 1 là ống thử không (TK), các ống còn lại là ống thí nghiệm (TN). Vẽ đường
chuẩn Tyrosin tương quan giữa lượng Tyrosin (µM) và ΔOD (ΔOD = OD
TN
– OD
TK
).
5
KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH
4. Phương pháp tiến hành
Lấy 6 ống nghiệm sạch, khô, tiến hành làm 3 ống thử thật, 3 ống thử không
Các bước chuẩn bị mẫu enzym để đo hoạt tính
Dung dịch hóa chất
Ống nghiệm
Thử thật Thử không
Dung dịch Casein 1% (ml) 5 5
Dung dịch TCA 5% (ml) 0 10
Dung dịch enzym mẫu (ml) 1 1
Lắc đều và giữ ở 35,5
o
C trong 20 phút
Dung dịch TCA 5% (ml) 10 0
Để yên 30 phút, lọc lấy dịch trong

µM Tyrosin: lượng µM Tyrosin trong v (ml) suy ra từ đường chuẩn
KHẢO SÁT HOẠT TÍNH INVERTASE
6
KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH
I. Nguyên tắc:
Invertase là một enzym thủy giải saccharose thành glucose và fructose.
Trong bài này ta dùng enzym invertase trích trong men bia để cho thủy giải
saccharose, từ đó tính được hoạt tính của enzym này.
II. Dụng cụ và thuốc thử
Dụng cụ
Becher 100ml – 250ml
Erlen 250ml
Ống nghiệm 50ml
Pipet 5ml – 10ml
Buret 25ml
Phễu lọc
Hóa chất
dung dịch saccharose 10%
dung dịch NaOH N/10
Dung dịch Iod N/10
Dung dịch H
2
SO
4
N
Hồ tinh bột 1%
Dung dịch Na
2
S
2

S
2
O
3
N/20 (dùng hồ tinh bột cho thêm vào lúc cuối phản ứng để làm chất chỉ thị màu).
IV. Kết quả
7
KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH
Hoạt tính của invertase được biểu thị bằng số mol saccharose thủy giải bởi lượng
enzym invertase có trong 1g men bia trong 1 phút ở nhiệt độ phòng thí nghiệm.
Gọi V
1
và V
2
là số ml Na
2
S
2
O
3
N/20 dùng định phân ống số 1 và số 2.
Có nhận xét gì về kết quả định phân trong ống số 3?
Hoạt tính invertase được tính theo công thức sau:
phútgmol
mtba
BAVV
//
**22010
**)(
3

Cồn 96
0

Dung dịch tinh bột 1% trong đệm pH 5,6
Dung dịch HCl 1N
Dung dịch NaCl 3%
Thuốc thử Lugol
III. Thực hành
1. Ly trích Amylase
Amylase là 1 tạp chất protein không tan trong rượu mạnh. Cân 10g lúa nảy mầm cho
vào cối với 30ml nước cất, giã nát lúa dưới nước. Để yên trong 15 phút, đem lọc. Lấy tất cả
nước qua lọc, thêm 4 lần thể tích cồn 96
0
. Khuấy đều, ta sẽ thấy amylase và các protein khác
tủa dưới dạng nùi lớn.
Để lắng, ly tâm lấy tủa. Hòa tan tủa trong 20ml nước cất. Ta có dung dịch amylase
khá tinh sạch. Đặc biệt dung dịch này không có chất đường khử (thử 1ml dung dịch thuốc
thử Fehling, đun cách thủy 3 phút, ta không có kết tủa đỏ xuất hiện)
2. Khảo sát hoạt tính α-amylase
9
KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH
Lấy sáu ống nghiệm chia thành 2 lô, mỗi lô 3 ống nghiệm gồm thử thật và thử không
để lấy trung bình.
Tiến hành thí nghiệm theo bảng sau:
Dung dịch hóa chất
Ống nghiệm
Ống thử thật (t) Ống thử không (o)
Nước cất (ml) 0 1
Dịch chiết α - amylase 1 0
Dung dịch đệm (ml) 1 1

L: hệ số pha loãng mẫu enzym.
XÁC ĐỊNH ĐẠM TỔNG SỐ THEO PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL
I. Vô cơ hóa:
10
KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH
• Nguyên tắc: Sự vô cơ hóa chất đạm là sự biến đổi tất cả các chất đạm dù nằm dưới dạng
nào (hữu cơ, vô cơ, protein) thành hợp chất vô cơ là amonium sulfat (NH
4
)
2
SO
4
bằng
cách đun sôi với H
2
SO
4
đậm đặc và chất xúc tác.
• Thực hành: hút chính xác 1ml nếu là nguyên liệu lỏng hay cân chính xác 1g nếu là
nguyên liệu khô đã nghiền nhuyễn để cho đồng nhất, cho vào một bình cổ cao có dung
tích từ 60ml đến 100ml (bình kjeldahl). Thêm vào đó 5ml H
2
SO
4
đậm đặc và khoảng
0,5g chất xúc tác. Đun sôi hỗn hợp trong tủ hút khí độc từ 2 đến 3 giờ cho đến khi dung
dịch trở thành trong suốt và có màu xanh do trời nhạt. Để nguội và pha loãng thành
100ml với nước.
Chất xúc tác dùng ở đây là hỗn hợp đã xay nhuyễn của: K
2

4
H
2
SO
4
đậm đặc
Xúc tác, t
0
(NH
4
)
2
SO
4
+ 2NaOH 2NH
4
OH + Na
2
SO
4
KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH
- Bình xịt nước cất
- Becher 250 ml, 100ml, 50ml
- Erlen 250ml
- Bình định mức 100ml, 50ml
- Buret 25ml
- Pipet 1ml, 5ml, 10ml, 20ml.
- ống đong 25ml

Hóa chất:

SO
4
N/100. Lấy erlen ra và định phân
H
2
SO
4
thừa bằng dung dịch NaOH có chuẩn độ là x N/100 cho đều. Khi dung dịch đổi màu
(từ màu hồng nhạt sang màu da cam): thực hiện 3 sự thử thuật và 3 sự thử không để lấy trị số
trung bình.
• Cách tính:
Nếu nguyên liệu là chất lỏng, thông thường lượng đạm được tính bằng số gam đạm trong
1 lít, nếu nguyên liệu là chất rắn, thì trước hết phải tính độ ẩm, sau đó lượng đạm đươc tính
bằng phần trăm (số gam đạm có trong 100g nguyên chất liệu) theo độ khô tuyệt đối)
Giả sử nguyên liệu là chất lỏng. Lấy 1ml nguyên liệu đem vô cơ hóa và pha loãng thành
100ml, sau đó hút 10ml đem chưng cất bằng máy Parnas – Wargner.
Gọi V
0
là thể tích dung dịch NaOH x N/100 (trị số trung bình của 3 lần thử không).
Gọi V
t
thể tích dụng dịch NaOH x N/100 (trị số trung bình của 3 lần thử thật).
Vậy:
t
VVV −=∆
0
12
KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH
là lượng NaOH tương đương với lượng amoniac phóng thích bởi 10ml dung dịch vô cơ hóa
đã pha loãng.

∆=
∆
Số gam đạm có trong 1 lít nguyên liệu:
lítxgVlítgxV / 4,1/1000.10 14
4
∆=∆
−
MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH CHẤT ĐƯỜNG
13
KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH
I. Phản ứng màu tổng quát (phản ứng Molish)
Tất cả các chất đường đều cho màu tím đối với dung dịch α – Naphthol trong H
2
SO
4
đậm đặc. Đổ trong ống nghiệm 1 ml dung dịch đường 1% và 2 giọt dung dịch α – Naphthol
15% trong rượu. Lắc đều, nghiêng ống và cho H
2
SO
4
đậm đặc từ từ theo thành ống. Có sự
tạo thành một lớp màu tím hiện ra ở mặt ngăn cách 2 chất lỏng.
II. Phân biệt giữa monosaccharid và disaccharid (phản ứng Barfoed)
Khả năng khử của những monosaccharid có thể lớn hơn nhiều khả năng khử của
disaccharid cho nên, thay vì sử khử ở môi trường base, sự khử ở môi trường acid yếu có thể
giúp ta phân biệt được monosaccharid và disaccharid.
Trong ống nghiệm đựng 2ml thuốc thử Barfoed, ta thêm vào 1ml dung dịch đường
muốn khảo sát.
Ta thực hiện đồng thời ba sự thử chứng với các dung dịch glucose 1% , lactose 1% và
nước cất. Đun sôi cách thủy trong 5 phút. Làm lạnh, quan sát ống có trầm hiện đỏ. Đun tiếp

2. Hóa chất
Dầu thực vật hay mỡ động vật
Dung môi hữu cơ: alcohol, acetone, bezen
3. Cách làm
Cho vào ba ống nghiệm:
Ống 1: 2ml alcohol
Ống 2: 2ml acetone
Ống 3: 2ml benzen
Nhỏ thêm vào mỗi ống 1 giọt dầu hoặc mỡ, lắc nhẹ, quan sát sự hòa tan của lipid
trong ba dung môi hữu cơ.
II. Khảo sát một số chỉ số đặc trưng của chất béo
1. Chỉ số acid:
Là số mg KOH dùng trung hòa các acid béo tự do trong 1g chất béo.
Nguyên tắc
Dùng KOH 0,1N trong rượu để trung hòa các chất béo tự do trong 1g nguyên liệu,
chất chỉ thị màu là phenolphtalein.
Dụng cụ và hóa chất
Dụng cụ
Erlen 100ml
Pipet 10ml
Becher 100ml
Bình tia
Hóa chất
KOH 0,1N
Ether ethylic
Phenolphtalein 0,5% trong alcohol
Dầu để khảo sát
Cách làm
15
KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH

Chỉ số savon = 28.05 * (V
0
– V
1
)/m
28.05 là số mg KOH tương ứng 1ml HCl 0.5N
V
0
là thể tích dung dịch HCl 0.5N của bình đối chứng
V
1
là thể tích dung dịch HCl 0.5N của bình thí nghiệm
m là trọng lượng chất béo đã cân (gram)
ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN C
16
KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH
(Phương pháp định lượng vitamin C bằng IOD)
1. Nguyên tắc
Để xác định nhanh chóng hàm lượng vitamin C trong nguyên liệu khi có chất màu
người ta thường dùng phương pháp chuẩn độ iod. Tất cả acid ascorbic bị oxi hóa bởi iod.
Phần iod thừa sẽ cho màu xanh với dung dịch tinh bột. Điều đó nói lên là phản ứng đã kết
thúc.
2. Dụng cụ và hóa chất
Dụng cụ
- Erlen 100ml
- Pipet 5ml, 10ml
- Buret
- Bình định mức 50ml
- Becher
- Cối chày sứ

4. Kết quả
17
KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH
Số mg vitamin C trong 1g mẫu vật được tính như sau:
Nv
VTa
x
.
100 00088,0
% =
a: thể tích (ml) dung dịch iod 0,01N dùng khi chuẩn độ.
T: hệ số hiệu chỉnh dung dịch iod 0,01N với dung dịch Na
2
S
2
O
3
0,01N
V: thể tích chung của dịch chiết (50ml)
v: thể tích dịch chiết lấy để chuẩn độ (20ml)
N: trọng lượng mẫu phân tích
0,00088: số gram vitamin C tương ứng với 1ml dung dịch iod 0,01N
18