Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THUỶ SẢN
LÊ MỸ PHƯƠNG
PHÂN LẬP VI KHUẨN Bacillus subtilis
TRONG AO NUÔI TÔM SÚ (Penaeus monodon)
TẠI SÓC TRĂNG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN



LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
PHẠM THỊ TUYẾT NGÂN
Cần Thơ, 2008
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
DANH MỤC HÌNH

Hình Trang
Hình 4.1: Khuẩn lạc sau 24 giờ ở độ pha loãng 10
-2
21
Hình 4.2: Khuẩn lạc thuần trên TSA sau 24 giờ 21
Hình 4.3: Vi khuẩn gram dương 22


2.1 Ứng dụng của vi sinh vật đối với đời sống con người 3
2.2 Các vấn đề phát sinh trong ao nuôi tôm thâm canh 4
2.3 Probiotic trong thuỷ sản 6
2.3.1 Khái niệm và ứng dụng của probiotic 6
2.3.2 Cơ chế tác dụng của probiotic 7
2.4 Đặc điểm sinh học của Bacillus subtilis 8
2.4.1 Vị trí phân loại 8
2.4.2 Quá trình hình thành bào tử 9
2.4.3 Vai trò của Bacillus subtilis 10
2.5 Các đặc tính sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn 11
2.6 Phương pháp PCR 12
Phần III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện 14

3.2 Môi trường, hóa chất và thiết bị 14

3.3 Phương pháp thu và phân tích mẫu 15
3.3.1 Thu mẫu 15
3.3.2 Phân tích mẫu 15
3.4 Phân lập vi khuẩn 15
3.5 Xác định các chỉ tiêu hình thái, sinh lý, sinh hoá vi khuẩn 15

3.6 Phương pháp PCR 17
3.6.1 Ly trích ADN 17
3.6.2 Qui trình chạy PCR 18
3.6.3 Chạy điện di và đọc kết quả 18
PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19
4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn 19

đặc tính sinh hoá vi khuẩn phân lập để định danh vi khuẩn B. subtilis trong ao
nuôi tôm sú thâm canh. Thu mẫu bùn tại 4 ao nuôi tôm thâm canh tại Sóc
Trăng với nhịp thu 2 tuần/lần và phân tích tại phòng thí nghiệm. Kết quả phân
lập được 39 chủng vi khuẩn thuộc giống Bacillus, trong đó có 8 chủng cho kết
quả các đặc tính sinh hoá gần giống với Bacillus subtilis. Tám chủng vi khuẩn
này sẽ được trữ lại và tiếp tục định danh theo phương pháp PCR. Tuy nhiên do
thời gian có hạn đề tài chỉ thực hiện đến việc xác định chủng vi khuẩn chuẩn
B. subtilis S19 (bằng phương pháp PCR) sử dụng làm đối chứng dương.

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
1

Phần I: GIỚI THIỆU

Trong những năm gần đây, thuỷ sản đã trở thành ngành kinh tế mũi nhọn của
nước ta. Sản lượng thuỷ sản không chỉ đáp ứng được nhu cầu thực phẩm trong
nước mà còn xuất khẩu sang thị trường các nước như Nhật, Nga, Mỹ, Úc,…
Năm 2007, xuất khẩu thuỷ sản nước ta đạt 3,7 tỷ USD, vượt 2,78% so với kế
hoạch, tăng 10,45% so với năm 2006 (Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông
Thôn, 2007). Trong đó tôm Sú (Penaeus monodon) là một trong những sản
phẩm xuất khẩu chủ lực, chiếm 39,9% tổng sản phẩm thuỷ sản xuất khẩu. Tuy
nhiên để tăng năng xuất và lợi nhuận, người nuôi đã không ngừng tăng mật độ
giống thả, sử dụng thuốc, hoá chất trong phòng và trị bệnh chưa hợp lý, thiếu
sót trong quản lý môi trường… Vấn đề trên không chỉ làm xáo trộn sự cân bằng
sinh học của hệ sinh thái trong ao nuôi mà còn tạo điều kiện cho dịch bệnh
bùng phát ảnh hưởng đến sức khoẻ vật nuôi, đồng thời gây ô nhiễm môi
trường.
Trước tình hình trên, xu hướng chung của thế giới là “phòng bệnh hơn chữa
bệnh”. Hiện nay nhiều mô hình nuôi bền vững được đề xuất và áp dụng như
nuôi tôm thân thiện môi trường, nuôi sinh thái, nuôi an toàn sinh học… Gần

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
3

Phần II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Ứng dụng vi sinh vật đối với đời sống con người
Việc nghiên cứu vi sinh vật phát triển rất nhanh đã dẫn đến việc hình thành các
lĩnh vực khác nhau: vi khuẩn học (Bacteriology); nấm học (Mycology); tảo học
(Phicology); virus học (Virology),…Chúng được ứng dụng nhiều trong các lĩnh


subtilis như: Biosubtilic, Bidisubtilic, Antibio, Biofidin, Biobaby,…(Nguyễn
Khắc Thái Sơn, 2007).
Vi sinh vật còn có vai trò trong việc tạo ra nguồn năng lượng cho con người
như lên men nguyên liệu rẻ tiền như rỉ đường để sản xuất cồn chạy xe thay
xăng. Nhờ quá trình lên men yếm khí của vi sinh vật đã chuyển hoá vật chất
hữu cơ tạo Biogas làm khí đốt.
Đặc biệt, vi sinh vật có vai trò rất lớn trong việc bảo vệ môi trường, tham gia
tích cực trong việc xử lý phế thải nông nghiệp, công nghiệp, rác thải sinh hoạt,
nước thải,…làm sạch môi trường.
Trong tự nhiên, nhờ hoạt động sống của vi sinh vật nên một lượng lớn các chất
hữu cơ bị khoáng hoá. Các hợp chất hữu cơ được chuyển hoá qua hàng loạt các
phản ứng hoá học, xúc tác mỗi phản ứng là một enzyme (Nguyễn Xuân Thành,
2005). Trong chuyển hoá các hợp chất trong tự nhiên có nhiều loại vi sinh vật
cùng tham gia, sản phẩm chuyển hoá của vi sinh vật này lại là cơ chất cho vi
sinh vật khác, hoạt động của chúng diễn ra phức tạp và có mối liên hệ chặt chẽ
với nhau. Sự phân huỷ các chất hữu cơ diễn ra với tốc độ khác nhau phụ thuộc
vào thành phần, số lượng và điều kiện môi trường. Thành phần chủ yếu của
hợp chất hữu cơ trong nước và bùn ao nuôi tôm bao gồm: protein, lipit,
hydratcacbon, kitin. Các vi khuẩn có khả năng phân huỷ protein thường gặp
thuộc chi Pseudomonas, Clostridium, Bacillus. Chúng phân giải protein thành
polypeptit, axit amin, NH
3
. Nhóm vi sinh vật phân huỷ các hydratcacbon bao
gồm chi Bacillus, Aspegilus streptomyces, Streptocococus, Clostrium,… Trong
quá trình này các hydratcacbon (tinh bột, xenluloza, pectin, hemixenluloza,…)
được phân giải thành những phần nhỏ hơn, tạo ra các sản phẩm của quá trình
trao đổi chất như các khí (NH
3
, CO

2
S,
CH
4
…( Từ đó làm phát
sinh bệnh và gây thiệt hại lớn. Theo Moriarty (1998), bệnh do vi khuẩn gây ra
xảy ra ở tất cả các giai đọan phát triển của tôm và sự bùng phát bệnh gây thiệt
hại kinh tế lớn. Theo trình bày của Ngân hàng thế giới thiệt hại kinh tế do bệnh
gây ra trong nuôi thủy sản khoảng 3 tỷ đô la (Ludin, 1996; trích dẫn bởi
Vaseeharan et al., 2002).
Để kiểm soát và quản lý mầm bệnh người nuôi đã sử dụng thuốc, hóa chất bừa
bãi dẫn đến hiện tượng chọn lọc và phát tán các gen kháng thuốc giữa các
chủng vi khuẩn nhờ plasmid hoặc thể thực khuẩn (Moriarty, 1999). Điều này
có nguy cơ gây nguy hiểm cho người và các động vật khác. Ngoài việc sử dụng
kháng sinh, người nuôi còn sử dụng các chất tẩy uế để giết mầm bệnh. Các chất
như formaline, chlorin có thể ngăn cản sự bùng phát bệnh, nhưng lâu dài sẽ tạo
ra các vấn đề môi trường tiềm tàng (Rosenthal, 1980). Việc sử dụng chlorine
kích thích sự phát triển nhiều gen kháng thuốc kháng sinh ở vi khuẩn (Murray
et al. 1981; trích dẫn bởi Moriarty, 1999).
Bên cạnh các vấn đề về môi trường, thức ăn cho tôm cũng là yếu tố quan trọng.
Do thức ăn chiếm chi phí đắt nhất trong nuôi thủy sản, số lượng và chất lượng
thức ăn là nhân tố đầu tiên ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của tôm (Olmos,
2005). Thức ăn cho tôm chứa hàm lượng protein cao (trên 35%), do đó khi thức
ăn không được tôm tiêu thụ hoặc các chất thải bài tiết từ tôm sẽ phóng thích
lượng lớn các hợp chất chứa nitơ vào môi trường nước gây các vấn đề về môi
trường và dịch bệnh.
Để giải quyết vấn đề chất thải lắng tụ trong ao, vấn đề kiểm soát bệnh sao cho
có hiệu quả và an toàn, đồng thời giảm chi phí về thức ăn cho tôm; các nhà
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
6

chủ (Salminen, 1999). Chúng chịu được ảnh hưởng của nhiệt độ, nồng độ muối
khác nhau (Fuller, 1987). Ngày nay, Probiotic đã được sử dụng trong thức ăn
nhân tạo (Robertson et al., 2000), thức ăn tươi sống như Artemia, Rotifers
(Gatesoupe, 1991) và sử dụng trong môi trường nước (Austin, 1995).
Hơn 50 năm qua, các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu về probiotics để cải
tiến các thực phẩm có lợi, góp phần tăng sức khoẻ cho con người và động vật
(Rengpipat et al., 1998). Các loài vi sinh vật thường được dùng để tạo
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
7

Probiotics bao gồm Lactobacillus spp., Saccharomyces sp., Bacillus spp. (trích
dẫn bởi Irianto and Austin, 2003).
Austin (1995), nghiên cứu sử dụng probiotic (Vibrio alginolyticus) trên cá Hồi,
kết quả cho thấy probiotic có thể làm giảm bệnh gây ra bởi Aeromonas
salmonicids, Vibrio anguillarium và Vibrio ordalii. Một nghiên cứu khác khi
ngâm tôm Sú (PL30) 10 ngày với Vibrio harveyi có sử dụng probiotic (Bacillus
S11) cho thấy sự tăng trưởng và tỉ lệ sống của tôm là 100% cao hơn nhiều so
với nhóm đối chứng (không sử dụng probiotic) 26% (Rengpipat et al., 1998).
Bên cạnh đó tác giả còn cho rằng Bacillus S11 có thể thay thế cả Vibrio spp.,
một số loài vi khuẩn khác trong ruột tôm và trong môi trường nước. Theo
Hasting and Nealson (1981) Bacillus S11 có thể tạo ra một số chất kháng
khuẩn hoặc một vài sản phẩm chưa được biết có thể tiêu diệt V. harveyi D331.
Theo Moriarty (1998), mầm bệnh do vi khuẩn Vibrio spp. đã được xem là một
trong những nguyên nhân làm tôm chết hàng loạt. Tuy nhiên, các ly trích tế bào
tự do Bacillus subtilis BT23 cho thấy có hiệu quả cao trong việc chống lại sự
tăng trưởng của Vibrio harveyi phân lập từ tôm sú bệnh đen mang, tỉ lệ chết của
tôm giảm 90% (Vaseeharan and Ramasamy, 2002). Nghiên cứu này cho thấy
mầm bệnh Vibrio bị kiểm soát bởi Bacillus trong điều kiện phòng thí nghiệm
và ngoài thực tế. Theo một nghiên cứu khác của Vaseeharan et al. (2004),
probiotic giúp kháng được vi khuẩn Listonella anguillarum xuất hiện trong

nhập của các vi sinh vật có hại và tăng khả năng phòng ngừa một số bệnh
đường ruột. Đồng thời còn có tác dụng hỗ trợ tiêu hóa, hấp thu thức ăn, giúp
vật nuôi khỏe mạnh và phát triển nhanh
(
Theo Olmos (2005), trong thức ăn nuôi tôm, probiotic có thể giúp phân hủy tất
cả các thành phần protein vì các enzyme được tạo ra bởi vi khuẩn có thể bổ
sung các hoạt tính của protease giúp tăng khả năng tiêu hóa thức ăn cho tôm.
Hơn nữa, enzyme từ probiotic chịu được khoảng pH rộng hơn enzyme của tôm,
do đó quá trình tiêu hóa có thể diễn ra trong thời gian dài giúp tôm hấp thu chất
dinh dưỡng tốt hơn.
2.4 Đặc điểm sinh học Bacillus subtilis
2.4.1 Vị trí phân loại
Giới Bacteria
Ngành Firmicutes
Lớp Bacilli
Bộ Bacillates
Họ Bacillaceae
Giống Bacillus
Loài Bacillus subtilis
(
Năm 1872, Ferdinand Cohn (cùng thời Robert Koch), đã phát hiện và đặt tên là
B. subtilis. B. subtilis là trực khuẩn Gram dương, di động, có kích thước 2-3x
0,7-0,8 µm, nội bào tử ở trung tâm có kích thước 1,5-1,8 x 0,8 µm. Ở điều kiện
100
o
C, bào tử B. subtilis chịu được 180 phút, có tính ổn định cao với nhiệt độ
thấp và sự khô cạn, tác động của hóa chất, tia bức xạ. B. subtilis hình thành bào
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
9


các bản sao riêng biệt. Cuối cùng chỉ có một bản sao nhiễm sắc thể nằm trong
bào tử, sau đó thành hai tế bào, các phần còn lại bị hủy đi và bào tử được phóng
thích. Theo Nguyễn Lân Dũng (1983), phần lớn vi khuẩn trong tế bào chỉ có
thể có một bào tử. Khi gặp điều kiện thuận lợi bào tử sẽ nảy mầm và mỗi bào
tử chỉ cho ra một tế bào dinh dưỡng.
Trong tất cả các loài, không phải tất cả các tế bào đều hình thành bào tử dù ở
trong bất kỳ điều kiện nào. Chưa có thông tin giải thích tại sao một vài tế bào
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
10

trong môi trường nuôi hình thành bào tử và một số khác thì không. Tuy nhiên
có sự chấp nhận rằng sự hình thành bào tử bắt đầu sau pha tăng trưởng nhanh
và trong suốt pha tĩnh (Banwart, 2000).
2.4.3 Vai trò của Bacillus subtilis
B. subtilis tạo protease kiềm (subtilisin) với lượng lớn, có đặc tính bền vững,
hoạt động tốt với nhiệt độ và pH cao nên chúng được ứng dụng ở nhiều ngành
công nghiệp khác nhau. Subtibilin chủ yếu được sử dụng trong các ngành công
nghiệp các chất tẩy rửa và cả trong y dược học. Ngoài ra subtibilin còn sử dụng
trong xử lý phim X quang đã qua sử dụng để nhằm thu hồi bạc, làm nước mắm
cá, làm thức ăn gia xúc, xử lý chất thải từ động vật giáp xác, xử lý rác thải
trong lò mổ gia cầm.
Trong những năm gần đây tất cả các protease bổ sung vào chất tẩy dùng trên
thị trường đều là protease được sản suất từ các chủng Bacillus, mà chủ yếu là
B. subtilis. Năm 1971, đánh dấu bước mở đầu quan trọng cho những nghiên
cứu về protease kiềm ở Bacillus. Horikoshi là người đầu tiên công bố thu nhận
và Markland tìm hiểu cấu trúc cơ bản, tính chất lý hóa của protease kiềm từ
Bacillus ( Năm 1972, người
ta đã nghiên cứu và đưa vào sản xuất trên quy mô lớn các protease kiềm ở một
vài loài Bacillus. Đến thập kỷ 80, những nghiên cứu về protease kiềm của
Bacillus tiếp tục mở rộng và đã tạo ra hàng loạt các sản phẩm trên thị trường

con người, bao gồm sự hoạt hóa ít nhất 3 kháng thể chuyên biệt (IgM, IgG,
IgA) chống lại hiệu quả nhiều virus, nấm, mầm bệnh vi khuẩn gây hại thường
xâm nhập và gây nhiễm vào cơ thể người
( Theo một nghiên cứu
của Gong et al. (2006), chủng B. subtilis PY-1 phân lập từ bó mạch của cây
bông có khả năng kháng mạnh nhiều mầm bệnh nấm trên cây trồng đặc biệt là
nấm Fusarium oxysporum gây ra thiệt hại kinh tế lớn trong nhiều mùa vụ. Theo
tác giả, các chất kháng sinh tạo ra bởi chủng B. subtilis PY-1 ổn định ở các điều
kiện pH trung tính và kiềm, không nhạy với nhiệt độ cao. Gần đây các nhà
khoa học sử dụng các vi sinh vật này như là một phương pháp bảo vệ sinh học,
kiểm soát mầm bệnh và thay thế các thuốc diệt sinh vật (methyl bromide) có
nguy cơ gây ra thiệt hại môi trường nghiêm trọng
(
2.5 Các đặc tính sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn
Tổng các phản ứng xảy ra trong tế bào có liên quan đến quá trình trao đổi chất
và các phản ứng hóa học riêng được tạo nên bằng sự xúc tác bởi các phản ứng
protein gọi là enzyme. Phần lớn các enzyme trong tế bào có chức năng phân cắt
các nguyên liệu thức ăn (sự dị hóa) và tổng hợp thành các thành phần của tế
bào (sự đồng hóa). Tuy nhiên vi khuẩn không thể thực hiện sự thực bào do
thành tế bào cứng. Vì thế chúng bài tiết ra các ngoại enzyme có chức năng bên
ngoài tế bào để phân cắt các đại phân tử như: protein, tinh bột,… thành các
amino acid, monosaccharide,… Sau đó được vận chuyển vào tế bào. Điển hình
của các ngoại enzyme của vi khuẩn là: protease, amylase, lypase,…
Mục đích đầu tiên của quá trình trao đổi chất là tạo ra năng lượng cần cho sự
tổng hợp sinh học và tăng trưởng của tế bào. Vi khuẩn có thể đạt được các nhu
cầu năng lượng bằng hai phương thức trao đổi chất khác nhau đó là quá trình
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
12

hô hấp và quá trình lên men. Trong quá trình hô hấp các phân tử hữu cơ được

thành O
2
vô hại.
2H
2
O
2
2H
2
O + O
2
↑
Các vi khuẩn kỵ khí bặt buộc thiếu enzyme này vì thế chúng không thể xử lý
với H
2
O
2
tạo ra trong môi trường hiếu khí. Sự hiện diện của catalase là một
cách để phân biệt các vi khuẩn này với vi khuẩn hiếu khí.
2.6 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
Thế giới khoa học cần có một hệ thống phân loại dựa trên các dấu hiệu có ở các
sinh vật sống. Trong những năm 1980, nhà khoa học Carl Woese đưa ra một đề
nghị mới đó là đi thẳng đến trung tâm của nguồn gốc tính đa dạng. Ông đề nghị
trình tự deoxyribonucleic acid (ADN) của vài gen thông thường có thể được sử
dụng để xác định mối quan hệ của các sinh vật khác nhau. Điển hình Woese
nhặt một gen mã hóa 1 phân tử RNA tìm thấy trong ribosome (rRNA).
Ribosome (phức hợp protein-RNA) tìm thấy trong tất cả prokaryote và
eukaryote. Mặc dù có sự khác nhau về kích cỡ giữa ribosome của prokaryote và
eukaryote, nhưng trình tự của phân tử rRNA thì rất giống nhau (đó là vùng có
tính bảo tồn cao). Điều này cho phép các trình tự nucleic được đánh dấu và so

Một chu kỳ thông thường của PCR gồm 3 bước (biến tính ADN, gắn mồi, và
kéo dài ADN). Phần lớn các phản ứng PCR, giai đoạn biến tính được chuẩn
hóa tại nhiệt độ 94
o
C

trong 1,5 phút, vì ở nhiệt độ này đảm bảo sự biến tính
hoàn toàn của các phân tử ADN (Marlowe et al., 2005). Giai đoạn gắn mồi xảy
ra tại nhiệt độ thấp hơn (thông thường khoảng 50-70
o
C

trong 1 phút), mức
nhiệt độ ở giai đoạn này phụ thuộc vào nhiệt độ nóng chảy của mồi sử dụng.
Bước cuối của PCR là kéo dài mạch ADN, giai đoạn kéo dài thường xảy ra
trong 1 phút tại 72
o
C. Thành phần quan trọng của giai đoạn này là enzyme Taq
polymerase thu từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus. Enzyme này phù
hợp với PCR do nó ổn định với nhiệt độ (có thể trên 98
o
C) và có thể tái sử
dụng cho nhiều chu kỳ (Marlowe et al., 2005).


HPO
4
, KH
2
PO
4
, các loại đường (glucose, arabinose,
xylose, sucrose, mannitol), urê,…
Hóa chất trong phương pháp PCR
Hóa chất ly trích ADN : Na
3
PO
4
, Tris-HCl (10mM, pH 9), Lysozyme,
CH
3
COONH
4
, Chloroform, TE (pH 8, Tris 10 mM, EDTA 1 mM),
isopropanol,…
Hóa chất trong phản ứng PCR: nước cất 2 lần, MgCl
2
(1,5 mM), buffer
Hóa chất trong điện di: dung dịch TAE 1X, agarose, ethidium bromide
Thiết bị và dụng cụ
Nồi hấp tiệt trùng, tủ ấm, tủ sấy, tủ lạnh, vortex, cân phân tích, kính hiển vi,
micropipet, đèn cồn, que cấy, que tán, đĩa petri, ống nghiệm,…
Máy ly tâm, máy chu kỳ nhiệt, bộ điện di, bàn đọc UV, máy chụp gel.
Chọn các khuẩn lạc đặc trưng mọc trên các đĩa môi trường sau khi ủ, cấy sang
đĩa môi trường TSA (thêm 1,5% NaCl) ủ ở 30ºC trong 24 giờ. Tiếp tục tách
ròng cho đến khi thu được dòng thuần. Các dòng vi khuẩn phân lập được nuôi
tăng sinh trong môi trưuờng TSB (thêm 1,5% NaCl). Sau đó trữ vi khuẩn với
glycerol 25% trong các ống cryobead và giữ ở -80
o
C trước khi phân tích tiếp.
3.5 Xác định các chỉ tiêu hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn
Các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa để định danh các dòng vi khuẩn phân lập (Bảng
3.1) được chọn theo Andretta et al. (2004).
Xác định tính di động, sản sinh catalase, sự khử nitrate, khả năng sử dụng
citrate, sản sinh indole, sử dụng urê, thủy phân gelatin, thủy phân tinh bột, phản
ứng Voges-proskauer (VP), các phản ứng lên men đường (glucose, xylose,
arabinose, sucrose, mannitol), phát triền tại các nồng độ muối khác nhau, phát
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
triển tại các nhiệt độ khác nhau được thực hiện theo Tài liệu hướng dẫn thực
tập giáo trình chuyên môn bệnh học thủy sản (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007).
Phương pháp nhuộm Gram, methyl red thực hiện theo Sharmin and Rahman
(2007). Nhuộm bào tử, phát triển ở các pH khác nhau theo Brown (2005). Thủy
phân Casein theo Elnasser et al. (2007). Cách tiến hành các chỉ tiêu trên được
mô tả chi tiết ở phần phụ lục.

Bảng 3.1: Các chỉ tiêu sinh lý, sinh hoá để định danh Bacillus subtilis

Các chỉ tiêu sinh lý, sinh hoá Kết quả
Gram
Hình dạng bào tử
Vị trí bào tử
Hình dạng tế bào chứa bào tử
Di động

Que, không sưng phồng
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
-
+
-
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
-
_


11. Ly tâm 15 phút, 7000 vòng. Lấy dung dịch ở phần trên sang tuýp khác.
12. Thêm 0.8 thể tích isopropanol (100%) so với phần nước đã lấy, lắc đều.
13. Giữ ở nhiệt độ -20
o
C (qua đêm).
14. Ly tâm 25 phút, 12.000 vòng.
15. Đổ bỏ phân nước, giữ lại phần ADN kết tủa.
16. Để khô ở nhiệt độ phòng trong 15 phút.
17. Hòa tan ADN kết tủa bằng TE-buffer (10 mM Tris-HCl, EDTA 1 mM, pH
8,0) 250-500 µl tùy theo khối lượng ADN.
18. Giữ ở -20
o
C (để làm các bước tiếp theo).
Qui trình làm sạch:
19. Thêm 800 µl Clean up vào tuýp có chứa ADN. Cho hỗn hợp vào bộ làm
sạch.
20. Thêm tiếp 2ml isopropanol (80%).
21. Hút sạch nước, lấy phần ống có chứa ADN gắn vào tuýp.
22. Ly tâm 10.000 vòng trong 2 phút, lấy ống để sang tuýp khác.
23. Cho vào 25µl TE-buffer (10 mM Tris-HCl, EDTA 1 mM, pH 8,0) (TE
trước khi sử dụng được giữ ấm ở 65-70
o
C).
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

3.6.2 Quy trình chạy PCR (theo Andretta et al., 2004)
Hỗn hợp của 1 mẫu chạy PCR bao gồm:
- Nước cất 2 lần: 11,15 µl
- Buffer: 2 µl
- MgCl

máy đọc gel. Trọng lượng phân tử để xác định ADN Bacillus subtilis S19 là
1500bp.

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứuPhần IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn
Qua 4 đợt thu mẫu (tổng số mẫu thu là 16 mẫu), phân lập được 53 chủng vi
khuẩn. Trong đó có 39 chủng thuộc giống Bacillus do thuộc nhóm Gram
dương, hình thành nội bào tử và catalase dương tính (Collins and Lyne’s,
1986). Còn lại 14 chủng vi khuẩn Gram âm và Gram dương (hình cầu) sẽ bị
loại bỏ. Tên của các chủng phân lập được đặt theo mã số a-b-c-d và liệt kê
trong Bảng 4.1.
Với:
a : Đợt thu mẫu (I: đợt 1, II: đợt 2, III: đợt 3, IV: đợt 4)
b: Ao thu mẫu (A1: ao 1, A2: ao 2, A3: ao 3, A4: ao 4)
c: Số thứ tự của chủng phân lập (từ 1 đến 39)
d: Loại mẫu (S: mẫu bùn)
Bảng 4.1 Danh mục các chủng vi khuẩn phân lập được
STT Tên chủng STT Tên chủng STT Tên chủng
1 I-A1-1-S 14 II-A4-14-S 27 III-A4-27-S
2 I-A1-2-S 15 III-A1-15-S 28 III-A4-28-S
3 I-A3-3-S 16 III-A1-16-S 29 III-A4-29-S
4 II-A2-4-S 17 III-A1-17-S 30 III-A4-30-S
5 II-A2-5-S 18 III-A2-18-S 31 IV-A1-31-S
6 II-A2-6-S 19 III-A2-19-S 32 IV-A1-32-S
7 II-A3-7-S 20 III-A2-20-S 33 IV-A1-33-S
8 II-A3-8-S 21 III-A2-21-S 34 IV-A2-34-S