BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
***
000
***
NGUYỄN QUỲNH NAM
PHÂN LẬP VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TRONG PHÂN
HEO VÀ THỬ ĐỐI KHÁNG VỚI E. COLI GÂY BỆNH TIÊU
CHẢY TRÊN HEO Luận văn kỹ sƣ
Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện:
TS.Nguyễn Ngọc Hải Nguyễn Quỳnh Nam
Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 8/2006
MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING
NONG LAM UNIVERSITY, HCMC
DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY
***000***
ISOLATE BACILLUS SUBTILIS IN PIG FECES AND
TEST THE ANTAGONISM WITH E. COLI K88
Graduation thesis
Major: Biotechnology
hộ và giúp đỡ để em thực hiện tốt khóa luận này.
Các bạn lớp công nghệ sinh học 28 đã luôn ở bên mình, động viên và nhiệt tình
giúp đỡ mình trong suốt thời gian mình học tập cũng nhƣ trong lúc mình thực hiện
khóa luận này.
Tp Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng 07 năm 2006
Nguyễn Quỳnh Nam
iv
TÓM TẮT
Enterotoxigenic E. coli là nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy phổ biến trên heo
con và heo đang cai sữa, trong khi những hạn chế của kháng sinh trong việc khống chế
E. coli gây bệnh tiêu chảy, thì các chế phẩm sinh học từ Bacillus subtilis chƣa thực sự
hiệu quả trong phòng và trị bệnh. Trong đề tài này chúng tôi phân lập các chủng
Bacillus subtilis trong phân heo có khả năng ức chế mạnh sự phát triển của E. coli gây
bệnh tiêu chảy trên heo.
Chúng tôi phân lập đƣợc 22 chủng Bacillus subtilis trong phân heo, có 13
chủng tạo đƣợc vòng kháng khuẩn với E. coli, có thể sự tổng hợp của kháng sinh ức
chế sự phát triển của E. coli đƣợc kích thích bởi một nồng độ E. coli đủ lớn, kháng
sinh đƣợc Bacillus subtilis tổng hợp từ giai đoạn rất sớm của sự phát triển ( 0 giờ - 12
giờ ) khi có sự hiện diện của E. coli. Có 5 chủng cho thấy sự ức chế mạnh mẽ E. coli
và nhạy cảm với các loại kháng sinh đƣợc thử nghiệm trừ colistin v
MỤC LỤC
2.4.1. Đặc điểm phân loại ........................................................................ 11
2.4.2. Đặc điểm hình thái ........................................................................ 11
2.5. Kháng sinh đƣợc tổng hợp bởi Bacillus subtilis ...................................... 13
2.5.1. Giới thiệu ........................................................................................ 13
2.5.2. Peptide antibiotic đƣợc tổng hợp bằng ribosome ........................... 14
2.5.2.1. Subtilin ............................................................................... 14
2.5.2.2. Subtilosin ............................................................................ 15
2.5.2.3. Sublancin ............................................................................ 16
2.5.2.4. TasA ................................................................................... 16
2.5.3. Peptide antibiotic không đƣợc tổng hợp bằng ribosome ............... 18
2.5.3.1. Surfactin ............................................................................. 17
2.5.3.2. Fengycin ............................................................................. 19
2.5.3.3. Mycosubtilin ....................................................................... 29
2.5.3.4. Bacilysocin ......................................................................... 20
3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................... 22
vi
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài .................................................... 22
3.1.1. Thời gian ....................................................................................... 22
3.1.2. Địa điểm ........................................................................................ 22
3.2. Vật liệu thí nghiệm ................................................................................... 22
3.2.1. Mẫu thí nghiệm ............................................................................. 22
3.2.2. Hóa chất ......................................................................................... 22
3.2.3. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ...................................................... 22
3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ......................................................................... 22
3.3.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis trong phân heo ...................... 22
3.3.2. Các phản ứng thử sinh hóa ............................................................ 23
3.3.3. Thử đối kháng với E. coli trên môi trƣờng TSA ........................... 24
3.3.4. Đánh giá sự đối kháng với E. coli trên môi trƣờng TSB .............. 24
3.3.5. Thử kháng sinh đồ ......................................................................... 24 vii
DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT
ETEC : Enterotoxigenic E. coli
EAEC : Enteroaggregative E. coli
LT : Heat-labile toxin
ST : Heat-stable toxin
CT : Cholera enterotoxin
EAST : Enteroaggreative stable-toxin
ENS : Enteric nervous system
GC-C : Guanylate cyclase C
ABC : ATP-binding cassette
............................................................... 27
Hình 4.3 : Kết quả kháng sinh đồ ........................................................................ 31
Hình 4.4 : Hình phân giải tinh bột của Bacillus subtilis
Biểu đồ 4.1: Biểu đồ biểu hiện sự thay đổi E. coli qua các thời điểm ................. 28
ix
DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 4.1 : Kết quả độ lớn vòng kháng khuẩn của các chủng Bacillus subtilis phân lập
Trƣớc tình hình đó đƣợc sự phân công của khoa công nghệ sinh học trƣờng Đại
học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, với sự hƣớng dẫn của Ts. Nguyễn Ngọc Hải
chúng tôi thực hiện đề tài “ Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis trong phân heo và
thử đối kháng với E. coil gây bệnh tiêu chảy trên heo ”.
2 1.2 MỤC ĐÍCH , YÊU CẦU
1.2.1 Mục đích
Phân lập đƣợc chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng đối kháng mạnh
với chủng vi khuẩn E. coli gây bệnh tiêu chảy trên heo, nhằm phục vụ cho việc ứng
dụng vào trong chăn nuôi.
1.2.2 Yêu cầu
Phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis trong phân heo ở các hộ nuôi heo
ở Đồng Nai và Bình Dƣơng.
Chọn lọc đƣợc dòng Bacillus subtilis kháng khuẩn đối với E. coli.
Đánh giá sự đối kháng giữa chủng Bacillus subtilis với E. coli gây bệnh trong
môi trƣờng TSB.
Đánh giá sự an toàn về mặt sinh học của chủng vi khuẩn phân lập đƣợc bằng
phƣơng pháp kháng sinh đồ.
Đánh giá khả năng phân giải tinh bột trên môi trƣờng thạch tinh bột 1%.
thống tiêu hóa, nhiễm trùng đƣờng tiết niệu, rối loạn hệ thần kinh trung ƣơng, sau khi
cố định trên tế bào thành ruột các chủng E. coli này tiết ra độc tố làm tổn thƣơng các tế
bào thành ruột, tất cả những gene qui định độc tính của vi khuẩn đƣợc mã hóa trên
cùng plasmid hoặc đƣợc tập trung trong một vùng nhiễm sắc thể của bộ gene vi khuẩn,
có một vài tính trạng riêng biệt đƣợc mã hóa trên transposome hay phage.
Trong 6 loại trên thì enterotoxigenic E. coli là loại phổ biến nhất gây bệnh trên
heo.
2.2 Enterotoxigenic E. coli (ETEC)
Enterotoxigenic E. coli là những chủng vi khuẩn có khả năng tiết ra ít nhất là
một thành viên trong trong 2 loại độc tố enterotoxin là: LT (heat-labile toxin), ST
(heat-stable toxin). ETEC có khả năng gây ra hiện tƣợng tiêu chảy trên heo, trên ngƣời
và các loài thú khác. Mỗi chủng ETEC có thể mang gene mã hóa cho 1 loại độc tố
4
hoặc có thể cả 2 loại độc tố khác nhau, những gene này có khả năng cùng đƣợc biểu
hiện và gây bệnh cho tế bào vật chủ, trong đó thì LT có ảnh hƣởng rất lớn đối với độc
tính của vi khuẩn (11).
2.2.1 Độc tố nhạy nhiệt LT
LT là độc tố nhạy cảm với nhiệt có cấu trúc và cơ chế gây độc gần giống với
cholera enterotoxin (CT) đƣợc sản xuất từ Vibrio cholerae, gene mã hóa cho cấu trúc
của độc tố LT nằm trên plasmid có nguồn gốc từ vi khuẩn Vibrio cholerae. LT có hai
nhóm chính là LT-1 và LT-2, hai độc tố này không cho đáp ứng miễn dịch chéo với
nhau. LT-1 đƣợc biểu hiện trong các chủng E. coli gây bệnh trên ngƣời và động vật
còn LT-2 chỉ đƣợc tìm thấy trên những chủng E. coli phân lập đƣợc trên động vật và
một số rất ít chủng phân lập đƣợc trên ngƣời tuy nhiên không có bằng chứng cho thấy
LT-2 có khả năng gây bệnh do đó cơ chế tác động của độc tố LT tập chung chủ yếu
vào LT-1.
2.2.1.1 Cấu tạo của LT-1
LT1-1 trọng lƣợng phân tử là 86 kDa đƣợc cấu tạo từ 1 tiểu đơn vị A có trọng
lƣợng phân tử 28 kDa và 5 tiểu đơn vị B có trọng lƣợng phân tử 11,5 kDa, 5 tiểu đơn
nhƣ đề cập ở trên thì không có bằng chứng cho thấy LT-2 gây độc cho tế bào của
ngƣời và động vật.
2.2.2 Độc tố kháng nhiệt (heat-stable toxin ST)
ST là protein nhỏ chỉ đƣợc cấu tạo từ một đơn vị, nhƣng trong cấu trúc chứa
nhiều amino acid cystein, do đó trong cấu trúc protein chứa nhiều cầu nối disulfic tính
chất này dẫn đến khả năng kháng nhiệt của độc tố. Độc tố này có hai loại, có cấu trúc
và cơ chế hoạt động khác biệt nhau là STa và STb, gene mã hóa cho hai loại độc tố
này đƣợc đƣợc qui định trên plasmid, một số gene đƣợc phát hiện nằm trên transposon.
2.2.2.1 Độc tố kháng nhiệt STa
STa có trọng lƣợng phân tử là 2kDa, có hai dạng khác nhau là STap trong cấu
trúc chứa 18 amino acid có khả năng gây độc cho heo và ngƣời, dạng còn lại là STah
cấu tạo từ 19 amino acid chỉ gây độc cho ngƣời. Ban đầu STa đƣợc tổng hợp dƣới
dạng pre-protoxin chứa 72 amino acid, sau đó đƣợc phân cắt thành peptide có 52 acid
amine, dạng peptide này đƣợc chuyển vào vùng periplasm sau đó hình thành cầu nối
disulfic nhờ enzyme DsbA đƣợc mã hóa trên genome của vi khuẩn, sau đó dạng
protoxin sẽ đƣợc cắt thành dạng toxin hoàn chỉnh và đƣợc khuếch tán qua vách tế bào.
Ngoài ETEC ra thì STa còn đƣợc tổng hợp bởi một vài chủng vi khuẩn gram (–) khác
nhƣ Yersinia enterocolitica và V. cholerae non-O1, bên cạnh đó STa có 50% protein
tƣơng đồng với độc tố EAST1 ST của EAEC.
6
Receptor của STa là enzyme xuyên màng đƣợc gọi là guanylate cyclase C
(GC-C), GC-C nằm trên phần đầu màng của tế bào biểu mô ruột, protein này là
receptor của hormone guanylin của thú, hocmone này có 15 amino acid trong đó có 4
cystein đóng vai trò giúp cân bằng trạng thái bình thƣờng của ruột, cơ chế tác động của
receptor này với guanylin dựa vào cơ chế ligand-receptor, đó là cơ chế receptor gắn
với ligand tiếp nhận các thông tin ngoại bào từ đó thúc đẩy sự hoạt động của các
enzyme nội bào. Tƣơng tự nhƣ vậy sau khi liên kết với receeptor STa thúc đẩy họat
tính guanylate cyclase của enzyme này làm gia tăng hàm lƣợng cGMP nội bào, cGMP
hoạt hóa protein kinase G hoạt động của enzyme này làm tăng hoạt động của kênh
mỗi fimbriae có một receptor chuyên biệt trên thành biểu mô ruột các receptor này có
cấu tạo là IMTGP (intestinal mucin-type glycoprotein). Fimbriae xuất hiện trên cả vi
khuẩn E. coli gây bệnh cũng nhƣ không gây bệnh nó giúp cho vi khuẩn chống việc bị
loại thải bởi nhu động ruột, một vi khuẩn có thể có nhiều loại fimbriae khác nhau,
fimbriae nằm trên capsule cho nên kháng nguyên bề mặt là kháng nguyên K tuy nhiên
nó đƣợc cấu tạo là protein nên còn đƣợc gọi là kháng nguyên F, các fimbriae khác
nhau đƣợc phân biệt bằng hình thái và khả năng ngƣng kết hồng cầu.
Mỗi loại ETEC gây bệnh cho những loài khác nhau thƣờng biểu hiện một loại
fimbriae riêng biệt.
8
Bảng bên dƣới thể hiện một vài kháng nguyên và đối tƣợng gây bệnh của nó
(13).
Kháng nguyên Đối tƣợng gây bệnh Serogroup O
K88 Heo con
08, 045, 0138, 0141,
0147, 0149, 0157
987P Heo con 09, 020, 0141
K99 Cừu, bê 08, 09, 020, 0101
K99 Heo con 064, 0101
K41 Bê 09, 0101
CFA\1 Ngƣời 015, 025, 063, 078
CFA\2 Ngƣời 06,08
Khả năng tổng hợp enterotoxin và hiện diện của fimbriae có sự liên hệ với nhau (13).
nhiều yếu tố khác nhau. Fuller (1992) đã đề nghị cơ chế tác động của probiotic có thể
là (2)
Cạnh tranh thụ thể kết dính trên biểu mô tế bào tiêu hóa.
Cạnh tranh chất dinh dƣỡng giới hạn với vi sinh vật gây bệnh, tuy nhiên cơ
chế này chƣa đƣợc chứng minh một cách rõ ràng trong điều kiện in vivo.
Sản xuất chất kháng khuẩn nhƣ các acid hữu cơ, bacteriocin.v.v.
Kích thích hệ miễn dịch.
Probiotic có giá trị khoa học, tuy nhiên lợi ích của nó chỉ thể hiện khi thú có sức
khỏe kém, stress hoặc xáo trộn hệ vi sinh vật đƣờng ruột (2).
2.3.3 Ứng dụng của chế phẩm sinh học
Probiotic đƣợc sử dụng để phòng và chữa trị một phổ lớn các bệnh đƣờng ruột
nhƣ là bệnh tiêu chảy do sự xâm nhiễm của vi sinh vật gây bệnh, virus, sử dụng kháng
sinh và dinh dƣỡng, bệnh viêm ruột, hội chứng dễ bị kích thích của ruột, ngoài ra còn
đƣợc sử dụng để bổ sung các enzyme tiêu hóa mà cơ thể tiết ra không đủ nhƣ sucrase,
maltase (9). Các vi sinh vật có lợi trong probiotic sẽ ức chế vi sinh vật gây bệnh để hệ
thống vi sinh vật trong đƣờng ruột có thể phục hồi.
Probiotic giúp cho thú tăng trọng nhanh hơn trên một đơn vị thức ăn do vi sinh
vật trong probiotic tiết ra các enzyme tiêu hóa nhƣ amylase, protease làm tăng hệ số
chuyển hóa thức ăn của thú.
2.3.4 Yêu cầu của chế phẩm sinh học
An toàn là điều tiên quyết đối với một chế phẩm sinh học, các chủng vi sinh vật
đƣợc sử dụng làm chế phẩm sinh học phải không mang gene gây độc cho ngƣời và
động vật.
Chủng vi sinh vật đƣợc chọn để làm chế phẩm phải chống chịu đƣợc điều kiện
pH thấp của dạ dày, muối mật, enzyme tiêu hóa đồng thời phải có khả năng bám và tạo
khuẩn lạc trên thành ruột (9).
10
Chế phẩm sinh học phải cho đƣợc hiệu quả cao trong phòng, trị bệnh hoặc trong
cải thiện dinh dƣỡng của thú. Vi sinh vật đƣợc sử dụng làm chế phẩm sinh học phải có
11
dạng đơn bào, hiện diện nhiều trong đất, nƣớc, trong đƣờng tiêu hóa của ngƣời và
động vật.
Hình dạng của Bacillus subtilis trên môi trƣờng TSA là khuẩn lạc khô, có rìa
răng cƣa, có đƣờng kính 3-5mm nằm sát trên bề mặt thạch.
Hình 2.1: Khuẩn lạc Bacillus subtilis trên môi trƣờng TSA và nhuộm gram của
Bacillus subtilis
Các phản ứng sinh hóa đƣợc sử dụng để để khẳng định Bacillus subtilis.
Phản ứng lecithinase (-), khả năng phân giải casein (+), khả năng phân giải tinh
bột (+), phân giải gelatin (+), phản ứng khử nitrate (+), phản ứng khử citrate (+), VP
(+), indol (-), lên men không sinh hơi các loại đƣờng nhƣ: glucose, mannitol,
saccharose, xylose, arabinose.
Bacillus subtilis là vi khuẩn gram (+) đƣợc tập trung nghiên cứu nhiều nhất cho
đến thời điểm hiện nay, bộ genome của loài này đã đƣợc giải mã toàn bộ, bộ gene có 4
Mbp (23), trọng lƣợng của bộ genome khoảng 2,4×10
9
đến 2,6×10
9
dalton đặc biệt
trong genome của Bacillus subtilis có nhiều gene qui định cho khả năng kháng lại
kháng sinh nhƣ gene kháng thiostrepton, streptomycin, erythromycin, spectinomycin,
chloramphenicol, penicilin.v.v…(8) tuy nhiên bất kể là gene kháng kháng sinh đƣợc
qui định trên genome hay trên plasmid nó cũng là nguồn cung cấp gene kháng kháng
sinh cho các vi sinh vật đƣờng ruột.
Ở điều kiện kỵ khí Bacillus subtilis sử dụng nitrate nhƣ chất nhận điện tử cuối
cùng, nếu trong môi trƣờng thiếu nitrate thì Bacillus subtilis phát triển bằng cách lên
men.
Trong môi trƣờng nuôi cấy Bacillus subtilis tiết ra exopolysacharide để gắn kết
chlorotetain, mycobacillin, rhizocticins, bacillaene, difficidin và các lipopeptide có
tính kháng khuẩn là các antibiotic không đƣợc tổng hợp bằng ribosome (20).
Bacteriocin đƣợc tổng hợp dƣới dạng tiền peptide có chứa một đoạn tín hiệu
giúp cho enzyme tiết nhận biết, đồng thời ức chế sự tác động của bacteriocin trong tế
bào, dạng tiền peptide sau đó đƣợc chuyển lên màng nguyên sinh chất tại đây xãy ra
13
các phản ứng biến đổi sau dịch mã, cắt đoạn peptide tín hiệu ở đầu C của tiền chất để
thành dạng hoàn chỉnh, sau đó đƣợc tiết ra ngoài bằng phức hợp bơm protein ABC
(ATP-binding cassette transport complex) gắn với màng tế bào chất (16).
Các peptide antibiotic không tổng hợp bằng ribosome thì đƣợc tổng hợp bằng
các enzyme có cấu trúc phân tử lớn, bên trong cấu trúc đƣợc chia thành nhiều module
khác nhau mỗi module chịu trách nhiệm hoạt hóa một amino acid chuyên biệt, các
module đƣợc sắp xếp theo trình tự tƣơng ứng với trình tự các amino acid trên chuỗi
peptide (16).
Lipopeptide có tính kháng khuẩn đƣợc chia thành 3 họ khác nhau là surfactin,
fengycin và iturin, lipopeptide đƣợc cấu tạo bằng vòng peptide có cấu tạo từ 7 (họ
surfactin và iturin) hoặc 10 (họ fengycin) amino acid liên kết với nhóm –COOH và
nhóm hydroxy (họ surfactin và fengycin) hoặc nhóm amino (họ iturin) tại vị trí β của
acid béo. Chiều dài của chuỗi acid béo thay đổi từ C
13
đến C
16
đối với lipopeptide
thuộc họ surfactin, từ C
14
đến C
17
đối với họ iturin và từ C
14
Quá trình điều hòa, tổng hợp, biến đổi sau dịch mã và phân tiết của
subtilin.
Sự tổng hợp subtilin đƣợc điều hòa bằng hệ thống điều hòa hai thành phần là
protein SpaK và SpaR. SpaK là protein xuyên màng với đầu cuối N nằm trong tế bào
chất. Khi nồng độ vi sinh vật trong môi trƣờng nuôi cấy tăng cao hoặc có sự hiện diện
của subtilin hay các antibiotic có cấu trúc tƣơng tự (nisin) trong môi trƣờng nuôi cấy.
SpaK tiếp nhận tín hiệu rồi truyền vào bên trong bằng cách tự phosphoryl hóa His ở vị
trí 247 ở đầu N sau đó sẽ chuyển gốc phosphat đến amino acid Asp ở vị trí 51 của
protein SpaR , SpaR sẽ gắn vào promoter thúc đẩy sự biểu hiện của gene spaB, spaT,
spaC, spaS đồng thời cũng điều hòa sự tổng hợp của spaI, spaF, spaE, spaG. Ngoài ra
operon của subtilin còn đƣợc điều hòa bởi yếu tố
H
(27).
Subtilin ban đẩu đƣợc tổng hợp ở dạng tiền chất có 56 amino acid, dạng tiền
chất này đƣợc SpaT chuyển lên màng tế bào chất, tại đây dạng tiền chất của subtilin
đƣợc biến đổi thành dạng subtilin hoàn chỉnh có 32 amino acid. Sau đó subtilin đƣợc
chuyển ra ngoài bằng hệ thống chuyển ABC do SpaF, SpaE, SpaG hợp thành.
Lipoprotein SpaI định vị ở bề mặt ngoài của lớp màng tế bào có tác dụng ngăn chặn sự
tác động của subtilin vừa đƣợc tiết ra lên màng tế bào chất của Bacillus subtilis (26).
2.5.2.2 Subtilosin
Subtilosin là bacteriocin có tính kháng khuẩn mạnh đối với Listeria
monocytogenes và Bacillus cereus (24), cấu trúc dạng vòng, tiền peptide có 43 amino
acid, Asn ở vị trí 9 tạo liên kết với Gly ở đầu cuối C, đoạn tín hiệu ở đầu cuối N đƣợc
cắt để tạo thành cấu trúc dạng vòng, Phe và Thr đƣợc biến đổi sau dịch mã dẫn đến sự
15
hình thành cầu nối nội phân tử để hình thành dạng antibiotic hoàn chỉnh dạng vòng có
32 amino acid (25). Cấu trúc của subtilosin đƣợc thể hiện ở Hình 2.3A (phụ lục).
Toàn bộ gene chịu trách nhiệm cho toàn bộ quá trình tổng hợp subtilosin đƣợc
Copyright: Tài liệu đại học ©